張俊莉,趙雪微,賈晶,雙少敏

(山西大學 化學化工學院,山西 太原 030006)

0 引言

碳點作為一種新型的超小碳納米顆粒,與傳統(tǒng)的量子點[1]相比,具有制備簡單、碳源豐富、耐光漂白、熒光可調(diào)、親水性強、表面易功能化以及生物相容性好等優(yōu)點[2-3],因此在生物傳感、生物成像及藥物載體等領域顯現(xiàn)出重要的應用價值[4-5]。

碳點的制備方法現(xiàn)主要分為兩大類:自上而下法,包括激光消融法[6]、電弧放電法[7]以及電化學法[8]等,和自下而上法,包括熱解法[9]、水熱法[10]和微波法[11]等。前者系將碳源以切割或氧化的手段由大尺寸變?yōu)榧{米級尺寸,得到的碳點粒徑均勻,但制備過程冗長復雜、合成條件嚴苛、碳源較單一、成本高、產(chǎn)率低。而后者系以小分子為前體,通過一系列化學反應得到目標碳點,其過程較簡單、易于控制、碳源豐富易得、成本較低。不僅有機小分子[11-12]可作其碳前驅(qū)體,生物碳源[13-16]由于綠色環(huán)保、物種多樣且儲量大的優(yōu)勢也受到廣泛關(guān)注,比較而言,更適合碳點的宏量制備。目前,生物碳源用于制備碳點多采用簡單易行的水/溶劑熱法和熱解法,已有文獻報道以生物碳源進行碳點的宏量制備。Sahu等[17]將40 mL橙汁與30 mL乙醇混合,通過水熱法(120℃、2.5 h)制備出0.4 g碳點。相比于液態(tài)的橙汁,Hsu等[18]采用固態(tài)的咖啡粉作碳源,對其進行高溫熱解(300℃、2 h),從1 g咖啡粉中制得0.12 g碳點,產(chǎn)率達12%。最近,Zhang等[19]以花粉為碳源,水熱(180℃、48 h)合成碳點,可從10 g花粉中至少得到3 g碳點,其合成產(chǎn)率明顯得到提高,最高達到了38%。以上方法利用生物碳源宏量合成碳點操作簡單、可一步制備,無須使用昂貴儀器。但是,其反應過程需要耗費數(shù)小時甚至數(shù)十小時,而且碳點的合成產(chǎn)率也仍比較低,不利于宏量制備,使碳點的應用受到一定限制。所以,急需尋求其他廉價生物碳源以及簡單可行且短耗時的方法合成高產(chǎn)率碳點,從而有效地實現(xiàn)碳點的宏量制備。

酵母是一種微小的單細胞微生物,富含蛋白質(zhì)、氨基酸以及維生素等多種成分[20],被廣泛用于食品工業(yè)和畜牧業(yè)。易于獲取、綠色無毒且含碳物質(zhì)豐富的優(yōu)點使酵母可作為比較理想的碳前驅(qū)體來制備碳點。在自下而上法中,微波法相比于水/溶劑熱法和熱解法,不僅操作容易、可一步合成、設備要求低,而且反應迅速,能在短時間內(nèi)破壞碳源,促使其轉(zhuǎn)變?yōu)樘键c,有望于實現(xiàn)成本低且耗時短的高產(chǎn)率宏量制備。本文選用活性干酵母為生物碳源、磷酸為氧化劑,通過一步微波法快速地合成了產(chǎn)率高、性能好的綠色熒光碳點,對其宏量制備的可行性進行了考察,并對所得碳點進行了表征和細胞毒性評價,最后成功用于細胞成像。

1 實驗部分

1.1 主要試劑與儀器

主要試劑:磷酸(質(zhì)量分數(shù)約40%)、不同pH磷酸鹽緩沖液(PBS)、氫氧化鈉、氯化鈉、硫酸奎寧、活性干酵母。所用試劑均為分析純,實驗用水為超純水。

主要儀器:U-2910紫外-可見分光光度計(日本日立公司)，F(xiàn)-4500熒光光譜儀(日本日立公司)，Perkin Elmer 1000紅外光譜儀(美國珀金埃爾默公司)，Tecnai G2F20 S-Twin場發(fā)射透射電子顯微鏡(美國FEI公司)，透析袋(美國聯(lián)合碳化公司)，Millipore Simplicity超純水系統(tǒng)(上海默克化工公司)，冷凍干燥機(寧波新芝生物科技公司)，F(xiàn)E20酸度計(上海梅特勒-托利多儀器公司)以及M1-L213B微波爐(中國美的集團)。

1.2 碳點的制備

在50 mL玻璃燒杯中分別加入0.5 g活性干酵母顆粒和2 mL磷酸溶液,充分攪拌,將所得酵母酸溶液放置于微波爐中,低火檔(119 W)加熱8 min,待自然冷卻至室溫,得到棕黑色液體。加堿中和后,依次用定性濾紙(10～15 μm)和微濾膜(0.22 μm)進行過濾以去除大分子顆粒,然后再轉(zhuǎn)入透析袋(分子截留量500 Da)內(nèi)于超純水中連續(xù)透析48 h以去除鹽類及其他小分子物質(zhì),取袋內(nèi)溶液,即得純化的碳點溶液。將該溶液進行冷凍干燥,得到0.254 g的棕黃色碳點粉末。重復本實驗4次,并按活性干酵母投料量依次為0.5、1、2、5、10 g進行擴大合成(磷酸溶液加入量隨其比例增加)。

1.3 碳點的表征

將一滴碳點溶液滴在銅網(wǎng)上,待自然晾干后,置于透射電鏡下,觀測其形貌和尺寸。將碳點粉末與溴化鉀粉末以一定比例均勻混合后,壓制成透明薄片,于紅外光譜儀中分析其特征官能團。將盛有碳點溶液的比色皿(光路長10 mm)分別置于紫外-可見分光光度計、熒光分光光度計中測定其光學性質(zhì)。將相同質(zhì)量的碳點粉末溶于一系列不同pH磷酸鹽緩沖液和不同濃度NaCl溶液中,分別測定其熒光強度。配制兩份碳點溶液,一份于365 nm紫外燈下連續(xù)照射6 h,另一份于可見光下放置10 d,每隔一定時間測定二者的熒光強度。

1.4 碳點的熒光量子產(chǎn)率

熒光量子產(chǎn)率的測定以硫酸奎寧作為參比(量子產(chǎn)率為54%),參考文獻所報道的方法[16],記錄測定結(jié)果并根據(jù)如下公式計算得到。

式中φ表示熒光量子產(chǎn)率,K表示發(fā)射光譜的面積積分對吸光度值作圖所得曲線的斜率,η表示溶劑的折射率,x和st分別表示樣品和標準溶液。

1.5 細胞毒性及成像實驗

實驗采用MTT法檢測碳點對細胞的毒性。取HepG2細胞懸液于96孔板中,每孔100 μL。放置于培養(yǎng)箱中,在37℃、體積分數(shù)5% CO2條件下培養(yǎng)24 h后,棄去上層液,給藥孔中加入含不同濃度CDs(0、10、20、50、100、250和500 mg·mL-1)的新鮮培養(yǎng)基。再孵育24 h后,用含MTT新鮮培養(yǎng)基(5 mg·mL-1)替換所有藥孔中培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)2 h。最后,吸掉上層液,加入DMSO輕搖幾分鐘后,用酶標儀在500 nm處測量吸光度,記錄并處理實驗結(jié)果。

為了觀察碳點在細胞中的成像效果,將適量HepG2細胞懸液加入到共聚焦培養(yǎng)皿中,放置于培養(yǎng)箱,在37℃、體積分數(shù)5% CO2條件下進行貼壁培養(yǎng)。然后,棄上層液,用PBS緩沖液潤洗1次,加入含CDs(500 mg·mL-1)的新鮮培養(yǎng)基,再繼續(xù)培養(yǎng)6 h。最后,取出培養(yǎng)皿,移除培養(yǎng)液,用PBS潤洗細胞3次,鏡油封片,進行成像。

2 結(jié)果與討論

2.1 微波加熱時間對碳點合成的影響

采用微波法碳化酵母碳源合成熒光碳點。由于碳源的碳化程度影響碳點產(chǎn)率,而加熱時間對碳化程度有一定影響,為獲得高產(chǎn)率的碳點,考察了微波加熱時間對碳源碳化程度的影響。如圖1A所示,隨微波加熱時間逐漸增加,酵母酸溶液的顏色從乳白色到黃色,到棕黃色,直至變?yōu)樽睾谏＿@表明加熱時間增加,碳源碳化程度隨之加深,有利于碳點的合成[21]。圖1B所示分別為本實驗所用的活性干酵母顆粒以及所制備的碳點溶液和粉末。

Fig.1 Effect of microwave heating time to carbonization degree of carbon source (A);ADY granules and the as-prepared CDs solution and powder (B)圖1 微波加熱時間對碳源碳化程度影響(A)；所用干酵母顆粒及所得碳點溶液和粉末(B)

2.2 宏量制備的可行性考察

平行實驗和擴大合成用以考察碳點宏量制備的可行性。如表1所示，所制得碳點的最佳發(fā)射波長保持在522 nm左右，量子產(chǎn)率保持在13%左右，合成產(chǎn)率保持在50%左右，均無明顯浮動。此外，平行試驗和擴大合成所得碳點的平均產(chǎn)率分別為50.59%和50.76%，對應標準偏差值很小，分別為0.98%和1.29%。以上研究結(jié)果說明，放大制備對所得碳點的光學性質(zhì)沒有產(chǎn)生明顯影響，碳點的合成產(chǎn)率不僅高，并且有很好的重復性與重現(xiàn)性，可有效實現(xiàn)宏量制備。

2.3 碳點的形貌與結(jié)構(gòu)表征及分析

如圖2所示，透射電鏡圖與粒徑分布圖表明，碳點為單分散的類球形顆粒，無團聚現(xiàn)象，粒徑分布較窄(2～6 nm)，平均粒徑約為3.4 nm。從粒徑大小和均勻度來講，通過微波法獲得的碳點是較為理想的。

表1 制備碳點的平行實驗和其擴大合成

Fig.2 TEM image (A) and size distribution diagram (B) of CDs.圖2 碳點的透射電鏡圖(A)與粒徑分布圖(B)

Fig.3 FTIR spectrum of CDs圖3 碳點的紅外吸收光譜圖

圖3為碳點的紅外吸收光譜。其中，以3 350 cm-1為中心的吸收峰屬于O-H和N-H的伸縮振動[22]，在1 650、1 401、1 251和1 051 cm-1的吸收峰分別為C=O、C=C、C-O、和C-N的伸縮振動[15,23]，而在1 541 cm-1處的吸收峰則與N-H的面內(nèi)彎曲振動有關(guān)[22]。以上分析表明，碳點表面存在-OH、-COOH和-NH2，這說明以活性干酵母為碳源可為制備的碳點提供豐富的表面官能團。這些表面官能團可有效加強碳點的親水性，這一點與實驗過程中發(fā)現(xiàn)其具有很好的親水性相印證。

2.4 碳點的光學性質(zhì)表征及分析

對碳點進行紫外-可見吸收光譜、激發(fā)光譜及發(fā)射光譜表征。如圖4A所示，碳點水溶液在281 nm處有強吸收峰，這是由C=C的π-π*躍遷產(chǎn)生的吸收所致[24]；此外，其最大激發(fā)波長和發(fā)射波長分別位于400 nm和522 nm。如圖4a和b所示，碳點溶液在日光下為淡黃色透明溶液，在365 nm紫外燈下則發(fā)出明亮的綠色熒光。

為了進一步探究其發(fā)光特性，不同激發(fā)波長下的發(fā)射光譜被測定。從圖4B可看出，當激發(fā)波長從300 nm增長到460 nm時，碳點的熒光先增強后減弱，其發(fā)射峰發(fā)生了紅移，這表明碳點的熒光光譜具有激發(fā)依賴趨向，這種激發(fā)依賴的發(fā)射性質(zhì)可能與碳點的表面狀態(tài)或粒徑分布有關(guān)[25]。從熒光光譜的歸一化圖(圖4c)可明顯看出，隨激發(fā)波長的增加，發(fā)射峰紅移的程度較小，由此可推斷碳點的粒徑分布較均勻，這與先前所得結(jié)論一致。

(A);Emission spectra of CDs with different excitation wavelengths from 300 to 460 nm (1→9) with a 20 nm increment (B).Inset:photographs of CDs solution under sun light (a) and 365 nm UV light (b); and normalized emission spectra of CDs (c)Fig.4 UV-Vis absorption,maximum excitation and emission spectra of CDs(A)；碳點在不同激發(fā)波長下的發(fā)射光譜(1→9：300→460nm，以20 nm為增幅)(B)； 內(nèi)嵌圖：碳點在可見光(a)和365 nm紫外燈(b)下照片及對應熒光光譜的歸一化圖(c)圖4 碳點的紫外-可見吸收光譜、激發(fā)光譜和發(fā)射光譜圖

2.5 碳點的光穩(wěn)定性考察

以酸堿度、鹽離子濃度、紫外照射時間和存放時間為影響因素，考察碳點的光穩(wěn)定性。如圖5A所示，碳點在pH為7.4時表現(xiàn)出最大熒光強度；在pH 3～11范圍內(nèi)，其熒光強度隨pH的增加無明顯變化；而在pH=1或13的極酸極堿條件下發(fā)生了明顯的降低。如圖5B所示，碳點在0.25 mol·L-1NaCl溶液中熒光最強，而從整體趨勢看，NaCl溶液濃度對熒光的強度影響不大。如圖5C和D所示，碳點的熒光強度隨著紫外照射時間和存放時間的加長而降低的程度均比較弱。以上結(jié)果表明，碳點的光穩(wěn)定性強、耐光漂白性好，可經(jīng)受長時間的激發(fā)照射和儲存。

Fig.5 Influences of pH (A),ionic strength (B),UV exposure (C) andstorage time (D) on fluorescence intensity of CDs.圖5 (A)pH(B)鹽離子濃度(C)紫外輻射時間和(D)存放時間對碳點熒光強度影響

2.6 碳點的生物相容性及其細胞成像研究

Fig.6 HepG2 cellular viability incubated with CDs at different concentrations for 24 h.圖6 HepG2細胞與不同濃度CDs孵育24 h后的存活率

碳點的MTT實驗結(jié)果如圖6所示，HepG2細胞生存率隨其濃度增大呈微弱下降趨勢，當濃度高達500 mg·mL-1時，其存活率仍達90%，說明碳點對細胞的毒性很小，這表明活性干酵母作為碳源合成的熒光碳點具有很好的生物相容性。

圖7為碳點標記HepG2細胞的熒光成像圖。從圖中可以看出，碳點標記的細胞狀態(tài)良好，未觀察到形態(tài)上的損傷，這進一步表明碳點良好的生物相容性。碳點進入細胞后，主要分布于細胞膜和細胞質(zhì)中，很少見于細胞核中，這與之前報道的結(jié)果是相符的[26]。細胞在488 nm激發(fā)波長下發(fā)出明亮的綠色熒光，成像后的細胞輪廓清楚，且熒光強度穩(wěn)定，說明碳點對細胞有很好的光學成像效果。

Fig.7 Fluorescence images of HepG2 cells incubated with CDs (500 mg·mL-1 ) at 37℃ for 6 h. Dark filed (A),bright filed (B) and merge (C) images.A、B、C分別表示暗場、暗場和合場圖像圖7 HepG2細胞與碳點溶液(500 mg·mL-1)在37℃下孵育6 h后的熒光成像圖

3 結(jié)論

以微波法碳化酵母酸溶液得到綠色熒光的碳點，不但具有碳源廉價易得、操作簡單、耗時短、產(chǎn)率高、可宏量制備的優(yōu)勢，而且良好的可分散性、親水性、光穩(wěn)定性以及生物相容性使得碳點表現(xiàn)出很好的細胞成像效果，因此，有望作為熒光探針在生物成像領域得到應用。