，，，

(國(guó)家民委生態(tài)系統(tǒng)建模及應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北方民族大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，寧夏 銀川 750021)

Roberts根據(jù)種子在貯藏過(guò)程中的行為表現(xiàn)，把種子分為正常性種子和頑拗性種子2種類(lèi)型[1]；正常性種子在母體植株成熟散落前經(jīng)歷一個(gè)脫水過(guò)程，脫落時(shí)含水量較低，但種子仍保持較高活力；頑拗性種子在成熟過(guò)程中不經(jīng)歷脫水階段，成熟散落時(shí)具有較高的含水量和代謝活性[2]，一旦脫水，活力大大降低。種子含水量可作為評(píng)價(jià)頑拗性種子脫水耐性的指標(biāo)，被廣泛應(yīng)用于頑拗性種子生物學(xué)領(lǐng)域的研究[3-4]。頑拗性種子的脫水耐性在一定程度上取決于其頑拗性程度，且其脫水耐性與脫水速率呈正相關(guān)，因?yàn)樵诳焖倜撍畻l件下，種子遭受脫水脅迫的時(shí)間縮短也可減少代謝脅迫的積累[5]，慢速脫水使水分在種子內(nèi)部保持的時(shí)間和導(dǎo)致種子傷害的劣變過(guò)程延長(zhǎng)，從而加重對(duì)種子造成的傷害[6]，例如，木菠蘿(ArtocarpusheterophyllusLamk.)種子的胚軸在快速脫水和慢速脫水至含水量約0.37 g/g干重時(shí)，快速脫水時(shí)存活率仍高達(dá)100%，而慢速脫水時(shí)存活率則降至0[7]，然而也有種子活力與種子脫水速率無(wú)關(guān)的報(bào)道[8]。生產(chǎn)頑拗性種子的植物在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中，其母體植株可通過(guò)調(diào)整結(jié)實(shí)量而產(chǎn)生不同大小的種子，大小不同的種子可在一定程度上改變種子表面積以調(diào)節(jié)吸水率和失水率，從而適應(yīng)環(huán)境變化[9]，因此，不同大小種子的脫水耐性可能存在一定差異，并對(duì)種子活力產(chǎn)生影響。

遼東櫟(Quercuswutaishanica)是我國(guó)暖溫帶落葉闊葉林的優(yōu)勢(shì)樹(shù)種之一，對(duì)群落的外貌、結(jié)構(gòu)、動(dòng)態(tài)和種類(lèi)組成具有重要影響?；诜N子繁殖的實(shí)生更新在維持遼東櫟遺傳多樣性和群落穩(wěn)定性等方面具有重要作用。包括遼東櫟在內(nèi)的所有櫟屬植物的種子都表現(xiàn)出一定程度的頑拗性[10]，遼東櫟種子在沙埋和風(fēng)干后貯藏30 d對(duì)種子活力不會(huì)造成嚴(yán)重影響，屬于輕度頑拗性種子[11]，但在種子脫水耐性及其對(duì)活力的影響方面還缺乏系統(tǒng)研究，尤其是不同大小遼東櫟種子的脫水耐性還沒(méi)有引起足夠重視。本研究以取自六盤(pán)山區(qū)的不同大小遼東櫟種子為材料，在緩慢(室溫自然風(fēng)干)和快速脫水(硅膠脫水)條件下，定期對(duì)種子進(jìn)行含水量和活力測(cè)定，研究不同大小遼東櫟種子的脫水敏感性。研究結(jié)果可為探索遼東櫟種子的長(zhǎng)期貯藏方法及種苗繁育等生產(chǎn)實(shí)踐提供參考。

1 材料與方法

1.1 種子采集

試驗(yàn)用遼東櫟種子于2017年9月采自寧夏六盤(pán)山國(guó)家自然保護(hù)區(qū)(35.15°N～35.41°N，106.9°E～106.30°E)龍?zhí)读謭?chǎng)內(nèi)30年生以上的遼東櫟植株冠層下，采集后于次日帶回實(shí)驗(yàn)室，采用觀(guān)察結(jié)合手捏的方法挑選出足量的飽滿(mǎn)、無(wú)蟲(chóng)蛀遼東櫟大、小種子備用，大種子和小種子鮮重分別為(3.05±0.38)g和(1.46±0.27)g。

1.2 種子脫水和含水量測(cè)定

緩慢脫水：分別取上述挑選好的遼東櫟大、小種子各1 120粒，平均分為8組作為8個(gè)不同脫水時(shí)間處理，每組再分為4個(gè)小組作每一脫水時(shí)間的4次重復(fù)，每小組種子共35粒；將種子單層平攤于室溫約25 ℃實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的實(shí)驗(yàn)臺(tái)上自然風(fēng)干，分別在脫水后的6，12，24，36，72，120，168 h (7 d)和336 h (14 d)，各取1組種子進(jìn)行含水量和活力測(cè)定。每重復(fù)取5粒種子用于含水量測(cè)定，用電子天平稱(chēng)其鮮重后，再用單面刀片切成約1 mm厚薄片，裝入稱(chēng)量瓶中，置于103 ℃烘箱中烘干24 h后稱(chēng)重，以干重(dry weight,DW)表示種子含水量(g/g)；每重復(fù)其余30粒種子用于活力測(cè)定。種子含水量和活力測(cè)定均以采集后貯藏于4 ℃冰箱內(nèi)未進(jìn)行脫水處理(0 h)的種子作為對(duì)照。

快速脫水：取大小為20 cm×15 cm自封袋64個(gè)，平均分為2組，在袋內(nèi)裝入烘干的變色硅膠后，分別裝入上述挑選好的遼東櫟大、小種子(種子與硅膠的質(zhì)量比約1/10)，每袋裝入35粒種子，將種子單層擺放，以保證種子與硅膠充分接觸；將自封袋置于室溫約25 ℃實(shí)驗(yàn)室內(nèi)干燥器中，硅膠吸水顏色變淺時(shí)及時(shí)更換。分別在脫水處理1，2，4，8，12，24，48 h和72 h后，取出大、小種子各4袋作為4次重復(fù)，分別進(jìn)行種子含水量和種子活力測(cè)定，每袋內(nèi)取5粒種子用于含水量測(cè)定，測(cè)定方法和含水量計(jì)算方法同上；每重復(fù)其余30粒種子用于活力測(cè)定。對(duì)照同緩慢脫水。

1.3 種子活力測(cè)定

種子萌發(fā)于14 h光照/10 h黑暗[光照強(qiáng)度約140 μmol/(m·s)]，“白天”溫度為25 ℃，“夜晚”溫度為15 ℃條件下進(jìn)行，將種子進(jìn)行剝皮處理后播種于內(nèi)徑為12 cm，裝有約1.5 cm厚濕沙(用前以清水洗凈后于103 ℃烘箱中烘干48 h)的培養(yǎng)皿中；播種時(shí)將種子平放于濕沙表明，輕壓種子使種子與濕沙充分接觸以利于種子吸水。播種后將培養(yǎng)皿置于SPX-330-C智能人工氣候箱(上海瑯玕設(shè)備有限公司)中，每24 h觀(guān)測(cè)萌發(fā)種子記錄1次，以胚根伸出5 mm為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)，記錄萌發(fā)種子數(shù)，并測(cè)定萌發(fā)種子胚根長(zhǎng)度。種子萌發(fā)過(guò)程中適時(shí)澆水，保持沙子濕潤(rùn)，觀(guān)察記錄至連續(xù)2周沒(méi)有種子萌發(fā)為止。

1.4 萌發(fā)參數(shù)計(jì)算

評(píng)價(jià)種子活力的參數(shù)包括萌發(fā)率(germination percentage,GP)、萌發(fā)速率(germination rate,GR)、萌發(fā)指數(shù)(germination index,GI)和活力指數(shù)(vigor index,VI)，分別按照以下公式計(jì)算：

GP=(萌發(fā)種子數(shù)/試驗(yàn)用種子總數(shù))×100%；

GR=∑(100Gi/nti) ,式中：n為每處理使用的種子數(shù)，Gi為ti(ti=0，1，2，3…，∞)天萌發(fā)的種子數(shù);

圖1 緩慢脫水(A)和快速脫水(B)對(duì)不同大小遼東櫟種子含水量的影響

表1 種子大小和脫水方法對(duì)遼東櫟種子萌發(fā)影響的二因素方差分析

GI =∑Gt/Dt，式中：Gt為時(shí)間t天的萌發(fā)種子數(shù)，Dt為萌發(fā)試驗(yàn)天數(shù)；

VI=萌發(fā)率×[幼苗根的長(zhǎng)度(cm)+幼苗莖長(zhǎng)度(cm)](本研究只計(jì)算胚根長(zhǎng)度)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

用多因素方差分析(Multi-way ANOVA)的方法分析種子大小和脫水方法對(duì)萌發(fā)參數(shù)影響的差異顯著性；用單因素方差分析(One-way ANOVA)的方法分析不同脫水階段和同一時(shí)期不同大小種子之間各萌發(fā)參數(shù)的差異顯著性。所有數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析均在SPSS 21.0軟件中進(jìn)行。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 種子含水量變化

由圖1可以看出，不同大小遼東櫟種子在成熟散落時(shí)均具有較高含水量(分別為1.03，1.00 g/g)，不同大小種子間差異顯著(p<0.05)，且大種子含水量在整個(gè)脫水過(guò)程中始終顯著高于小種子(p<0.05)。含水量在緩慢脫水6 h后顯著降低(p<0.05)，脫水336 h后，大、小種子含水量分別為0.58 g/g和0.47 g/g (圖1 A)。種子含水量在快速脫水1 h后即顯著降低(p<0.05)，大種子含水量在快速脫水過(guò)程中始終顯著高于小種子(p<0.05)，除在脫水12 h與24 h間無(wú)顯著差異外，其他脫水階段間均差異顯著(p<0.05) (圖1 B)。

2.2 種子大小和脫水速率對(duì)種子萌發(fā)的影響

種子大小對(duì)所有萌發(fā)參數(shù)均無(wú)顯著影響，脫水方法對(duì)活力指數(shù)影響顯著(p<0.05)，但對(duì)其他萌發(fā)參數(shù)無(wú)顯著影響，種子大小和脫水方法間的交互作用對(duì)所有萌發(fā)參數(shù)的影響均未達(dá)顯著水平(表1)。

2.3 不同脫水處理種子的萌發(fā)率及其與含水量的關(guān)系

從圖2可以看出，未脫水時(shí)大、小種子萌發(fā)率差異不顯著；大種子經(jīng)緩慢脫水12 h含水量為0.94 g/g時(shí)，萌發(fā)率提高至100%，但在脫水120 h后顯著降低(p<0.05)；輕度脫水對(duì)小種子萌發(fā)也具有促進(jìn)作用，脫水24 h后含水量為0.86 g/g時(shí)，萌發(fā)率提高至97.5%，而在脫水36 h后含水量為0.73 g/g時(shí)萌發(fā)率仍與未脫水種子持平；大、小種子萌發(fā)率分別在脫水120 h和72 h后顯著降低(p<0.05)，脫水336 h后分別降至66.7%和42.5% (圖2 A、圖2 B)。除脫水6 h、24 h和36 h外，其他脫水階段大種子萌發(fā)率均顯著大于小種子(p<0.05)。

在快速脫水條件下，輕度脫水也可促進(jìn)種子萌發(fā)，一直持續(xù)到脫水24 h (大、小種子含水量分別為0.78 g/g和0.74 g/g)，但脫水48 h后，大、小種子萌發(fā)率分別大幅降低至86.7%和69.2% (p<0.05)，均顯著低于對(duì)照(p<0.05)，且大種子萌發(fā)率均顯著大于小種子(p<0.05) (圖2 C、圖2 D)。

不論是緩慢脫水還是快速脫水，不同大小種子的萌發(fā)率均與含水量呈顯著的二次曲線(xiàn)關(guān)系(p<0.05)，即在2種脫水條件下，不同大小種子的萌發(fā)率均隨含水量的減少而呈降低趨勢(shì)(圖2 B、圖2 D)。

注：y1、y2分別表示大種子和小種子含水量與萌發(fā)率間的回歸方程。圖2 緩慢脫水和快速脫水條件下不同大、小遼東櫟種子的萌發(fā)率及其與含水量的關(guān)系

表2 脫水對(duì)不同大、小遼東櫟種子的萌發(fā)速率、萌發(fā)指數(shù)和活力指數(shù)的影響

注：同行中相同萌發(fā)參數(shù)的不同字母表示差異顯著(p<0.05)。

2.4 不同脫水處理種子的萌發(fā)速率、萌發(fā)指數(shù)和活力指數(shù)

由表2可以看出，未脫水大、小種子的萌發(fā)速率差異顯著(p<0.05)；不論是緩慢脫水還是快速脫水，大、小種子萌發(fā)速率在脫水前期階段均快速降低；大、小種子萌發(fā)速率在緩慢脫水自24 h至脫水36 h和快速脫水自24 h至脫水48 h均大幅降低(p<0.05)。大種子萌發(fā)速率在緩慢脫水的多數(shù)階段均不同程度地大于小種子，但不同大、小種子間僅在脫水的最后階段(336 h后)差異顯著(p<0.05)；在快速脫水過(guò)程中，大種子萌發(fā)速率始終大于小種子，不同大、小種子間的差異在脫水48 h后達(dá)顯著水平(p<0.05)。

在緩慢脫水24 h前的各階段，大、小種子萌發(fā)指數(shù)緩慢降低，脫水36 h后顯著降低(p<0.05)，脫水336 h后，大、小種子萌發(fā)指數(shù)分別為1.23和0.76。萌發(fā)指數(shù)在快速脫水4 h前期略有波動(dòng)，但在脫水8 h后均大幅降低(p<0.05)，脫水72 h后分別為2.06和1.78。未脫水時(shí)大種子萌發(fā)指數(shù)顯著大于小種子(p<0.05)，不同大、小種子間的差異在脫水后期階段達(dá)顯著水平(p<0.05)。

在緩慢脫水72 h前，活力指數(shù)呈波動(dòng)性增大趨勢(shì)，大、小種子分別在脫水72 h和12 h后最大，脫水120 h后大幅降低(p<0.05)。不同大、小種子的活力指數(shù)在快速脫水24 h前均顯著增大(p<0.05)，大、小種子分別在脫水2，4 h后最大，但在脫水48 h后均大幅減小(p<0.05)。未脫水大、小種子的活力指數(shù)差異顯著(p<0.05)，在緩慢脫水72 h后的各脫水階段和多數(shù)快速脫水階段，大種子均顯著大于小種子(p<0.05)。

3 討 論

頑拗性種子對(duì)脫水反應(yīng)敏感的主要原因可能與其缺乏正常性種子所擁有的代謝關(guān)閉機(jī)制有關(guān)，即在發(fā)育過(guò)程中未經(jīng)歷成熟脫水階段，成熟散落時(shí)仍具有較高含水量和代謝活性，且已啟動(dòng)萌發(fā)過(guò)程[2,12]。研究發(fā)現(xiàn)，大、小遼東櫟種子在成熟散落時(shí)均具有較高含水量(分別為1.03，1.00 g/g)和萌發(fā)率(分別為97.5%，95.8%)，盡管萌發(fā)率和活力指數(shù)在脫水前期有一定程度提高，但不論是緩慢脫水還是快速脫水，隨著脫水時(shí)間的延長(zhǎng)，所有萌發(fā)參數(shù)均在脫水后期階段顯著減小，即表現(xiàn)出頑拗性本質(zhì)[1,4]。頑拗性種子的含水量可能存在臨界值，一旦含水量低于這一臨界值，種子活力迅速下降。例如，滇南紅厚殼(Calophyllumpolyanthum)種子脫落時(shí)含水量達(dá)鮮重的45%，當(dāng)含水量降至30%以下時(shí)，存活率迅速下降[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，遼東櫟大種子在緩慢脫水336 h和快速脫水72 h后至含水量(0.58 g/g)一致時(shí)，萌發(fā)率仍相對(duì)較高(分別為66.7%，79.1%)，而小種子在緩慢脫水120 h和快速脫水72 h后至含水量(0.52 g/g)一致時(shí)，萌發(fā)率分別為70.8%和66.7%，即在緩慢脫水和快速脫水間發(fā)生了逆轉(zhuǎn)，表明不同大、小種子的臨界含水量可能存在差異。但由于本研究沒(méi)有設(shè)計(jì)更長(zhǎng)時(shí)間的脫水處理，還難以準(zhǔn)確界定其臨界含水量范圍，有待于進(jìn)一步深入研究。

輕度脫水可通過(guò)破壞種子內(nèi)萌發(fā)抑制物的合成或開(kāi)啟某些與萌發(fā)相關(guān)的代謝過(guò)程而促進(jìn)種子萌發(fā)[14]，即輕度脫水可終止與種子發(fā)育相關(guān)的合成過(guò)程而加速種子后熟，從而開(kāi)啟萌發(fā)啟動(dòng)的“開(kāi)關(guān)”。本研究中，在脫水前期階段水分輕度丟失也均促進(jìn)不同大、小遼東櫟種子的萌發(fā)，但隨著脫水時(shí)間延長(zhǎng)，萌發(fā)率和其他萌發(fā)參數(shù)均持續(xù)降低。這可能是輕度脫水促進(jìn)幼苗建立的適應(yīng)性反應(yīng)，因?yàn)榉N子快速萌發(fā)可使種子通過(guò)伸長(zhǎng)的胚根獲得外界環(huán)境中的水分，從而緩解脫水傷害。

不同大、小種子的脫水耐性可能存在差異并影響種子活力，生產(chǎn)頑拗性種子的植物可在同一植株內(nèi)或不同植株間產(chǎn)生不同大小的種子，通過(guò)改變其比表面積以在一定程度上適應(yīng)環(huán)境變化[9]。遼東櫟大種子的含水量和萌發(fā)率在緩慢脫水和快速脫水過(guò)程中始終顯著高于小種子；盡管大、小種子的萌發(fā)率僅在脫水后期(脫水48 h)差異顯著，但大種子的萌發(fā)速率、萌發(fā)指數(shù)和活力指數(shù)均顯著大于小種子，且不同大、小種子的所有萌發(fā)參數(shù)在脫水后期均差異顯著，表明大種子的脫水耐性更強(qiáng)，不同大、小種子比表面積的變化可能是產(chǎn)生這一結(jié)果的主要原因，因?yàn)榇蠓N子的比表面積較小，脫水相對(duì)較慢，受到的傷害積累也較小[15]。

頑拗性種子的脫水耐性還與脫水速率密切相關(guān)，快速脫水可使頑拗性種子在脫水到較低含水量時(shí)仍保持較高活力[5,7]，因?yàn)樗衷诜N子內(nèi)部保持的時(shí)間越長(zhǎng)，脫水傷害對(duì)種子發(fā)生劣變的影響就越大[6]，快速脫水可縮短種子在中間含水量下停留的時(shí)間，從而減少種子代謝脅迫積累[6,16]，已報(bào)道的假檳榔(Archontophoenixalexandrae)[16]、木菠蘿[7]和橡膠樹(shù)(Heveabrasiliensis)[6]等熱帶地區(qū)典型頑拗性種子均對(duì)不同脫水速率表現(xiàn)出類(lèi)似反應(yīng)。遼東櫟大種子在緩慢脫水120 h和快速脫水48 h后，含水量基本一致時(shí)，快速脫水種子的所有萌發(fā)參數(shù)均不同程度地大于緩慢脫水，尤其在緩慢脫水336 h和快速脫水72 h (含水量均為0.58 g/g)后，后者的所有萌發(fā)參數(shù)均顯著大于前者，即遼東櫟大種子的脫水行為與上述研究者的結(jié)果基本一致。然而，小種子在緩慢脫水120 h和快速脫水72 h后至相同含水量(0.52 g/g)時(shí)，萌發(fā)參數(shù)均在緩慢脫水時(shí)更大，類(lèi)似的結(jié)果其他研究也有報(bào)道[9]，這可能與不同大小種子的頑拗性差異有關(guān)，因?yàn)轭B拗性種子的脫水耐性是一種具有漸變、過(guò)渡和數(shù)量特性的復(fù)合數(shù)量性狀[17]，不同植物種子頑拗性有高度、中度和輕度之分，甚至同一種植物種子也有頑拗性程度的差異[18]。此外，本研究所設(shè)置的脫水處理可能還未能脫水至種子臨界含水量，使不同脫水速率對(duì)種子萌發(fā)率的負(fù)面影響在一定程度上被種子的抗氧化系統(tǒng)所抵消[19]，具體機(jī)制還有待于進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，輕度脫水促進(jìn)遼東櫟種子的萌發(fā)，但在緩慢脫水和快速脫水條件下，不同大、小遼東櫟種子的活力均隨著脫水時(shí)間延長(zhǎng)和含水量減少而降低，屬頑拗性種子；遼東櫟大種子的脫水耐性高于小種子，大種子的含水量和萌發(fā)率在脫水處理過(guò)程中始終顯著高于小種子，且前者的所有萌發(fā)參數(shù)在脫水處理的后期均顯著大于后者；遼東櫟大種子在快速脫水條件下比在緩慢脫水條件下具有更強(qiáng)的脫水耐性。