孫云暉 劉振欣 鮑文華 王一新 牛圓圓

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院,佳木斯 154003)

肺纖維化(Pulmonary fibrosis, PF)是一種慢性進行性發(fā)展的肺部疾病，臨床上收入院患者少數(shù)有職業(yè)粉塵暴露史或結(jié)締組織病病史，但大多數(shù)病因未明，臨床表現(xiàn)以胸悶氣短、呼吸困難、乏力為主，PF至今無可治愈的藥物，多數(shù)此病患者的治療效果較差，病死率高，生活質(zhì)量嚴(yán)重下降。在整個肺纖維化的發(fā)生及發(fā)展進程中各種細(xì)胞因子在炎性細(xì)胞的聚集，刺激成纖維細(xì)胞活化和增殖，促使膠質(zhì)成分的沉積等方面發(fā)揮著重要的作用[1]。IL-38屬于IL-1家族第10個新成員， 它首先是2001年由 Lin等[2]使用寡核苷酸探針雜交技術(shù)和計算機序列分析、發(fā)現(xiàn)并鑒定的細(xì)胞因子。IL-38與IL-36Ra、IL-1Ra一樣，對炎癥性免疫過程有抑制作用[3]。巨噬細(xì)胞炎性蛋白-2(Macrophage inflammatory protein-2,MIP-2)屬于趨化因子C-X-C亞家族成員之一，可由巨噬細(xì)胞等多種細(xì)胞產(chǎn)生，對中性粒細(xì)胞有很強的趨化作用[4]。目前，國內(nèi)外關(guān)于IL-38生物學(xué)功能等的研究都尚處于起步階段，關(guān)于IL-38與MIP-2在大鼠PF中的關(guān)系罕見報道，本實驗通過制備PF動物模型，觀察PF大鼠生理狀態(tài)及肺組織病理改變，檢測肺組織IL-38蛋白及MIP-2mRNA的含量，通過探討IL-38、MIP-2在大鼠PF發(fā)生、發(fā)展過程中的作用及意義，判斷其對PF臨床價值，可以為臨床提供一條新的抗纖維化治療策略。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1主要儀器及藥物 Applied Biosystems 7300Real Time PCR System(佳木斯大學(xué)實驗室提供)；注射用鹽酸博來霉素BLM(海正輝瑞制藥有限公司提供)；HE染色試劑(湖北錦源醫(yī)療科技有限公司提供)；Nikon eclipse50i顯微鏡(北京中儀光科科技發(fā)展有限公司提供)；IL-38大鼠ELISA試劑盒(上海恒遠生物科技有限公司提供)；大鼠HYP酶聯(lián)免疫分析試劑盒(上海勁馬實驗設(shè)備有限公司提供)；RNA提取試劑盒(北京艾德萊生物科技有限公司)；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒及PCR試劑盒(大連寶生物工程有限公司)。

1.1.2實驗動物 成年清潔級Wistar大鼠(雌雄各半)45只，6～8周齡，體重(180～220)g，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供[許可證號:SCXK(黑)2013-001]，按清潔級標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)于佳木斯大學(xué)動物實驗中心。在實驗動物喂養(yǎng)及實驗觀察期間，由專人管理，環(huán)境、溫度、濕度適宜。

1.2方法

1.2.1分組及模型制備 健康Wistar大鼠應(yīng)用隨機、對照原則分為3組(n=15)：生理鹽水對照組(N組)、博來霉素組(B組)和地塞米松組(D組)，其中B組和D組統(tǒng)稱為模型組(M組)。M組按照 BLM 4 mg/kg 體積氣管內(nèi)注射制備纖維化大鼠模型，N組氣管內(nèi)注射同體積的生理鹽水。地塞米松治療組：第2天開始每天腹腔注射地塞米松注射液 3 mg/kg，其余兩組腹腔注射同體積的生理鹽水作為對照。分別于第 7天、14天、28 天，每組處死大鼠5只，留取肺組織待檢測。

1.2.2肺組織標(biāo)本的采集 腹腔內(nèi)注射10%水合氯醛3.5 ml/kg；開胸，肺臟經(jīng)病理宏觀檢查后，取出兩肺，切取的右肺上葉肺組織固定于10%中性福爾馬林中，于24 h更換福爾馬林液，48 h取出，常規(guī)石蠟包埋，蘇木精-伊紅(Hematoxylin-eosin，HE)染色后光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠肺組織切片病理改變情況；切取的其余右肺組織及左肺用濾紙吸干放入Eppendorf管內(nèi)置于-80℃冰箱保存，分別用于大鼠肺組織羥脯氨酸、IL-38及MIP-2mRNA含量的檢測。

1.2.3檢測方法 ELISA檢測大鼠肺組織羥脯氨酸含量及肺組織中IL-38的表達情況，嚴(yán)格按照大鼠酶聯(lián)免疫吸附劑測定試劑盒說明書步驟。

RT-PCR法測定肺纖維化大鼠肺組織中MIP-2mRNA表達：嚴(yán)格按照RNA提取試劑盒說明書提取總RNA，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，采用熒光定量RT-PCR，嚴(yán)格按照試劑盒說明進行PCR反應(yīng)。GAPDH為內(nèi)參。MIP-2、GAPDH引物由大連寶生物技術(shù)有限公司合成及驗證。如下：MIP-2(191 bp):F:5′-TCATGAAGTTTGTCTCAACCCTG-AA-3′;R:5′-AGACAGCGAGGCACATCAGGTA-3′。GAPDH(307 bp):F:5′-CGGAGTCAACGGATTTG-GTCGTAT-3′;R:5′-AGCCTTCTCCATGGTGGTGA-AGAC-3′。用ABI Prism 7300 SDS Software測定光密度值CT，通過2-ΔΔCT計算MIP-2 mRNA的相對表達量。

2 結(jié)果

2.1大鼠的生理狀態(tài)及肺組織肉眼觀 N組大鼠口唇淡紅色，活動靈敏，飲食及睡眠可，呼吸頻率正常，體毛色澤佳，體重遞增，大鼠肺組織外觀表面光滑，為淡紅色，質(zhì)軟，邊緣銳利；B組大鼠口唇發(fā)紺，日漸萎靡，活動遲鈍，飲食及睡眠差，呼吸頻率增快，呼吸困難日漸加重，活動后更甚，有明顯的缺氧癥狀，體毛色澤暗淡，在注射博來霉素14 d左右出現(xiàn)體毛脫落，體重逐漸減輕，早期取出大鼠肺組織有充血及出血，質(zhì)硬，邊緣較鈍，28 d時出現(xiàn)大面積的體毛脫落，大鼠肺組織見散在分布的類似結(jié)節(jié)樣病灶，質(zhì)硬，邊緣鈍；D組表現(xiàn)介于N、B組之間，且D組大鼠生理狀態(tài)和肺組織外觀較B組表現(xiàn)好。

2.2PF大鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)改變 為了了解地塞米松改善BLM誘導(dǎo)的肺纖維化的作用機制，用HE染色，光鏡下(×200)選取視野觀察：各期N組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)輪廓較好，肺泡間無炎性細(xì)胞浸潤。與N組比較，B組第14天時肺泡間炎性細(xì)胞較多，肺泡間隔略增寬，第28天肺泡間隔明顯增寬、大量炎性細(xì)胞浸潤和成纖維細(xì)胞增生，大量肺泡壁斷裂，肺泡腔融合，纖維化程度最重，呈現(xiàn)肺泡炎-肺纖維化的動態(tài)病理演變過程。與B組比較，D組第28天肺組織內(nèi)炎性細(xì)胞較少、成纖維細(xì)胞增生較少、部分肺泡壁斷裂及肺泡腔融合，肺纖維化程度較輕。見圖1。

2.3IL-38蛋白的表達情況 博來霉素組7 d后大鼠肺組織中IL-38的表達明顯降低，第28天下降最明顯，與N組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，地塞米松組腹腔注射地塞米松后，大鼠肺組織中的IL-38較B組表達水平提高，但仍低于N組。與N組及單獨氣管內(nèi)給博來霉素組對比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

圖1 HE染色肺組織病理改變(×200)Fig.1 Pathological changes of lung tissue with HE staining(×200)Note: N.Normal lung tissue;B.Bleomycin group;D.Dexamethasone group.

表1 不同時間大鼠肺組織IL-38表達情況(ng/L)

Note：Compared with group N，1)P<0.05；compared with group B，2)P<0.05.

2.4HYP及MIP-2的表達情況 博來霉素組7 d后大鼠肺組織中的HYP及MIP-2的含量明顯增高，第28天達高峰，與N組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明氣管內(nèi)注入博來霉素后，大鼠肺組織產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，進而發(fā)展為肺纖維化。D組腹腔注射地塞米松后，大鼠肺組織中的HYP及MIP-2較B組下降，與單獨氣管內(nèi)給博來霉素對比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2、3及圖2。

表2 不同時間大鼠肺組織HYP表達情況(μg/L)

Note：Compared with group N，1)P<0.05；compared with group B，2)P<0.05.

表3 不同時間大鼠肺組織MIP-2表達情況

Note：Compared with group N，1)P<0.05；compared with group B，2)P<0.05.

圖2 MIP-2溶解曲線Fig.2 MIP-2 dissolution curve

3 討論

PF以肺彌散功能下降為主，為一種不可逆的肺功能受損，最終導(dǎo)致呼吸衰竭，部分患者因長期的煙霧粉塵接觸史而發(fā)病，隨著環(huán)境污染的加重，PF的發(fā)病率逐年提高[5,6]。在PF早期，受損的肺組織刺激炎性細(xì)胞的產(chǎn)生，可導(dǎo)致肺組織中巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞的浸潤[7]。

HYP表達量可以用來反映PF程度，是大鼠PF造模成功的標(biāo)志[8]。模型組氣管內(nèi)注射博來霉素后，第7天HYP的表達量明顯增加，第14天時HYP仍有較高的表達量，第28天時達高峰，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明博來霉素誘導(dǎo)大鼠PF造模成功，肺損傷程度逐漸增加。

MIP-2是肺泡巨噬細(xì)胞和氣道上皮細(xì)胞分泌的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，它的特異靶細(xì)胞為中性粒細(xì)胞，對其起重要的趨化和激活作用[9]。當(dāng)氣道上皮受到吸煙、大氣污染、細(xì)菌和病毒感染等因素刺激或損害時，巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等迅速合成并釋放多種細(xì)胞因子，包括TNF-α和MIP-2等[10]。部分動物實驗發(fā)現(xiàn)MIP-2在博來霉素致肺纖維化中的作用[11]。另外有研究發(fā)現(xiàn)IL-38可減少IL-17、IL-22和IL-8等前炎癥因子的產(chǎn)生，所以IL-38也可能作為一種抗炎細(xì)胞因子在炎癥性疾病中發(fā)揮作用[12]。

PF尚無有效控制進展及根治方案，仍為當(dāng)今研究的熱點。近年來研究者主要通過三種途徑探討不同藥物對促纖維化細(xì)胞因子的抑制作用：TGF-β/Smads、NF-κB途徑及TNF-α途徑[6]。Wanwen等[13]研究表明NF-κB的激活與多種炎性細(xì)胞因子、黏附因子、趨化因子等的基因轉(zhuǎn)錄表達密切相關(guān)，在細(xì)胞炎癥反應(yīng)及凋亡中起重要的調(diào)節(jié)作用。另有研究表明IL-38可抑制NF-κB的活性，而MIP-2的產(chǎn)生依賴于NF-κB的激活，NF-κB可調(diào)節(jié)MIP-2基因的轉(zhuǎn)錄[14-16]。

本實驗研究結(jié)果提示，單純博來霉素組大鼠肺組織中的IL-38表達明顯低于N組及D組，HYP及MIP-2明顯高于N組及D組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，表明IL-38、MIP-2的表達在肺纖維化的形成過程中占有重要地位。本實驗在博來霉素致PF模型中，腹腔內(nèi)預(yù)防性地給予地塞米松，可使大鼠PF程度下降，提示地塞米松能夠抑制MIP-2的表達，降低炎性反應(yīng)，與Haddad等[17]研究成果相一致。地塞米松組大鼠肺組織中IL-38表達量在同一時間點均高于生理鹽水組及博來霉素組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。據(jù)此推測地塞米松可通過上調(diào)IL-38及下調(diào)MIP-2改善大鼠PF，IL-38在大鼠PF中的作用可能和MIP-2有關(guān)，IL-38可能通過NF-κB通路抑制MIP-2的產(chǎn)生，但其具體作用機制仍待進一步考證。然而，有實驗研究表明IL-38不同于傳統(tǒng)意義上的抑制劑，在低濃度時發(fā)揮較強的抑制作用，隨著濃度的升高其抑制作用反而減弱[3]。猜測與實驗條件、實驗材料等的差異有關(guān)，其中具體的原因與機制還需進一步探究。

本實驗提示IL-38可能通過體內(nèi)復(fù)雜傳導(dǎo)通路抑制MIP-2的表達，而在大鼠PF發(fā)病中發(fā)揮抗炎、抗纖維化作用。在將來，通過對IL-38和MIP-2更全面的認(rèn)知，研究促進IL-38產(chǎn)生及抑制MIP-2生物活性的藥物，都可能是控制肺部感染的一個重要環(huán)節(jié)，可以為臨床醫(yī)生提供更多新的治療方法，給PF患者帶來新希望。