周煥新,王偉

(1.山西大學 生物技術研究所,化學生物學與分子工程教育部重點實驗室,山西 太原 030006;2.太原科技大學 環(huán)境與安全學院，山西 太原 030024)

0 引言

金屬硫蛋白(Metallothioneins,MTs)是一類小的超家族胞漿蛋白,能夠通過半胱氨酸(Cys)殘基螯合重金屬離子[1],廣泛存在于微生物、植物、無脊椎動物和脊椎動物的各種組織和器官[2]。MTs不僅參與重金屬離子的解毒[3],同時也參與必需金屬離子平衡調(diào)節(jié)[4],在細胞的氧化應激、增殖、凋亡和衰老等一系列生理生化過程中發(fā)揮重要作用[5]。原生動物嗜熱四膜蟲(Tetrahymenathermophila)包含5種金屬硫蛋白亞型,依據(jù)誘導物類型和Cys殘基排布模式被劃分為7a和7b兩個亞家族。7a亞家族的MTT1、MTT3和MTT5屬于鎘誘導型金屬硫蛋白(CdMT),7b亞家族的MTT2和MTT4屬于銅誘導型金屬硫蛋白(CuMT)。四膜蟲5種MTs基因的編碼序列均無內(nèi)含子,適應細胞對逆境環(huán)境脅迫下基因表達的快速響應[6-8]。

哺乳動物MTs的表達受金屬應答元件結合轉錄因子(Metal-responsive transcription factor 1,MTF-1)的調(diào)控,當細胞處于逆境環(huán)境時,MTF-1作用于MTs基因轉錄調(diào)節(jié)區(qū)域的金屬響應元件(Metal response element,MRE)、抗氧化響應元件(Antioxidant response element,ARE)、糖皮質激素響應元件(Glucocorticoid responsive elements,GRE)等實現(xiàn)對MTs基因轉錄調(diào)控[9]。MTF-1含有高度保守的鋅指結構域,包含有6個Cys2His2鋅指結構域以及3個轉錄激活區(qū):酸性區(qū)域、富含脯氨酸(Pro)區(qū)域和富含絲氨酸(Ser)及蘇氨酸(Thr)的區(qū)域[10]。在金屬離子應激條件下,果蠅MTF-1結合MRE激活MTs基因的轉錄[2]。四膜蟲中存在多種進化高度保守的含有鋅指結構域的轉錄因子[11]。四膜蟲不同的MTs基因在應激條件下的轉錄表達水平存在差異。MTT1、MTT3和MTT5能夠被多種應激條件所誘導,并表現(xiàn)出相應的特異性,MTT1和MTT5主要參與重金屬離子鎘和鉛的解毒,MTT3主要參與Zn2+的平衡調(diào)節(jié)[7],而MTT2和MTT4主要參與Cu+的代謝[12-13]。然而參與嗜熱四膜蟲中金屬離子誘導下的MTs基因轉錄表達的轉錄調(diào)控因子并不清楚,本研究基于四膜蟲基因組數(shù)據(jù)庫(http:∥www.ciliate.org),首次篩選鑒定了含有鋅指結構域的基因ZFP1(TTHERM-01002770),通過同源重組敲除ZFP1基因,獲得ΔZFP1細胞株,初步分析了金屬離子脅迫下ZFP1敲除突變細胞中MTs基因的轉錄水平,為金屬離子誘導下的金屬硫蛋白的轉錄調(diào)控提供相關依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

嗜熱四膜蟲B2086細胞株(Cornell University,The nationalTetrahymenaStock Center,http:∥tetrahymena.vet.cornell.edu/index.html)。酵母提取物、胰蛋白胨(英國OXOID公司)、EDTA 鐵鹽;氨芐青霉素、巴龍霉素(上海生工),鏈霉素、兩性霉素、葡萄糖(北京索萊寶科技有限公司);pMD18-T克隆試劑盒(TaKaRa公司);限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶和Dream TaqDNA聚合酶(Thermo公司);SYBR Premix Ex TaqTM(TaKaRa公司);膠回收試劑盒(OMEGA公司),質粒提取試劑盒(北京天根生化);引物合成和DNA 序列測序由上海生工完成。

1.2 嗜熱四膜蟲細胞培養(yǎng)

嗜熱四膜蟲于SPP培養(yǎng)基(1%胰蛋白胨(g/L),0.2%葡萄糖(g/L),1.0%酵母提取物(g/L),0.003% EDTA鐵鹽(g/L))中30℃,170 r/min恒溫搖床培養(yǎng)。

1.3 敲除載體構建

以嗜熱四膜蟲大核基因組為模板,通過引物KO-ZFP1-5-F/KO-ZFP1-5-R和KO-ZFP1-3-F/KO-ZFP1-3-R分別擴增ZFP1基因的上游序列876 bp和下游序列544 bp,PCR反應條件為:94℃,5 min,94℃,30 s,52℃,30 s,72℃,90 s,30個循環(huán),72℃延伸 10 min。回收片段與pMD18-T載體連接,轉化大腸桿菌DH5α,篩選獲得重組質粒pMD18-ZFP1-5′和pMD18-ZFP1-3′。限制性內(nèi)切酶SacⅠ和NotⅠ分別酶切質粒pMD18-ZFP1-5′和載體pNEO4并回收片段T4 DNA連接酶連接(16℃過夜),轉化并篩選獲得pZFP1-5′-NEO4質粒。限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和XhoⅠ分別酶切質粒pMD18-ZFP1-3′和pZFP1-5′-NEO4,回收目的片段通過T4 DNA連接酶連接并轉化轉化大腸桿菌DH5α,篩選獲得重組質粒pN-ZFP1。

1.4 細胞轉化及突變株篩選

重組質粒pN-ZFP1用限制性內(nèi)切酶SacⅠ和KpnⅠ酶切線性化,濃縮至1～1.5 μg/μL。通過基因槍(GJ-1000,寧波新芝科技有限公司)將線性化質粒轉化到嗜熱四膜蟲細胞中。通過提高SPP培養(yǎng)基中巴龍霉素濃度進行細胞表型分配的篩選。PCR對敲除株進行鑒定,PCR反應條件為:94℃,5 min;94℃,30 s,53℃,4 min,72℃,90 s,30個循環(huán);72℃延伸 10 min。

1.5 Cu2+和Cd2+脅迫下細胞的增殖

通過急性毒性試驗測定Cu2+和Cd2+對突變細胞24 h半數(shù)最大效應濃度(Concentration for 50% of maximal effect,EC50)。Cu2+處理的終濃度分別為:15、30、45、60、100和120 μmol/L;Cd2+處理的終濃度分別為:5、10、15、20、30和40 μmol/L.野生型細胞和突變細胞在30℃、170 r/min恒溫培養(yǎng)至對數(shù)生長前期(1×105cells/mL),吸取500 μL細胞分別轉至24孔培養(yǎng)板,加入新鮮SPP培養(yǎng)基至2 mL,不同金屬離子母液按濃度梯度分別加入培養(yǎng)孔,繼續(xù)培養(yǎng)24 h,血球計數(shù)器記錄不同處理細胞密度計算抑制率,以金屬離子濃度對數(shù)值和抑制率進行數(shù)據(jù)擬合,得到劑量-效應曲線和EC50。

1.6 MTs基因的表達分析

ΔZFP1細胞和野生型細胞在53.0 μmol/L CuSO4和25.3 μmol/L CdCl2誘導1 h后,不同處理的突變細胞和野生型細胞mRNA分別被提取,分光光度計檢測所提取的mRNA的OD260/280在1.8～2.0之間,以mRNA為模板反轉錄PCR獲得cDNA。以野生型細胞為對照,對突變細胞中的MTs基因在不同金屬離子壓力下的轉錄水平進行分析,17S rRNA作為內(nèi)參,RT-PCR反應條件為:95℃,15 min,95℃,15 s,56℃,30 s 40個循環(huán)。每個獨立的樣本采取3個平行,結果通過儀器自帶的StepOne Software讀取,采用2-ΔΔCT處理法進行分析。統(tǒng)計上采用T檢測,P<0.05具有統(tǒng)計學意義。

表1 本研究中使用的PCR引物

2 實驗結果

2.1 嗜熱四膜蟲ZFP1基因分析

嗜熱四膜蟲ZFP1基因全長2 160 bp,編碼 719個氨基酸(圖1C),N端包含4個B-Box鋅指結構域,分別為F1、F2、F3和F4(圖1A),每個鋅指結構域由相應的“l(fā)inker”鏈接,C端富含絲氨酸(Ser)區(qū)域共包含43個Ser,谷氨酰胺(Gln)富含區(qū)域共包含51個Gln(圖1C),SWISS-MODEL(https:∥www.swissmodel.expasy.org)模擬的Zfp1(19-134aa)三級結構具有四個鋅指結構域(圖1B)?；谒哪はx基因組數(shù)據(jù)庫(http:∥www.ciliate.org)分析,Zfp1與四膜蟲T.malaccesis,T.ellittti,T.borealis中的同源基因的一致性為73%、62%和51%。而鋅指結構域的一致性為98%、89%和85%。通過四膜蟲功能基因組數(shù)據(jù)庫(http:∥tfgd.ihb.ac.cn)分析,ZFP1在生長期有著較低的表達量,在饑餓期表達上調(diào),在有性生殖時期4 h達到最大值(圖2A)。野生型細胞在Cu2+誘導下,ZFP1轉錄水平上調(diào)2.9倍,在Cd2+誘導下,ZFP1轉錄水平上調(diào)1.4倍(圖2B),表明ZFP1響應金屬離子的調(diào)控。

Fig.1 Sequence analysis of Zfp1 from T. thermophilaA:Zfp1鋅指結構蛋白結構域,Zfp1包含4個鋅指結構域,每個鋅指結構域由相應的連接序列鏈接,C端包含富含絲氨酸和谷氨酰胺的結構域。B:SWISS-MODEL模擬的Zfp1三級結構圖。C:Zfp1氨基酸序列分析。圖1 嗜熱四膜蟲Zfp1的序列分析

Fig.2 Transcriptional expression analysis of ZFP1A:ZFP1基因的微陣列表達譜,L1為生長期的表達水平;S0、S6、S9、S15和S24為饑餓0 h、6 h、 9 h、 15 h和24 h的表達水平;C0、C4、C8和C12為有性生殖0 h、4 h、8 h和12 h的表達水平。B:金屬離子Cd2+ 和Cu2+誘導下的ZFP1轉錄水平分析。圖2 ZFP1基因轉錄表達分析

2.2 ΔZFP1突變細胞株的鑒定

通過同源重組方法獲得的ΔZFP1細胞(圖3A),在含有巴龍霉素的SPP培養(yǎng)基中進行篩選。以ΔZFP1基因組為模板,ZFP1-F和ZFP1-R擴增獲得3.4 kb重組片段;WT基因組為模板,獲得3.9 kb片段(圖3B)。qRT-PCR檢測ΔZFP1細胞中ZFP1的表達,結果表明ZFR1無轉錄本產(chǎn)生,獲得ZFP1基因完全敲除的突變細胞(圖3C)。

Fig.3 Construction and identification of ΔZFP1 cellsA:ZFP1基因敲除同源重組示意圖。B:ΔZFP1細胞重組位點PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳,M:DNA 標準,野生型條帶大約3.9 kb,重組條帶大約3.4 kb。C:ZFP1基因轉錄水平的qRT-PCR分析。圖3 ΔZFP1突變細胞株的構建和鑒定

2.3 ZFP1的敲除影響細胞對Cu2+和Cd2+的耐受性

為了分析ZFP1是否參與細胞對金屬離子的耐受性,以Cu2+和Cd2+對野生型細胞和ΔZFP1細胞的生長抑制進行了測定。野生型細胞對Cu2+和Cd2+的EC50值分別為83.1 μmol/L和32.8 μmol/L;ΔZFP1細胞對Cu2+和Cd2+的EC50值分別為53.0 μmol/L和25.3 μmol/L(圖4),表明ΔZFP1對Cu2+和Cd2+耐受性降低,說明敲除ZFP1基因影響了細胞對銅、鎘的耐受性。

Fig 4 Inhibition of ΔZFP1 cells growth under Cu2+和Cd2+ stress野生型細胞和ΔZFP1細胞暴露在含有CuSO4或CdCl2脅迫下的增值。A:野生型細胞和ΔZFP1細胞暴露在含有CuSO4的SPP培養(yǎng)基中的EC50值分別為83.1 μmol/L和53.0 μmol/L。B:野生型細胞和ΔZFP1細胞暴露在含有CdCl2的SPP培養(yǎng)基中的EC50值分別為32.8 μmol/L和25.3 μmol/L。圖4 Cu2+和Cd2+抑制ΔZFP1細胞的增殖

2.4 Cu2+和Cd2+離子脅迫下MTs的轉錄分析

哺乳動物MTF-1缺失的突變體中,MTs基因的表達顯著下調(diào)[14]。在Cu2+誘導下,ΔZFP1細胞中MTT2、MTT3、MTT4和MTT5的轉錄水平顯著降低(p<0.01),而MTT1的轉錄水平升高(P<0.01)(圖5A),表明ZFP1基因參與了Cu2+誘導的MTT2、MTT3、MTT4和MTT5的表達。Cd2+誘導下,ΔZFP1中僅發(fā)現(xiàn)MTT4轉錄水平顯著降低(P<0.01)而MTT3和MTT5(P<0.01),MTT1和MTT2(P<0.05)表達上調(diào)(圖5B),表明ZFP1基因可能并不直接參與Cd2+誘導下MTT1、MTT2、MTT3和MTT5基因的轉錄調(diào)控。

Fig.5 Transcription level of MTs induced by Cu2+ and Cd2+ in ΔZFP1 cellsA:ΔZFP1細胞在含有CuSO4培養(yǎng)基中的MTs的表達分析。B:ΔZFP1細胞在含有CdCl2的SPP培養(yǎng)基中的MTs的表達分析。圖5 Cu2+和Cd2+誘導下ΔZFP1細胞中MTs基因轉錄水平

3 討論

MTs基因表達受多種應激條件的影響,如金屬離子、甾體類激素、化學物質、納米材料、炎癥等[1,5]。MTs基因轉錄受MTF-1的調(diào)控,在金屬離子誘導下,MTF-1中的鋅指結構與MTs基因轉錄調(diào)節(jié)區(qū)的MRE結合,響應細胞內(nèi)游離Zn2+濃度調(diào)節(jié),從細胞質轉移至細胞核實現(xiàn)與DNA結合完成轉錄調(diào)節(jié)[15-16]。在哺乳動物中MRE大多以多拷貝形式存在,并且表現(xiàn)為特有的固定核心序列“TGCRCNC”其中R=A/G,N=A/T/C/G[17]。在嗜熱四膜蟲基因表達調(diào)控元件中鑒定出金屬硫蛋白保守基序(Metallothionein Conserved Motif 1,MTCM1)的順式調(diào)控元件,包含一個TGANTCA(N為任意核酸)序列,這種順式作用元件類似于釀酒酵母中從事拮抗金屬和氧化應激作用的YAP-1和c-jun的應答元件(TGAG/CTCA)[18-19]。這種保守基序MTCM1在MTT1調(diào)控序列中出現(xiàn)6次,MTT3調(diào)控序列中出現(xiàn)2次,MTT5調(diào)控序列中出現(xiàn)13次,MTT2調(diào)控序列中出現(xiàn)1次,MTT4調(diào)控序列中出現(xiàn)3次[20]。相應的MTT5基因在Cd的脅迫下表達水平最高,MTT1次之,而MTT3最低;Cu的脅迫下,MTT4的表達水平顯著高于MTT2[8]。哺乳動物MTF-1調(diào)控了控制金屬離子濃度動態(tài)平衡和抗氧化反應的基因的表達[21]。敲除MTF-1的突變小鼠對鎘離子的毒性更加敏感[22]。嗜熱四膜蟲中存在多種進化高度保守的含有鋅指結構域的轉錄因子,并且發(fā)揮著不同功能,Zfr1p在性發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控功能[11]。本研究中嗜熱四膜蟲缺失ZFP1基因,生長發(fā)育未受到影響,表明ZFP1與生長發(fā)育無關。但是ΔZFP1細胞表現(xiàn)為對金屬離子的耐受性降低,這一結果與我們先前研究的缺失MTs基因影響細胞對金屬離子的耐受性的結果相類似,先前的研究表明敲除MTT2和MTT4基因,導致細胞對Cu2+的耐受性降低[23],敲除MTT1,MTT3,或MTT5基因導細胞對Cd2+耐受性降低[23-24]。而敲除ZFP1基因的突變細胞表現(xiàn)為Cu2+和Cd2+耐受性降低,說明ZFP1的缺失影響了細胞對金屬離子的耐受性。

在大多數(shù)生物中,多種MT異構體存在是一個普遍現(xiàn)象,并且不同MT異構體表現(xiàn)出不同的功能。在同樣的脅迫條件下,不同的異構體具有不同響應程度,表明這些MT異構體具有不同的調(diào)控機制[20]。金屬離子誘導ΔZFP1細胞發(fā)現(xiàn),在Cu2+誘導下,MTT2、MTT3、MTT4和MTT5轉錄水平降低(圖5A),ZFP1基因缺失影響了MTs的轉錄調(diào)控,表明Zfp1與Cu2+脅迫下MTT2、MTT3、MTT4和MTT5轉錄相關,而MTT1轉錄水平上調(diào)暗示可能存在其他特異的轉錄調(diào)控因子補償了細胞缺失ZFP1所導致的MTs基因轉錄下調(diào)(圖5A)。ΔZFP1細胞在Cd2+誘導下MTT1、MTT2、MTT3和MTT5轉錄水平上調(diào),表明ZFP1可能并不直接參與Cd2+脅迫下四膜蟲CdMT(MTT1、MTT3和MTT5)和MTT2的轉錄,暗示四膜蟲MTs基因轉錄調(diào)控存在多種調(diào)節(jié)因子,但是,ZFP1缺失導致突變體細胞在Cd2+誘導下,MTT4的表達顯著降低。因此我們推測四膜蟲金屬離子誘導下的MTs轉錄調(diào)控是一個由多因子共同參與調(diào)控的過程,同時單一的鋅指結構蛋白也可能參與不同MTs基因轉錄調(diào)控。