陸 琴， 周躍華， 唐海飛， 王智文， 張 婷

(1. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬同仁醫(yī)院， 上海 200336；2. 上海市計(jì)劃生育科學(xué)研究所， 國(guó)家人口和計(jì)劃生育委員會(huì)計(jì)劃生育藥具重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 上海生殖健康藥具工程技術(shù)研究中心， 上海 200032；3. 上海應(yīng)用技術(shù)大學(xué)生物工程系，上海 201418）

生殖發(fā)育毒性是指外源物質(zhì)在動(dòng)物繁殖周期的任何一個(gè)階段中所產(chǎn)生的毒副作用，既包括外源物質(zhì)對(duì)親代生殖功能的影響，也包括對(duì)子代發(fā)育過(guò)程的有害影響。我國(guó)列入各類商品(藥品、食品、化學(xué)品和化妝品)毒性檢測(cè)指南的標(biāo)準(zhǔn)方法均來(lái)源于國(guó)際經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織(The Organization for Economic Co-operation and Development，OECD)或者人用藥品注冊(cè)技術(shù)要求國(guó)際協(xié)調(diào)會(huì)(International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use， ICH)[1-2]。傳統(tǒng)的生殖發(fā)育毒性檢測(cè)以動(dòng)物試驗(yàn)為主， 包括分娩前發(fā)育毒性研究(OECD TG 414)、一代動(dòng)物毒性研究(OECD TG 415)、二代動(dòng)物毒性研究(OECD TG 416)、生殖毒性/發(fā)育毒性篩選檢測(cè)(OECD TG 421)、重復(fù)劑量毒性研究結(jié)合生殖毒性/發(fā)育毒性篩選檢測(cè)(OECD TG 422)， 以及2009 年發(fā)布的Hershberger 實(shí)驗(yàn)(TG 411)和討論中的發(fā)育神經(jīng)毒性試驗(yàn)(TG 426)[3-5]。完整的生殖發(fā)育毒性研究包括成年動(dòng)物從受孕到子代性成熟的各個(gè)發(fā)育階段接觸受試物的反應(yīng)。化學(xué)物的生殖發(fā)育毒性有2個(gè)顯著的特點(diǎn)： ①生殖系統(tǒng)較機(jī)體的其他系統(tǒng)對(duì)化學(xué)物的毒性作用更為敏感； ②損害作用不僅影響接觸化學(xué)物質(zhì)的母體本身，還可影響其后代。鑒于哺乳類動(dòng)物繁殖過(guò)程的復(fù)雜性，因此需要對(duì)繁殖過(guò)程的各個(gè)方面進(jìn)行毒理學(xué)分析，包括致畸性、內(nèi)分泌干擾、母細(xì)胞突變、生育受損等[6]。2011 年7 月28 日OECD 提出了一項(xiàng)試驗(yàn)指南， 稱為延長(zhǎng)一代生殖發(fā)育毒性研究(OE CD TG443)， 用于替代一代和二代動(dòng)物毒性研究(OECD TG 415 和416)[7]，這項(xiàng)指南將動(dòng)物福利等因素考慮進(jìn)去，最大程度減少了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用[8]。

目前全世界每年用于實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物數(shù)以千萬(wàn)計(jì)，實(shí)驗(yàn)嚙齒類、實(shí)驗(yàn)兔、犬、豬、牛、羊及非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物等被廣泛用于科學(xué)實(shí)驗(yàn)，引發(fā)動(dòng)物保護(hù)組織的持續(xù)關(guān)注。促進(jìn)3R，即減少(Reduction)、替代(Replacement)、優(yōu)化(Refinement)理論發(fā)展，是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用者的責(zé)任[9]。毒理學(xué)替代方法指能替代動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、減少所需動(dòng)物數(shù)量或使動(dòng)物實(shí)驗(yàn)程序得以優(yōu)化而減少動(dòng)物痛苦的任何方法或程序。其范圍主要包括用組織學(xué)、胚胎學(xué)、細(xì)胞學(xué)或計(jì)算機(jī)等方法取代整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，或以低等動(dòng)物取代高等級(jí)動(dòng)物等。生殖和發(fā)育毒性檢測(cè)中使用的動(dòng)物數(shù)量較多， 但因哺乳動(dòng)物生殖周期的復(fù)雜性， 生殖發(fā)育毒性替代方法的研究一直在進(jìn)行中[10]。已有3 種體外模型，全胚胎培養(yǎng)試驗(yàn)(whole embryo culture test，WEC)、微團(tuán)檢測(cè)法(micromass test，MM)[11]和胚胎干細(xì)胞試驗(yàn)(embryonic stem cell test，EST)[12]于2003 年正式通過(guò)歐洲替代方法驗(yàn)證中心(European Centre for the Validation of Alternative Methods， ECVAM)驗(yàn)證， 并作為胚胎發(fā)育毒性的篩選方法[13]。生殖發(fā)育毒性體外替代優(yōu)化方法的研究思路是將整個(gè)繁殖過(guò)程分成數(shù)個(gè)連續(xù)的生物學(xué)部分，分別對(duì)其進(jìn)行單獨(dú)或聯(lián)合研究，最大程度地鑒定出外源毒性物質(zhì)的靶器官或組織。目前，已經(jīng)探索出一些很有前景的體外模型和方法，本文重點(diǎn)介紹雌性生殖發(fā)育毒性研究中體外培養(yǎng)技術(shù)研究進(jìn)展。

1 雌性生殖系統(tǒng)組織和細(xì)胞培養(yǎng)

1.1 卵巢顆粒細(xì)胞培養(yǎng)

1.1.1 原代卵巢顆粒細(xì)胞培養(yǎng) 采用成年雌性大、小鼠動(dòng)情周期的竇狀卵泡或21～30日齡幼年大鼠經(jīng)注射孕馬血清(pregnant mare serum gonadotropin，PMSG)或埋置已烯雌酚作72～96 h 預(yù)處理后的卵巢，體外分離和加入刺激因子培養(yǎng)顆粒細(xì)胞。加入外源物質(zhì)和細(xì)胞相互作用，隨后檢測(cè)細(xì)胞存活率和測(cè)定細(xì)胞分泌產(chǎn)物(雌二醇和孕酮)含量以評(píng)價(jià)顆粒細(xì)胞的功能狀態(tài)。該體外模型可以用來(lái)初步篩選影響顆粒細(xì)胞生長(zhǎng)和發(fā)育的外源物質(zhì)，缺陷是只能研究顆粒細(xì)胞的單一功能，不能研究對(duì)卵母細(xì)胞及其與卵泡膜細(xì)胞之間的相互作用，不能動(dòng)態(tài)觀察卵泡形成過(guò)程和配子發(fā)生[14，15]。

1.1.2 永生化的顆粒細(xì)胞甾體生成試驗(yàn) 在化妝品生殖和發(fā)育毒性檢測(cè)方法中選用永生化的小鼠顆粒細(xì)胞系NT-1和變異株NT-1-hAROM(表達(dá)人芳香化酶基因)，研究外源物質(zhì)對(duì)顆粒細(xì)胞甾體生成水平的影響。如檢測(cè)對(duì)孕酮生成的影響，可將NT-1 細(xì)胞與不同濃度受試物孵育，免疫法測(cè)定上清液中孕酮含量，貼壁細(xì)胞采用MTT 法或者CCK-8 法進(jìn)行細(xì)胞活性測(cè)試。如檢測(cè)對(duì)雌二醇生成的影響，可將NT-1-hAROM細(xì)胞與芳香化酶的底物雄烯二酮共孵育，酶聯(lián)免疫法測(cè)定培養(yǎng)液中的雌二醇的產(chǎn)量，貼壁細(xì)胞可以檢測(cè)細(xì)胞增殖情況[16，17]。

1.2 卵巢黃體細(xì)胞培養(yǎng)

采用妊娠16 d大鼠的黃體或25～30日齡幼年雌性大鼠促排卵后的妊娠黃體，在體外用不同的分離液和消化液分離出黃體細(xì)胞，制成懸液在體外培養(yǎng)。加入外源物質(zhì)和細(xì)胞相互作用，觀察細(xì)胞存活率和測(cè)定細(xì)胞分泌產(chǎn)物孕酮含量，觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)，測(cè)定環(huán)磷酸腺苷、DNA 或蛋白質(zhì)含量、激素受體等[18，19]。該方法可以用來(lái)初步篩選影響黃體細(xì)胞生長(zhǎng)和發(fā)育的外源物質(zhì)，和大鼠卵巢顆粒細(xì)胞培養(yǎng)方法類似，缺陷是黃體細(xì)胞原代培養(yǎng)比顆粒細(xì)胞培養(yǎng)困難，培養(yǎng)時(shí)間也較短。

1.3 腔前卵泡培養(yǎng)

大、小鼠腔前卵泡的發(fā)育過(guò)程中， 其組成部分在各個(gè)發(fā)育階段都有可能對(duì)外源物質(zhì)的損傷敏感， 這些將影響卵泡的發(fā)育， 還可能引起卵母細(xì)胞減數(shù)分裂異常、受精失敗或者胚胎發(fā)育不良。通過(guò)卵泡形態(tài)學(xué)、生物功能和卵子的發(fā)生來(lái)檢測(cè)外源物質(zhì)對(duì)其影響， 用于對(duì)卵巢功能有抑制作用或激活作用的外源物質(zhì)的篩查， 也可用于外源物質(zhì)對(duì)卵泡發(fā)育和受精能力的作用機(jī)制研究。卵泡培養(yǎng)方法目前主要有二維培養(yǎng)(貼壁卵泡培養(yǎng))和完整三維結(jié)構(gòu)(球狀結(jié)構(gòu))培養(yǎng)兩種類型。方法是從12～14 日齡的雌性大、小鼠卵巢中機(jī)械性分離腔前卵泡(120～170 μm)進(jìn)行體外培養(yǎng)， 檢測(cè)指標(biāo)主要是： 卵泡的存活、卵泡的生長(zhǎng)、卵丘細(xì)胞-卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)的排出比率、卵母細(xì)胞的數(shù)量和成熟度-生發(fā)泡(germinal vesicle，GV)、生發(fā)泡破裂(germinal vesicle breakdown， GVBD)和第一極體(polar body， PB)的形成率、性激素的水平如雄烯二酮、睪酮、雌二醇和孕酮水平[20-22]。

1.4 卵巢器官培養(yǎng)

取大、小鼠胚胎卵巢或出生后大、小鼠卵巢器官進(jìn)行培養(yǎng)，也可對(duì)卵巢通過(guò)未損傷的脈管系統(tǒng)進(jìn)行培養(yǎng)基灌流培養(yǎng)，主要用于卵巢內(nèi)血流作用、靜止期卵泡的啟動(dòng)、卵泡生長(zhǎng)發(fā)育、排卵和卵泡獲得產(chǎn)生類固醇激素能力的研究[23]。缺陷在于體外培養(yǎng)時(shí)間短，不利于長(zhǎng)期培養(yǎng)。

1.4.1 卵巢灌流培養(yǎng)系統(tǒng) 卵巢體外灌流培養(yǎng)是將手術(shù)分離后的卵巢放置于循環(huán)灌流系統(tǒng)中灌流培養(yǎng)，灌流系統(tǒng)內(nèi)添加不同培養(yǎng)基，通過(guò)未損傷的脈管系統(tǒng)進(jìn)行灌流，觀察培養(yǎng)后卵巢組織的生長(zhǎng)并進(jìn)行生物化學(xué)分析，也可檢測(cè)卵泡發(fā)育、排卵和類固醇激素的合成。主要用于研究外源物質(zhì)對(duì)卵巢內(nèi)卵泡發(fā)育和排卵的影響，便于從整體水平上發(fā)現(xiàn)毒性靶點(diǎn)。以妊娠13 d 小鼠胚胎卵巢為研究材料，建立小鼠胚胎卵巢器官體外無(wú)血清培養(yǎng)模型。胚胎卵巢培養(yǎng)分兩步： 首先在體積分?jǐn)?shù)2%胎牛血清條件下胚胎卵巢進(jìn)行貼壁培養(yǎng)5 d， 再以胰島素硒添加劑(insulin transferring selenium， ITS)和胎球蛋白繼續(xù)培養(yǎng)14 d(相當(dāng)于到產(chǎn)后13 d)，經(jīng)過(guò)19 d 的培養(yǎng)胚胎卵巢中有大量原始卵母細(xì)胞開(kāi)始生長(zhǎng)， 培養(yǎng)中后期胚胎卵巢中出現(xiàn)許多早期次級(jí)卵泡。新生嚙齒動(dòng)物卵巢培養(yǎng)涉及從初生到出生20 d 的整個(gè)卵巢培養(yǎng)，多數(shù)的卵巢在體外培養(yǎng)8 d后， 將卵丘復(fù)合體分離再培養(yǎng)14 d。這種培養(yǎng)體系可用于毒理學(xué)研究，找出可能干擾這些進(jìn)程的潛在危險(xiǎn)的外源物質(zhì)[24]。

1.4.2 卵巢皮質(zhì)薄片培養(yǎng) 卵巢組織切片懸浮培養(yǎng)，增加了氣體和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的擴(kuò)散，減少卵巢組織的壞死[25，26]。通過(guò)組織切碎機(jī)將卵巢皮質(zhì)層切成100 μm厚的薄片置于培養(yǎng)液中培養(yǎng)，組織培養(yǎng)到一定階段后再?gòu)谋∑蟹蛛x腔前卵泡，進(jìn)一步在體外發(fā)育為可以排卵、受精的卵母細(xì)胞。如有研究[27]將成年人的卵巢切片在體外與環(huán)磷酰胺、順鉑等化療藥物以及促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑共培養(yǎng)，表明促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑對(duì)于化療藥物引起的卵巢損失并無(wú)保護(hù)作用。還有研究[28，29]將妊娠12.5 d 小鼠胚胎時(shí)期卵巢(除去中腎)切片在體外培養(yǎng)28 d天用于分離卵母細(xì)胞做分析或切片在體外培養(yǎng)8 d，用于觀察生殖細(xì)胞密度。目前已證明，利用器官培養(yǎng)或皮質(zhì)薄片培養(yǎng)能夠成功地在體外啟動(dòng)原始卵泡的生長(zhǎng)，它既保留了卵巢整個(gè)器官培養(yǎng)時(shí)的優(yōu)點(diǎn)，又克服了其缺點(diǎn)，它可以去除卵巢髓質(zhì)分泌的抑制因子對(duì)卵母細(xì)胞在體發(fā)育的抑制作用，從而在體外同時(shí)獲得大量發(fā)育程度相近的卵母細(xì)胞。該方法可以探究在體內(nèi)很難評(píng)估的一些細(xì)胞因子對(duì)卵泡發(fā)育的影響，也可以研究卵巢在體外的類固醇激素合成能力及其影響因素。卵巢皮質(zhì)薄片培養(yǎng)技術(shù)是卵巢器官培養(yǎng)的一個(gè)有力補(bǔ)充。

1.5 芳香化酶測(cè)試

芳香化酶在卵巢和胎盤中活性很高，具有將雄性激素轉(zhuǎn)化為雌性激素的功能，不少殺蟲(chóng)劑、黃體類似物和芳香化酶抑制劑都有抑制芳香化酶的活性。體外芳香化酶檢測(cè)通過(guò)測(cè)量芳香化酶對(duì)標(biāo)記的雄烯二酮的代謝能力，用于篩選外源物質(zhì)是否干擾芳香化酶的活性。目前有兩種體外檢測(cè)系統(tǒng)，分別是JEG-3 和JAR 絨毛癌細(xì)胞系[30-32]。此外，還可以運(yùn)用人類胎盤微粒體的體外亞細(xì)胞手段檢測(cè)芳香化酶的活性。

1.6 雌激素受體結(jié)合試驗(yàn)

許多環(huán)境化合物雖然對(duì)人體不具有明顯毒性，但卻能干擾人的內(nèi)分泌系統(tǒng)。這種內(nèi)分泌干擾能夠破壞幾乎所有的脊椎動(dòng)物的內(nèi)分泌系統(tǒng)。雌激素主要通過(guò)雌激素受體(estrogen receptors， ERs)來(lái)介導(dǎo)細(xì)胞增殖、分化和內(nèi)穩(wěn)態(tài)的生物學(xué)作用。不同靶組織中的細(xì)胞質(zhì)膜、線粒體、細(xì)胞核上的ERs 有著相似的調(diào)節(jié)功能， 但也存在一定的差異[33]。雌激素受體結(jié)合試驗(yàn)用于檢測(cè)能夠與雌二醇受體結(jié)合的外源物質(zhì)。通過(guò)定量檢測(cè)外源物質(zhì)和17β-雌二醇與ERs的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合能力， 檢測(cè)受試物是否能與ERs結(jié)合發(fā)揮雌激素作用或干擾正常雌激素活性[34]。如應(yīng)用雌激素競(jìng)爭(zhēng)性受體結(jié)合試驗(yàn)檢測(cè)樂(lè)果、乙酰甲胺磷、久效磷、馬拉硫磷、對(duì)硫磷和對(duì)氧磷6 種有機(jī)磷農(nóng)藥的雌激素樣活性，結(jié)果顯示這6 種有機(jī)磷農(nóng)藥的結(jié)合率均未下降到50%，說(shuō)明這6 種有機(jī)磷農(nóng)藥不與大鼠子宮雌激素受體的位點(diǎn)結(jié)合[35]。

1.7 雌二醇受體轉(zhuǎn)錄檢測(cè)

當(dāng)外源物質(zhì)干擾內(nèi)分泌系統(tǒng)時(shí)可能會(huì)引起發(fā)育異常、生育障礙、患癌風(fēng)險(xiǎn)增加、免疫系統(tǒng)及神經(jīng)系統(tǒng)功能異常等后果，其中最常受到影響的是性激素水平。雌二醇受體是一個(gè)誘導(dǎo)靶基因轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄因子，將雌二醇受體調(diào)控的DNA 序列與易測(cè)的報(bào)告基因連接，可以直接對(duì)雌激素類外源物質(zhì)進(jìn)行篩選。體外雌二醇受體轉(zhuǎn)錄檢測(cè)主要用于鑒定在體內(nèi)能夠影響雌二醇活性的激動(dòng)劑或拮抗劑。如293T、HSC-T6、MCF-7 等細(xì)胞均可被轉(zhuǎn)染成為檢測(cè)細(xì)胞[36-38]。OECD 建議使用來(lái)自人的宮頸癌并經(jīng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系hERa-Hela-9903，細(xì)胞暴露于非細(xì)胞毒性濃度的受試物20～24 h 以誘發(fā)報(bào)告基因的產(chǎn)生，同時(shí)檢測(cè)4 種性激素水平，包括強(qiáng)雌激素(17β- 雌二醇）、弱雌激素(17β- 雌二醇)、極弱雌激素(17-β-甲基睪酮)和陰性對(duì)照(皮質(zhì)甾酮)。如果誘發(fā)的最高反應(yīng)相當(dāng)于或者超過(guò)陽(yáng)性對(duì)照(1 nmol/L 17-β-雌二醇)反應(yīng)的10%， 可以判定為陽(yáng)性物質(zhì)(Test No.455)[39]。

1.8 子宮頸/內(nèi)膜上皮細(xì)胞體外試驗(yàn)

在基質(zhì)中培養(yǎng)子宮頸/內(nèi)膜上皮細(xì)胞，模擬體內(nèi)環(huán)境，觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化[40，41]，用CCK-8法和基因表達(dá)技術(shù)研究外源物質(zhì)對(duì)子宮頸/內(nèi)膜上皮細(xì)胞增殖和分化的影響[42]。類性激素外源物質(zhì)會(huì)使子宮頸/內(nèi)膜上皮細(xì)胞產(chǎn)生與內(nèi)源性類固醇相似的反應(yīng)，調(diào)節(jié)其功能。

2 胚胎組織和細(xì)胞培養(yǎng)

1990年代末， ECVAM推薦有效性較高的3個(gè)體外胚胎發(fā)育毒性篩選試驗(yàn)作為體外篩選外源毒性物質(zhì)的首選方法，即體外全胚胎培養(yǎng)試驗(yàn)(WEC)、胚胎細(xì)胞微團(tuán)培養(yǎng)試驗(yàn)(MM)和胚胎干細(xì)胞試驗(yàn)(EST)[11]。根據(jù)體內(nèi)發(fā)育毒性的數(shù)據(jù)，將外源物質(zhì)分為3 類： 無(wú)胚胎毒性、弱胚胎毒性和強(qiáng)胚胎毒性。試驗(yàn)系統(tǒng)通過(guò)建立標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程來(lái)達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)化，結(jié)果顯示出良好的預(yù)測(cè)能力和重現(xiàn)性[43]。

2.1 WEC

胚胎毒性通常是指外源物質(zhì)對(duì)胚胎選擇性毒性作用，表現(xiàn)為妊娠著床前早期階段或著床后階段胚胎的丟失，或出生前引發(fā)的在胎兒期觀察到的任何毒性表現(xiàn)。胚胎毒性雖然是在宮內(nèi)引發(fā)，但表現(xiàn)在出生前或出生后發(fā)育過(guò)程中，主要包括妊娠卵枯萎、胎死宮內(nèi)、胎兒生長(zhǎng)受限、功能缺陷和畸形等。體外試驗(yàn)具有簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、試驗(yàn)周期短、試驗(yàn)條件可控、劑量-反應(yīng)關(guān)系易測(cè)和排除母體干擾等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于胚胎毒性的篩選和致畸機(jī)制的研究。體外全胚胎培養(yǎng)方法在致畸因素的篩選、致畸作用機(jī)制的探討及發(fā)育生物學(xué)等研究中均有廣泛的應(yīng)用價(jià)值，是一種將動(dòng)物的完整胚胎移植到體外進(jìn)行培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。該方法1 9 3 0 年代由Nicholas 等[44]提出， 1970 年代由New 等[45]通過(guò)不斷改進(jìn)發(fā)展成熟和完善，該法主要模型動(dòng)物有小鼠、大鼠和兔等。大鼠全胚胎培養(yǎng)是從妊娠9～10 d 大鼠子宮取出胚胎，剝?nèi)ヌツ?，放入培養(yǎng)液中加入受試物，在含O2、CO2和N2環(huán)境中旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，觀察胚胎發(fā)育情況，記錄胚胎存活，檢測(cè)胚芽、卵黃囊直徑、體節(jié)和體長(zhǎng)等情況。以胚胎的心跳和血液循環(huán)是否作為胚胎存活的指標(biāo)； 以卵黃囊直徑、顱臀長(zhǎng)和頭長(zhǎng)、體節(jié)數(shù)和胚胎重作為配套生長(zhǎng)發(fā)育的指標(biāo)； 根據(jù)Brown 評(píng)分對(duì)器官形態(tài)分化作出評(píng)價(jià)，包括17 項(xiàng)形態(tài)指標(biāo)： 卵黃囊血管、尿囊、胚胎體位、心臟、前后神經(jīng)管、前腦、中腦、后腦、聽(tīng)覺(jué)系統(tǒng)、視覺(jué)系統(tǒng)、嗅覺(jué)系統(tǒng)、鰓弓、上頜突、前肢芽、后肢芽和體節(jié)數(shù)。然后按各個(gè)組織器官形態(tài)分化過(guò)程分為5 個(gè)層次，分別賦予0～4 分，各組織器官累積得分為總得分?？偟梅衷降停f(shuō)明胚胎形態(tài)發(fā)育越不正常，即受試物的發(fā)育毒性作用程度越高[46]。該方法可用于篩查外源物質(zhì)的發(fā)育毒性、探討其劑量反應(yīng)關(guān)系和作用機(jī)制。用帶臟層卵黃囊的妊娠10.5 d 的兔胚胎在含100%氧氣密封瓶中體外旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，存活12 h； 用妊娠10 d 的日本大耳白兔胚胎在體外培養(yǎng)了48 h，形成了兔著床后全胚胎培養(yǎng)方法，評(píng)估體系與大鼠全胚胎培養(yǎng)方法類似[47]。

2.2 MM

微團(tuán)培養(yǎng)是1980 年代由Flint[48]建立，并經(jīng)Renault 等[49]加以改善的體外培養(yǎng)試驗(yàn)系統(tǒng)，已廣泛應(yīng)用于胚胎毒物篩檢。其理論基礎(chǔ)是： 一些毒性物質(zhì)影響靶器官或靶組織細(xì)胞的分化、增殖、遷移及基質(zhì)的改變，而這些改變可通過(guò)未分化細(xì)胞的體外培養(yǎng)表現(xiàn)出來(lái)，從而根據(jù)培養(yǎng)細(xì)胞集落形成數(shù)量、細(xì)胞形態(tài)、基質(zhì)變化和超微結(jié)構(gòu)的變化評(píng)價(jià)化學(xué)物質(zhì)的毒性作用及其機(jī)制[11]。胚胎肢芽細(xì)胞可取自雞、兔或大、小鼠，細(xì)胞一般分離自器官形成中期胚胎的肢體或頭部組織，制成單細(xì)胞懸液后，以高密度接種培養(yǎng)，通過(guò)分析外源物質(zhì)暴露后細(xì)胞分化情況，對(duì)確定的毒理學(xué)終點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)。采用微團(tuán)培養(yǎng)觀察不同濃度的雙酚A(0～50 mg/L)對(duì)體外培養(yǎng)的Wistar大鼠胚胎肢芽細(xì)胞增殖和分化的影響，結(jié)果顯示雙酚A對(duì)體外培養(yǎng)的Wistar大鼠胚胎肢芽細(xì)胞的增殖和分化均有抑制作用，表現(xiàn)為染毒組肢芽細(xì)胞集落形成數(shù)量減少，細(xì)胞毒性試驗(yàn)吸光度值下降， 并呈現(xiàn)出明顯的劑量-反應(yīng)關(guān)系[50]。采用妊娠13 d 小鼠胚胎后肢芽制成細(xì)胞懸液， 微團(tuán)培養(yǎng)檢測(cè)續(xù)斷水煎液對(duì)小鼠胚胎肢芽細(xì)胞增殖，分化和凋亡的影響，結(jié)果表明續(xù)斷水煎液對(duì)胚胎肢芽細(xì)胞無(wú)毒性作用， 還能促進(jìn)肢芽細(xì)胞的增殖和分化，抑制肢芽細(xì)胞的凋亡[51]。采用三維技術(shù)建立小鼠胚胎中腦體外培養(yǎng)系統(tǒng)， 在2個(gè)小鼠品系中進(jìn)行驗(yàn)證微團(tuán)培養(yǎng)。從妊娠11 d 的C57BL/6 小鼠胚胎或妊娠12 d 的A/J 小鼠胚胎中分離腦細(xì)胞培養(yǎng)，高密度微團(tuán)體外培養(yǎng)22 d 進(jìn)行比較， 兩種小鼠微團(tuán)系統(tǒng)的蛋白表達(dá)模式相似。這種研究早期神經(jīng)發(fā)生的3D 培養(yǎng)方法，可應(yīng)用于體外神經(jīng)發(fā)育毒性的研究[11]。

2.3 EST

外源物質(zhì)對(duì)于生殖細(xì)胞或者早期胚胎的影響將會(huì)引起不孕或者種植前胚胎的發(fā)育異常，進(jìn)而引起胚胎毒性或者是后代的畸形，胚胎干細(xì)胞(ES)由于其無(wú)限增殖及多向分化的潛能而作為研究體外胚胎毒性的細(xì)胞模型得到廣泛應(yīng)用，以ES 為基礎(chǔ)的EST是2003年獲得ECVAM認(rèn)可的胚胎毒性評(píng)價(jià)的體外替代方法，但該實(shí)驗(yàn)方法的快速性和準(zhǔn)確性存在一定局限性，目前該細(xì)胞模型的研究主要集中于快速性和準(zhǔn)確性的優(yōu)化[12]。方法參照ECVAM 提供的EST 操作程序，采用小鼠ES E14TG2a 和成纖維細(xì)胞3T3 細(xì)胞，或者分別以小鼠ES、人ES(hES)、人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞為試驗(yàn)載體(hiPS)篩選外源物質(zhì)對(duì)其影響[52-53]。

3 乳腺上皮細(xì)胞體外試驗(yàn)方法

乳腺最主要的功能就是泌乳，乳腺上皮細(xì)胞是乳腺中唯一具有分泌功能的細(xì)胞。體外培養(yǎng)的乳腺上皮細(xì)胞在研究乳腺的發(fā)育機(jī)制、乳汁的分泌機(jī)制、乳腺生物反應(yīng)器的構(gòu)建和乳腺癌發(fā)生的研究中均有應(yīng)用。與乳腺發(fā)育及泌乳相關(guān)的激素有三類。第一類是性激素： 包括雌激素、孕激素、催乳素和催產(chǎn)素； 第二類是與新陳代謝有關(guān)的激素： 包括生長(zhǎng)激素、類固醇激素、甲狀腺激素和胰島素； 第三類是乳腺激素： 泌乳刺激素、甲狀旁腺激素相關(guān)肽和瘦素。雌激素和孕酮可以刺激單層小鼠乳腺上皮細(xì)胞酪蛋白的合成，單獨(dú)用雌激素可以促進(jìn)小鼠乳腺合成酪蛋白及乳糖[54，55]。乳腺上皮細(xì)胞可取自兔、大鼠、小鼠、牛和人[56，57]。外源毒性物質(zhì)與乳腺上皮細(xì)胞共孵育，觀察對(duì)其生長(zhǎng)增殖和相關(guān)蛋白的影響，通過(guò)該方法也容易找到相應(yīng)的保護(hù)物質(zhì)，如茶多酚可保護(hù)牛乳腺上皮細(xì)胞免受過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的氧化損傷[57]。

4 展望

現(xiàn)行完整的生殖發(fā)育毒性研究，包括二代生殖毒性在內(nèi)，大約需要5 000 多只動(dòng)物。整體動(dòng)物雌性生殖發(fā)育毒性研究方法仍是評(píng)價(jià)外源毒性物質(zhì)的主要方法，特別是藥物生殖發(fā)育毒性評(píng)估，但其存在不敏感、周期長(zhǎng)、所需受試樣品量多，特別是由于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)生殖功能主要是以與生殖后果有關(guān)的參數(shù)作為基礎(chǔ)，因此難以揭示毒作用位點(diǎn)和毒作用機(jī)制。而且，成年動(dòng)物雌性卵巢是由不同發(fā)育階段各種卵泡群組成的，體內(nèi)試驗(yàn)不易發(fā)現(xiàn)不同階段的卵泡毒性。而雌性生殖發(fā)育毒性體外培養(yǎng)技術(shù)可以模擬生殖發(fā)育過(guò)程中的各個(gè)環(huán)節(jié)，對(duì)于優(yōu)化和減少體內(nèi)生殖毒性研究中動(dòng)物的使用顯示出巨大潛力，并且便于精準(zhǔn)確定毒性靶器官和探索毒性機(jī)制。但體外試驗(yàn)也存在代謝能力和人體有差異、缺乏毒代動(dòng)力學(xué)過(guò)程、種屬外推、體細(xì)胞與生殖細(xì)胞敏感度不同等問(wèn)題。任何一種體外方法無(wú)法全面模擬外源物質(zhì)在體內(nèi)對(duì)生殖發(fā)育系統(tǒng)影響的全過(guò)程，尚不能完全替代目前生殖發(fā)育毒性試驗(yàn)常用的整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?，F(xiàn)代生殖發(fā)育毒理學(xué)研究不斷引入新的體外培養(yǎng)技術(shù)，由傳統(tǒng)的整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)逐步發(fā)展到體外細(xì)胞和分子水平。三維培養(yǎng)系統(tǒng)的建立使相關(guān)培養(yǎng)方式更接近機(jī)體本身[58，59]，隨著各個(gè)替代優(yōu)化方法不斷被驗(yàn)證實(shí)施，雌性生殖發(fā)育毒性體外方法學(xué)研究將得到新的發(fā)展和突破。