莊彩霞，蔣宇林，劉俊濤

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院，北京 100730)

出生缺陷是影響人口素質(zhì)的全球性問(wèn)題，而單基因病是導(dǎo)致出生缺陷的一個(gè)重要原因。單基因病遵循孟德?tīng)栠z傳定律，隱性遺傳病的攜帶者無(wú)癥狀卻可生育患病后代。對(duì)于嚴(yán)重遺傳病的攜帶者篩查可顯著降低該嚴(yán)重疾病患兒的流行率。本文對(duì)單基因病攜帶者篩查的歷史和現(xiàn)狀以及未來(lái)研究方向進(jìn)行了闡述。

一、單基因病與攜帶者篩查

單基因遺傳病是兒童畸形和殘疾的主要原因之一，種類(lèi)繁多。據(jù)流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)，全球范圍內(nèi)單基因遺傳疾病影響1%活產(chǎn)兒，占嬰兒死亡率的10%以及兒科住院率的20%[1]。多數(shù)遺傳性疾病沒(méi)有有效的治療方法，具有終生性治療的特點(diǎn)。針對(duì)致病基因的生物技術(shù)(如轉(zhuǎn)基因、RNA干擾、基因組編輯)已經(jīng)成功應(yīng)用于一些遺傳性疾病治療[2]。但生物技術(shù)的安全性亟待確認(rèn)，且其治療費(fèi)用高造成沉重的精神和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。攜帶有隱性致病基因突變的人，被稱(chēng)為“攜帶者”。國(guó)外一研究結(jié)果顯示無(wú)表型人群中人均攜帶有2.8個(gè)致病突變(0～7個(gè))[3]。美國(guó)的一項(xiàng)涵蓋上百種基因病檢測(cè)的研究[4]，研究結(jié)果表明受試者中24%至少有1種突變，5.2%受試者是多種疾病的攜帶者，5.4‰的夫妻攜帶同一致病突變。理想情況下，在孕前明確準(zhǔn)父母的攜帶狀態(tài)，進(jìn)行充分咨詢(xún)后，夫妻作出生育自主選擇。攜帶者夫妻可選擇輔助生育，如胚胎植入前遺傳學(xué)診斷，或產(chǎn)前診斷以避免嚴(yán)重遺傳病患兒出生[5]；或可以為患兒的出生進(jìn)行充分準(zhǔn)備，極早進(jìn)行干預(yù)[6]。

二、攜帶者篩查的發(fā)展史

單基因病的篩查開(kāi)始于1963年對(duì)新生兒進(jìn)行的苯丙酮尿癥篩查。新生兒篩查的最主要目的是確定新生兒期潛在致死或致殘的疾病，或通過(guò)早期干預(yù)顯著改善患兒生活質(zhì)量和預(yù)后。但分娩后的篩查檢測(cè)可能耽誤部分需要盡早干預(yù)的新生兒代謝性疾病的治療。自上世紀(jì)七八十年代，單基因遺傳病攜帶者篩查的開(kāi)展使得對(duì)某些單基因病的干預(yù)時(shí)機(jī)前移。

最初的篩查工作開(kāi)展是以種族為基礎(chǔ)進(jìn)行的，20世紀(jì)70年代開(kāi)展了Tay-Sachs病的攜帶者篩查[7]。攜帶者篩查的應(yīng)用使Tay-Sachs病在德系猶太人群中的發(fā)病率減少超過(guò)90%[8]，明確表明了攜帶者篩查對(duì)降低出生缺陷的重要意義。2004年，美國(guó)婦產(chǎn)醫(yī)師協(xié)會(huì)(ACOG)發(fā)表聲明，推薦在德系猶太人后裔中進(jìn)行包括Tay-Sachs病、Canavan病、囊性纖維化(CF)等四種特定疾病的攜帶者篩查[9]。20世紀(jì)90年代末和21世紀(jì)初，發(fā)表了關(guān)于CF的攜帶者篩查的建議。美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院于1997年發(fā)表首次聲明，建議對(duì)有CF家族史的人以及妊娠期夫妻進(jìn)行攜帶者篩查[10]。2001年美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳基因組學(xué)會(huì)(ACMG)和ACOG發(fā)表了指南(2013年重申)，建議對(duì)北歐和德系猶太人后裔進(jìn)行CF的篩查[11]。

傳統(tǒng)攜帶者篩查側(cè)重于特定種族的特定高發(fā)疾??；而隨著基因技術(shù)的發(fā)展，檢測(cè)成本降低，涵蓋數(shù)種至百種疾病的攜帶者篩查panel得到了更廣泛的應(yīng)用。2009年開(kāi)始，攜帶者篩查從基于種族的單個(gè)疾病篩查發(fā)展到在商業(yè)化實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行的無(wú)論種族的百種疾病同時(shí)篩查[12]，這種基于panel的多種疾病同時(shí)篩查的泛族裔篩查稱(chēng)為擴(kuò)展型攜帶者篩查(Expanded Carrier Screening，ECS)。2011年ACOG指南(2017年更新)，推薦攜帶者篩查應(yīng)用于育齡期人群，不局限于種族背景[13]。在過(guò)去幾年，提供ECS的實(shí)驗(yàn)室數(shù)量和包含在panel中疾病數(shù)量持續(xù)增加。Lazarin等[4]已報(bào)道，來(lái)自美國(guó)的一項(xiàng)關(guān)于攜帶者篩查的研究應(yīng)用的panel可同時(shí)檢測(cè)400多種致病突變，其涵蓋了108種單基因遺傳病。隨著分子遺傳技術(shù)的發(fā)展進(jìn)步，尤其是基于panel檢測(cè)和高通量測(cè)序的發(fā)展，ECS應(yīng)用的疾病種類(lèi)已達(dá)到五百余種[14]，檢測(cè)費(fèi)用隨著技術(shù)發(fā)展而下降。在歐洲，ECS的應(yīng)用推廣相對(duì)較慢，篩查的應(yīng)用主要局限于疾病高發(fā)的特定種族人群和接受人工輔助生殖者[15-16]。而最近研究表明，歐洲普通人群對(duì)ECS的應(yīng)用感興趣[17-18]，并且不久的將來(lái)許多歐洲國(guó)家對(duì)ECS的需求和接受度可能會(huì)增加。目前，在美國(guó)進(jìn)行ECS檢測(cè)的人數(shù)每年達(dá)20萬(wàn)[19]，ECS的應(yīng)用越來(lái)越受歡迎。

三、 攜帶者篩查的現(xiàn)狀

傳統(tǒng)的攜帶者篩查是基于特定的單基因遺傳病家族史或基于種族背景下攜帶頻率較高的特定疾病的篩查。在歷史發(fā)展和社會(huì)變革中，基于社會(huì)結(jié)構(gòu)的改變、社會(huì)人口流動(dòng)、種族間通婚、收養(yǎng)及未知種族或種族背景復(fù)雜等變化，正確評(píng)估和確定個(gè)體的種族變得越來(lái)越困難。ACOG和ACMG推薦，以種族為基礎(chǔ)的單病種攜帶者篩查模式需向泛族裔的多種疾病聯(lián)合篩查(即擴(kuò)展性攜帶者篩查，ECS)模式轉(zhuǎn)化。

國(guó)外權(quán)威學(xué)術(shù)機(jī)構(gòu)相繼發(fā)布關(guān)于ECS的臨床應(yīng)用指南規(guī)范。2015年，美國(guó)遺傳和生殖健康組織推薦ECS只應(yīng)用于早發(fā)的嚴(yán)重影響健康的致殘、致死的疾病，不推薦應(yīng)用于成年期發(fā)病或外顯率低、表達(dá)異質(zhì)性高的疾病[20]。越來(lái)越多疾病的遺傳和表型關(guān)聯(lián)性認(rèn)知度的增加使得更多的單基因遺傳病被納入到ECS的范疇內(nèi)。二代測(cè)序(NGS)等分子技術(shù)的發(fā)展改變著臨床基因檢測(cè)的格局，ECS檢測(cè)越全面，假陰性率越低，但會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)的假陽(yáng)性率增加。由于某些變異基因臨床意義不明確，建議攜帶者篩查應(yīng)限用于目前已知基因型-表型關(guān)聯(lián)明確的突變基因；在臨床應(yīng)用中，ECS的芯片發(fā)展需要有明確的醫(yī)療標(biāo)準(zhǔn)，而不應(yīng)包括技術(shù)能檢測(cè)的所有疾病[20-22]。2017年，ACOG行業(yè)指南推薦每一名孕婦都應(yīng)被告知攜帶者篩查的實(shí)施[13，23]。攜帶者篩查模式同時(shí)需保持對(duì)于普通大眾群體篩查檢測(cè)的適用性，需要具有良好的成本-效益。隨著分子技術(shù)的進(jìn)步降低了攜帶者篩查的成本，使得多種疾病聯(lián)合篩查費(fèi)用不超過(guò)以往的一種特定單基因遺傳病的檢測(cè)費(fèi)用。

國(guó)外關(guān)于攜帶者篩查的形勢(shì)已是大勢(shì)所趨，現(xiàn)有不少成果發(fā)表。2016年美國(guó)醫(yī)學(xué)會(huì)雜志(JAMA)刊登了基于三十萬(wàn)余例樣本的多達(dá)94種臨床嚴(yán)重疾病的應(yīng)用ECS進(jìn)行相關(guān)研究[24]。同年，醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志(Genetics in Medicine，GIM)刊登了基于猶太人群的多種疾病聯(lián)合篩查的研究[25]。2017年，澳大利亞針對(duì)3種單基因遺傳病聯(lián)合篩查(CF、脆性X綜合征、脊髓性肌肉萎縮癥)，發(fā)現(xiàn)受影響妊娠數(shù)量比例與唐氏綜合癥相當(dāng)[26]。理想情況下，孕前向準(zhǔn)父母提供攜帶者篩查，可以最大限度地提高攜帶者夫妻的生殖自主權(quán)。但由于計(jì)劃外妊娠以及在孕前夫妻對(duì)攜帶者篩查認(rèn)知的限制，妊娠期的夫妻也應(yīng)該在產(chǎn)前被提供攜帶者篩查[6，22，27]。因此，為了識(shí)別無(wú)癥狀的生育期攜帶者，評(píng)估其生育風(fēng)險(xiǎn)，有效降低出生缺陷，攜帶者篩查的目標(biāo)人群定位于妊娠或計(jì)劃妊娠的夫妻[13]。產(chǎn)前攜帶者篩查并不能替代新生兒篩查，但同樣不能因新生兒篩查而忽略產(chǎn)前篩查的價(jià)值及重要意義。攜帶者篩查受益的不僅僅是攜帶者本人，其親屬可能攜帶有同一致病基因，鼓勵(lì)其告知親屬攜帶風(fēng)險(xiǎn)和攜帶者篩查檢測(cè)的可用性，以指導(dǎo)生育決策，必要時(shí)進(jìn)行遺傳咨詢(xún)，選擇相應(yīng)的輔助生育措施。ECS作為出生缺陷防控的有效手段已成為ACOG和ACMG等專(zhuān)業(yè)學(xué)會(huì)的共識(shí)。

目前，我國(guó)國(guó)內(nèi)臨床針對(duì)遺傳性疾病篩查的咨詢(xún)能力普遍不足，大眾人群對(duì)攜帶者篩查認(rèn)知度低，孕前人群優(yōu)生優(yōu)育觀(guān)念不足，基于以上原因，國(guó)內(nèi)尚無(wú)ECS的臨床應(yīng)用開(kāi)展。

四、擴(kuò)展性攜帶者篩查檢測(cè)方法

目前在產(chǎn)前診斷領(lǐng)域應(yīng)用到的遺傳檢測(cè)方法有多種。產(chǎn)前診斷最常見(jiàn)的核型(染色體分析)及結(jié)合熒光原位雜交(FISH)。隨著分子技術(shù)的發(fā)展，PCR分子檢測(cè)技術(shù)用于基因檢測(cè)，例如Sanger測(cè)序[28]；測(cè)序技術(shù)的迅猛發(fā)展，NGS利用大規(guī)模平行測(cè)序，提高了基因檢測(cè)的效率，降低了成本，對(duì)包括攜帶者篩查在內(nèi)的分子檢測(cè)產(chǎn)生重大影響[29]。目前應(yīng)用的基因檢測(cè)方法包括染色體微陣列分析(CMA)、NGS及靶向基因組測(cè)序和全外顯子測(cè)序。CMA中的熒光標(biāo)記DNA與載有數(shù)千個(gè)基因探針的panel雜交，可識(shí)別具有DNA拷貝數(shù)重復(fù)或缺失的區(qū)域。CMA目前是針對(duì)患有多種先天異常、遺傳綜合征以及智力和發(fā)育障礙的兒童或成人[30]。CMA引入產(chǎn)前診斷，作為胎兒超聲異常的首選基因診斷檢測(cè)[31]。對(duì)發(fā)現(xiàn)單基因病的新的致病突變或罕見(jiàn)變異或可應(yīng)用全外顯子測(cè)序及全基因組測(cè)序等分子檢測(cè)技術(shù)。但全外顯子測(cè)序應(yīng)用可能導(dǎo)致檢測(cè)出許多意義不明的變異(VUS)，對(duì)于無(wú)先證者的情況下應(yīng)用于產(chǎn)前診斷，將為受檢者帶來(lái)不必要的焦慮。全外顯子測(cè)序和全基因組測(cè)序等技術(shù)的應(yīng)用可能同時(shí)帶來(lái)諸多倫理挑戰(zhàn)，分子技術(shù)的應(yīng)用與倫理并行，更需謹(jǐn)慎評(píng)估與應(yīng)用。

五、攜帶者篩查panel中納入疾病種類(lèi)以及變異位點(diǎn)的選擇

隨著分子檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，ECS的檢測(cè)panel包含疾病的數(shù)量持續(xù)增加[6]。商業(yè)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)的發(fā)展之快速，可見(jiàn)一斑。但臨床的應(yīng)用上卻無(wú)法跟上實(shí)驗(yàn)室技術(shù)進(jìn)展，臨床應(yīng)用對(duì)檢測(cè)的疾病種類(lèi)需要有明確的醫(yī)療指征和標(biāo)準(zhǔn)[32]。對(duì)納入疾病種類(lèi)的選擇上，需要考慮疾病的嚴(yán)重程度、發(fā)病年齡、患病率、攜帶率、成本效益以及受影響個(gè)體的治療或其他干預(yù)方案的可用性(包括植入前或產(chǎn)前診斷等)。

ACOG委員會(huì)對(duì)ECS篩查疾病種類(lèi)的納入問(wèn)題提出建議，包括檢測(cè)病種的攜帶率>1/100、基因型-臨床表型的明確聯(lián)系以及需要臨床干預(yù)[33]。ECS的目標(biāo)疾病應(yīng)該是嚴(yán)重致殘致畸出生缺陷的疾病、早期發(fā)病或具有干預(yù)措施的遺傳疾病[13]。但疾病癥狀輕、成人期發(fā)病、自然病史未知或攜帶率非常低的疾病，不推薦進(jìn)行ECS[13]。攜帶者篩查病種可包括[22]：(1)常染色體隱性遺傳(AR)疾病的攜帶者的兄弟姐妹有2/3風(fēng)險(xiǎn)攜帶同樣的隱性致病基因。若夫妻攜帶同一致病基因，其后代有1/4患病的風(fēng)險(xiǎn)，選擇造成嚴(yán)重致畸致殘的出生缺陷的疾病。(2)國(guó)外指南提到可納入極少數(shù)常染色體顯性遺傳(AD)疾病，可通過(guò)ECS識(shí)別AD疾病，且國(guó)外部分商業(yè)實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)芯片中對(duì)AD疾病也有納入。但疾病的外顯率和表達(dá)異質(zhì)性可能影響疾病的癥狀以及嚴(yán)重程度，現(xiàn)階段并不一定適合納入ECS檢測(cè)范圍內(nèi)。(3)部分ECS也包括X連鎖疾病，例如脆性X綜合征和Duchenne型肌營(yíng)養(yǎng)不良癥(DMD)。由于X失活現(xiàn)象的存在，女性攜帶者可能有也可能無(wú)該疾病癥狀，或具有輕微癥狀。同時(shí)，女性攜帶者有50%可能生育男性患兒的風(fēng)險(xiǎn)，而子代中女性50%可能為攜帶者。在2017年對(duì)美國(guó)商業(yè)ECS篩查panel中包含的疾病進(jìn)行的審查中，其列入篩查panel的疾病僅有27%總體上符合醫(yī)療納入的標(biāo)準(zhǔn)[34]。

對(duì)于ECS檢測(cè)目標(biāo)疾病涉及到的致病突變的選擇，2013年ACMG發(fā)布聲明中推薦對(duì)與疾病嚴(yán)重性有明確臨床相關(guān)性的變異位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)[21]。同時(shí)，2015年ACMG、ACOG、美國(guó)圍產(chǎn)兒保護(hù)基金會(huì)(PQF)、美國(guó)遺傳咨詢(xún)協(xié)會(huì)(NSGC)和美國(guó)母胎醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)(SMFM)發(fā)布關(guān)于ECS在生殖醫(yī)學(xué)中的聯(lián)合聲明，明確建議1)對(duì)檢測(cè)的基因和變異應(yīng)與表型關(guān)系明確；2)測(cè)序檢出的臨床意義未明變異不應(yīng)報(bào)告；3)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)應(yīng)報(bào)告所有致病變異和疑似致病變異；4)對(duì)于等位基因頻率較高、外顯率低的變異不推薦進(jìn)行篩查[20]。ECS檢測(cè)panel中納入疾病和變異位點(diǎn)，在大眾人群中的發(fā)病率必須明確，在檢測(cè)平臺(tái)上的突變檢出率必須明確，以便于評(píng)估在檢測(cè)結(jié)果陰性者的殘余風(fēng)險(xiǎn)[21]。對(duì)檢測(cè)變異位點(diǎn)的選擇與限制可能降低需要隨訪(fǎng)的人群數(shù)量，若檢出VUS可能引起受檢者不必要的焦慮，對(duì)進(jìn)行遺傳咨詢(xún)的醫(yī)師要求非常高。

六、攜帶者篩查臨床開(kāi)展將面臨的困難

據(jù)NSGC、ACOG和加拿大和歐洲的遺傳學(xué)會(huì)的建議，應(yīng)對(duì)攜帶者篩查檢測(cè)者進(jìn)行檢測(cè)前、后的咨詢(xún)[20，22，35]。尤其是充分遺傳咨詢(xún)對(duì)于計(jì)劃外妊娠夫妻或因攜帶者篩查認(rèn)知限制的妊娠夫妻進(jìn)行攜帶者篩查檢測(cè)。但由于文化程度等的影響，臨床上進(jìn)行充分的遺傳咨詢(xún)有一定困難。若夫妻攜帶同一隱性致病基因者在充分遺傳咨詢(xún)前提下，若產(chǎn)前診斷還面臨的流產(chǎn)等風(fēng)險(xiǎn)問(wèn)題。另外，夫妻雙方或一方為攜帶者時(shí)，可能影響家庭的穩(wěn)定，造成醫(yī)患關(guān)系緊張以及隨訪(fǎng)困難，這些隱形的倫理問(wèn)題困難重重。攜帶者篩查檢測(cè)并非由專(zhuān)業(yè)醫(yī)療機(jī)構(gòu)提供，而更多的由商業(yè)實(shí)驗(yàn)室提供。商業(yè)實(shí)驗(yàn)室直接面向消費(fèi)者，對(duì)于ECS項(xiàng)目的監(jiān)管和責(zé)任制度迫切需要制定行業(yè)準(zhǔn)則與標(biāo)準(zhǔn)，且商業(yè)實(shí)驗(yàn)室能否提供完整充分的遺傳咨詢(xún)令人擔(dān)憂(yōu)。

檢測(cè)后醫(yī)生需評(píng)估殘余風(fēng)險(xiǎn)，即檢測(cè)陰性并不能完全排除生育患兒風(fēng)險(xiǎn)的可能性[23]。原因包括：ECS檢測(cè)疾病的位點(diǎn)通常是最常見(jiàn)和已知明確致病突變，檢測(cè)并不涵蓋該疾病的所有致病變異。如果攜帶頻率和檢出率已知的情況下，檢測(cè)后殘余風(fēng)險(xiǎn)可被計(jì)算出[21，36]。但某些疾病的攜帶頻率和檢出率并不能明確，造成殘余風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估不能準(zhǔn)確量化，導(dǎo)致遺傳咨詢(xún)更大的困難。

七、攜帶者篩查的局限性

現(xiàn)行的各ECS的檢測(cè)存在很大差異，其panel中最顯著的差異之一是篩選出的基因數(shù)量(40～1 500個(gè))，僅有三個(gè)基因是16個(gè)檢測(cè)panel都包含的[32]。臨床關(guān)于ECS的臨床數(shù)據(jù)支持還有很大欠缺，需要進(jìn)一步評(píng)估其臨床應(yīng)用。由于檢測(cè)范圍的局限性及基因突變的多樣性，不能排除所檢測(cè)基因或特定突變之外存在其他變異位點(diǎn)的攜帶，ECS陰性檢測(cè)結(jié)果存在一定的殘余風(fēng)險(xiǎn)。由于檢測(cè)技術(shù)的原因，可能會(huì)有其他致病基因攜帶狀態(tài)的意外結(jié)果檢出，需要進(jìn)行必要的遺傳咨詢(xún)。檢測(cè)過(guò)程中可能會(huì)發(fā)現(xiàn)非婚生或夫妻屬于近親緣關(guān)系。隱性遺傳疾病攜帶狀態(tài)的披露，可能為受試者及家庭帶來(lái)心理壓力及生育壓力，及其他妊娠期不必要的壓力或焦慮[37]。同時(shí)，孕前和產(chǎn)前獲得逐漸增多的遺傳信息量也帶來(lái)了需要慎重面對(duì)處理的道德和遺傳咨詢(xún)的挑戰(zhàn)[38]。

八、攜帶者篩查的發(fā)展方向

未來(lái)發(fā)展中，WES及全基因組測(cè)序(WGS)可能發(fā)展為ECS的檢測(cè)技術(shù)。隨著醫(yī)生對(duì)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的基本認(rèn)識(shí)的加強(qiáng)，對(duì)患者提供宣教和遺傳咨詢(xún)非常重要。商業(yè)化實(shí)驗(yàn)室直接面向消費(fèi)者的營(yíng)銷(xiāo)及大眾媒體在促進(jìn)ECS方面的影響等挑戰(zhàn)備受關(guān)注，個(gè)人、社會(huì)、法律和倫理方面的影響值得進(jìn)一步評(píng)估。

現(xiàn)今國(guó)內(nèi)對(duì)于攜帶者篩查的認(rèn)識(shí)不足，適合中國(guó)人群的篩查模式尚不明確，也沒(méi)有相關(guān)的指南或共識(shí)指導(dǎo)臨床應(yīng)用。為構(gòu)建完整的符合國(guó)情的出生缺陷防治體系，必須啟動(dòng)中國(guó)人群攜帶者篩查的研究，提出適用于中國(guó)人群的篩查模式。評(píng)估攜帶者篩查檢測(cè)開(kāi)展過(guò)程中需關(guān)注的臨床咨詢(xún)、檢測(cè)及質(zhì)控等問(wèn)題，推進(jìn)國(guó)內(nèi)對(duì)攜帶者篩查檢測(cè)工作的進(jìn)一步認(rèn)知，對(duì)提升出生入口質(zhì)量、降低出生缺陷有重要意義。