孫慧敏，姜中興，王衛(wèi)敏

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液科，鄭州 450000)

先天性紅細(xì)胞生成障礙性貧血(congenital dyserythropoietic anemia，CDA)是臨床上少見(jiàn)的遺傳性紅細(xì)胞疾病，其特征在于無(wú)效的紅細(xì)胞生成，成紅細(xì)胞形態(tài)學(xué)異常，溶血、紅血細(xì)胞膜蛋白和脂質(zhì)的低糖基化。這種疾病有4種類型(Ⅰ～Ⅳ)，都與紅細(xì)胞前體異常成熟和分裂有關(guān)[1]。高通量二代測(cè)序技術(shù)具有靈敏度、特異度高及重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，能夠同時(shí)篩查多種基因突變，適用于遺傳異質(zhì)性疾病的突變篩查[2]。本院應(yīng)用上述技術(shù)首次確診了1例CDAⅡ患者，現(xiàn)將病例相關(guān)資料報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 患者，女，23歲，漢族，河南籍，因“發(fā)現(xiàn)脾大、膽紅素高10月余”于2018-02-10入本院。初步考慮：溶血性貧血？既往史無(wú)特殊。未婚未育。父母均存在輕度貧血病史。查體：面色蒼黃，全身皮膚黏膜無(wú)皮疹、皮下出血、皮下結(jié)節(jié)、瘢痕，全身淺表淋巴結(jié)未觸及，心肺聽(tīng)診未見(jiàn)明顯異常。腹軟，無(wú)壓痛、反跳痛、肌緊張，肝臟肋緣下未觸及，脾臟肋緣下1.00 cm。血常規(guī)：白細(xì)胞計(jì)數(shù)4.40×109/L,紅細(xì)胞計(jì)數(shù)2.73×1012/L,血紅蛋白89.00 g/L,血小板計(jì)數(shù)101.00×109/L,平均紅細(xì)胞體積96.20 fL，平均紅細(xì)胞血紅蛋白量33.30 pg，平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度346.00 g/L，網(wǎng)織紅細(xì)胞百分?jǐn)?shù)6.38%，網(wǎng)織紅細(xì)胞絕對(duì)值174.10×109/L；總膽紅素44.39 μmol/L，間接膽紅素31.40 μmol/L；鐵蛋白125.50 ng/mL；珠蛋白生成障礙性貧血(地貧)全套基因、遺傳球基因、紅細(xì)胞滲透脆性實(shí)驗(yàn)、血紅蛋白電泳、微小病毒B19抗體、Coombs、高鐵血紅蛋白還原實(shí)驗(yàn)、CD55/CD59、冷凝集素測(cè)定均未見(jiàn)明顯異常。彩超及CT提示：脾大、膽囊多發(fā)結(jié)石。骨髓電鏡、十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)等因?qū)嶒?yàn)室技術(shù)有限未行檢測(cè)。

1.2方法

1.2.1基因組DNA提取 在征得患者及家屬的知情同意后，采集患者及家屬的乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝外周血3～5 mL，用試劑盒提取外周血DNA，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2目標(biāo)序列捕獲與高通量測(cè)序 將提取的DNA用超聲波打斷并制備DNA文庫(kù)，通過(guò)捕獲芯片對(duì)血液系統(tǒng)疾病相關(guān)基因全外顯子及其鄰近的內(nèi)含子區(qū)域的DNA進(jìn)行富集，用通用引物對(duì)捕獲的序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，最后應(yīng)用Ion Torrent PGM平臺(tái)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行高通量測(cè)序，以檢測(cè)包括遺傳球的致病基因ANKI、SPTB、SLC4A1、EPB42、SPTA1，CDA的致病基因CDAN1、C150RF41、SEC23B、KIF23、KLF1、GATA1在內(nèi)的血液系統(tǒng)疾病相關(guān)基因。

1.2.3Sanger測(cè)序 在確定申請(qǐng)人的致病基因型后，對(duì)申請(qǐng)人及其父母的外周血DNA 進(jìn)行Sanger測(cè)序。最終將檢測(cè)結(jié)果與人類基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)(Human Genetic Mutation Database ，HGMD)進(jìn)行比對(duì)。

2 結(jié) 果

2.1目標(biāo)序列捕獲及高通量測(cè)序分析 應(yīng)用目標(biāo)序列捕獲與高通量測(cè)序分析，檢測(cè)了申請(qǐng)人血液系統(tǒng)疾病相關(guān)的基因，檢測(cè)出CDAⅡ型致病基因SEC23B存在復(fù)合雜合變異，患者存在SEC23B基因 c.74C>A(p.Pro25His)和c.1588C>T(p.Arg530Trp)復(fù)合雜合變異。血涂片檢查：成熟紅細(xì)胞大小不等，色素充盈尚可，少見(jiàn)球形紅細(xì)胞，球形紅細(xì)胞計(jì)數(shù)6%。骨髓細(xì)胞學(xué)：增生極度活躍骨髓象，其中以紅系增生明顯活躍,中晚幼紅細(xì)胞比值增高，中晚幼紅細(xì)胞易見(jiàn)炭核，晚幼紅細(xì)胞易見(jiàn)雙核，可見(jiàn)啞鈴核、花核，偶見(jiàn)點(diǎn)彩，占有核紅細(xì)胞的12%。成熟紅細(xì)胞大小不等，可見(jiàn)大紅細(xì)胞、嗜多紅細(xì)胞，血紅蛋白充盈可。

2.2Sanger測(cè)序分析 應(yīng)用Sanger測(cè)序?qū)ι暾?qǐng)人SEC23B基因的突變進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果與二代測(cè)序完全一致，并在申請(qǐng)人母親中檢測(cè)出SEC23B基因c.74C>A(p.Pro25His)雜合變異，申請(qǐng)人父親中檢測(cè)出SEC23B基因 c.1588C>T(p.Arg530Trp)雜合變異。

2.3隨訪 該患者目前未出現(xiàn)嚴(yán)重的鐵過(guò)載等并發(fā)癥，現(xiàn)仍在觀察隨訪中。

3 討 論

隨著分子生物學(xué)在血液腫瘤發(fā)病機(jī)制和臨床診療研究中的不斷深入，二代測(cè)序作為新的分子生物檢測(cè)手段被廣泛地應(yīng)用于臨床，為血液病的診療提供了有效地幫助。

自2009年發(fā)現(xiàn)編碼細(xì)胞衣殼蛋白復(fù)合物Ⅱ(COPⅡ)成分的SEC23B基因?yàn)镃DAⅡ的致病基因以來(lái)[3]，人類基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)已經(jīng)發(fā)表了120個(gè)SEC23B基因變體：錯(cuò)義/無(wú)義，剪接，調(diào)節(jié)，缺失，插入[4]。本研究申請(qǐng)人骨髓及網(wǎng)織紅細(xì)胞提示增生性貧血，且存在遺傳可疑性，運(yùn)用二代測(cè)序發(fā)現(xiàn)申請(qǐng)人存在SEC23B基因c.74C>A(p.Pro25His)和c.1588C>T(p.Arg530Trp)復(fù)合雜合變異，目前國(guó)內(nèi)尚無(wú)此基因型報(bào)道，而國(guó)外有研究者在早些年已證實(shí)c.74C>A(p.Pro25His)、c.1588C>T(p.Arg530Trp)突變與CDAⅡ相關(guān)[3,5]。另外本研究并未發(fā)現(xiàn)家庭成員中存在原發(fā)性鐵超負(fù)荷的致病性HFE2基因突變。鑒于申請(qǐng)人輕度貧血，無(wú)嚴(yán)重的鐵過(guò)載，膽囊結(jié)石未活動(dòng)，暫時(shí)給予觀察。截至目前，國(guó)內(nèi)僅有4篇關(guān)于SEC23B基因突變的病例報(bào)道，其中李思路等[6]應(yīng)用高通量二代測(cè)序檢測(cè)出2月齡患兒20號(hào)染色體SEC23B基因存在2處雜合改變，c.G53A：P.R18H，G>GA雜合性改變(2號(hào)外顯子)和C.C1831T：P.R611W，C>CT雜合性改變(16號(hào)外顯子)，且證實(shí)2號(hào)外顯子突變來(lái)源于母親遺傳，而16號(hào)外顯子突變?cè)醋院筇飓@得；李棟梁等[2]運(yùn)用高通量二代測(cè)序技術(shù)得出復(fù)合雜合錯(cuò)義突變c.1727T>C(p.F576S)和c.1831C>T(p.R611W)可能是該CDAⅡ家系的分子發(fā)病機(jī)制；RU等[7]發(fā)現(xiàn)CDAⅡ家系中存在c.938G>A純合突變；WANG等[8]在1例CDAⅡ患者中檢測(cè)到SEC23B基因存在一個(gè)無(wú)義突變c.71G>A及1個(gè)錯(cuò)義突變c.74C>A。可見(jiàn)，大多數(shù)CDAⅡ患者為錯(cuò)義/無(wú)義的純合子或復(fù)合雜合子突變，且發(fā)病年齡不一，正確的診斷通常延遲到青春期或成年期。

CDAⅡ呈常染色體隱性遺傳，是CDA中最常見(jiàn)的類型。CDAⅡ患者大多呈正細(xì)胞正色素性輕度貧血，黃疸，脾大，膽囊結(jié)石和由于鐵超負(fù)荷導(dǎo)致的皮膚病，且通常隨著年齡的增長(zhǎng)貧血逐漸減輕，大多數(shù)成人患者血紅蛋白維持在90～100 g/L[7]。有研究發(fā)現(xiàn)，其血涂片檢查可見(jiàn)異形紅細(xì)胞，偶爾可見(jiàn)球形紅細(xì)胞明顯增多；光鏡下CDAⅡ雙核及多核幼紅細(xì)胞占有核紅細(xì)胞的比例常大于10%；平行于有核紅細(xì)胞膜表面的雙層膜狀結(jié)構(gòu)為其電鏡的特征性表現(xiàn)；紅細(xì)胞膜蛋白的SDS-PAGE顯示帶3較窄且遷移率較快，帶4、5也可出現(xiàn)類似變化[9]。值得注意的是，繼發(fā)血色病是CDAⅡ患者最重要的遠(yuǎn)期并發(fā)癥，嚴(yán)重者預(yù)后不良。因此準(zhǔn)確診斷CDAⅡ?qū)τ谠缙诎l(fā)現(xiàn)和治療鐵超負(fù)荷，提供適當(dāng)?shù)倪z傳咨詢，實(shí)現(xiàn)有效的治療并避免無(wú)效的治療很重要。

而與CDAⅡ相比較，CDAⅠ患者貧血癥狀重，發(fā)病年齡早[10]；骨髓形態(tài)中存在有核紅細(xì)胞核間橋及大量(高達(dá)60%)異染色質(zhì)的海綿狀結(jié)構(gòu)；CDAⅠ型患者多伴有先天性異常，包括身材矮小，椎體變平，皮膚色素沉著和肢體末端異常斑塊等[11]；CDAN1為CDAⅠ型的主要致病基因，通過(guò)編碼codanin-1蛋白，影響著紅系成熟；AHMED等[12]指出約20%CDAⅠ型患者未發(fā)現(xiàn)任何基因異常；而B(niǎo)ABBS等[13]運(yùn)用全基因組測(cè)序發(fā)現(xiàn)CDAⅠ患者的1個(gè)新的基因突變：C150RF41基因的c．533T>A純合突變(導(dǎo)致p.L17Q錯(cuò)義突變)及c．281A>G純合突變(導(dǎo)致p.Y94C突變)。因此，除CDAN1、C150RF41外，CDAⅠ的致病基因譜仍有待探索。CDAⅢ型患者貧血多不明顯；巨大的多個(gè)細(xì)胞核為其紅系特征性的骨髓形態(tài)表現(xiàn)，有核紅細(xì)胞常顯示出細(xì)胞核破裂，細(xì)胞核膜的異常和大的自體吞噬泡等結(jié)構(gòu)變化；部分患者可出現(xiàn)視網(wǎng)膜血管紋樣改變、單克隆丙種球蛋白病及骨髓瘤；KIF23為CDAⅢ型的靶基因，通過(guò)編碼有絲分裂驅(qū)動(dòng)蛋白樣蛋白(MKLP)1，參與紡錘體的形成，維持中間體的穩(wěn)定[14]。CDAⅣ型患者呈酸化血清溶血試驗(yàn)陰性的遺傳性成紅細(xì)胞多核病;部分患者存在血象異常，主要表現(xiàn)為粒細(xì)胞及血小板的減少。此外，IOLASCON等[15]研究報(bào)道了與CDA表型相關(guān)的新的致病基因KLF1和GATA1。

綜上所述，CDA因臨床表現(xiàn)異質(zhì)性大，臨床醫(yī)師對(duì)疾病的認(rèn)知能力不同，而導(dǎo)致臨床診療相對(duì)困難，本文意在強(qiáng)調(diào)對(duì)于一些復(fù)雜、罕見(jiàn)的遺傳性疾病，及早地進(jìn)行基因檢測(cè)，可減少漏診、誤診，早期實(shí)現(xiàn)有效的治療。