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(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)臟象理論及應(yīng)用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,遼寧 沈陽(yáng) 110847)

化療是目前治療惡性腫瘤的手段之一，但其化療產(chǎn)生的副作用也逐漸顯現(xiàn)?；熛嚓P(guān)性疲勞(Chemotherapy-induced Fatigue，CIF)目前越來(lái)越引起人們的重視，它主要表現(xiàn)為化療后出現(xiàn)乏力、失眠、抑郁等多方面擾亂機(jī)體正常功能的心理和行為癥狀，嚴(yán)重影響著患者的身心健康，甚至還會(huì)影響治療效果?；熛嚓P(guān)性疲勞的特點(diǎn)是發(fā)生快、程度重、持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)、不能通過(guò)休息緩解。目前對(duì)CIF發(fā)生的具體機(jī)制尚未有明確的闡述，也未發(fā)現(xiàn)能夠有效預(yù)防或治療CIF的藥物。有關(guān)研究表明一些常見的化療藥物(如5-氟尿嘧啶、依托泊苷、多柔比星等)可刺激機(jī)體釋放多種炎性因子如TNF-α等，使機(jī)體發(fā)生一系列生理病理改變[1]。但究竟炎癥因子的分泌是否是化療后產(chǎn)生疲勞的發(fā)生機(jī)制之一還尚未明了。因此,本研究的目的是通過(guò)5-氟尿嘧啶進(jìn)行造模，初步探究CIF模型中TNF-α的分泌情況，并利用歸脾湯對(duì)其進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)，探討其可能的機(jī)制。

歸脾湯始載于宋代嚴(yán)用和《濟(jì)生方》,主治心脾兩虛之健忘、怔忡。元代危亦林《世醫(yī)得效方》增補(bǔ)治療脾不統(tǒng)血而妄行之吐血下血。明代薛立齋《校注婦人良方》在原方中增加了當(dāng)歸、遠(yuǎn)志兩味,一直沿用至今。歸脾湯為中醫(yī)經(jīng)典名方,在臨床各科得到廣泛應(yīng)用[2]。歸脾湯由人參、白術(shù)、黃芪、當(dāng)歸、甘草、茯神、遠(yuǎn)志、酸棗仁、木香、龍眼肉、生姜、大棗組成，其中黃芪、龍眼為君補(bǔ)血養(yǎng)心；人參、白術(shù)、當(dāng)歸為臣補(bǔ)氣健脾；茯神、酸棗仁、遠(yuǎn)志、木香為佐寧心安神；炙甘草為使調(diào)和諸藥，加姜棗調(diào)和脾胃，諸藥合用，具有益氣補(bǔ)血、健脾養(yǎng)心的作用[3]?；熛嚓P(guān)性疲勞，從中醫(yī)學(xué)角度來(lái)看，可歸屬于中醫(yī)“虛勞”的范疇，我們認(rèn)為其發(fā)生的機(jī)制與中醫(yī)脾的功能有關(guān)，而歸脾湯具有健脾的功能，因此，探究歸脾湯是否能改善化療相關(guān)性疲勞及其初步作用機(jī)制是我們研究的重點(diǎn)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)健康C57BL/6小鼠，6周齡，雌雄各半，共80只。(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證號(hào)SCXK(京)2012-0001，于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng))

1.2 主要試劑與藥物

5-氟尿嘧啶(5-Fu)(天津金耀氨基酸有限責(zé)任公司，20151003)，香菇菌多糖片(江蘇長(zhǎng)江藥業(yè)有限公司)，歸脾湯(藥用白術(shù)30 g、人參15 g、黃芪30 g、當(dāng)歸15 g、炙甘草8 g、茯神30 g、遠(yuǎn)志15 g、酸棗仁30 g、木香15 g、龍眼肉30 g；購(gòu)于國(guó)大藥房，常規(guī)煎煮，濃縮為終濃度1 g/mL)[4]，TNF-α檢測(cè)試劑盒(武漢優(yōu)爾生公司，L160607273)。

1.3 主要儀器

大小鼠抓力測(cè)定儀(濟(jì)南益延科技發(fā)展有限公司，型號(hào)YLS-13A)，全自動(dòng)酶標(biāo)儀(奧地利Anthos公司，17550型)，電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠，HXP-9052MBE型)，離心機(jī)(法國(guó)Jouan 公司，C4-12型)。

2 方法

2.1 分組及造模、灌胃方法

2.1.1 實(shí)驗(yàn)分組 將小鼠隨機(jī)分成4組，即空白對(duì)照組(A組)、化療疲勞組(B組)、香菇多糖組(C組)、歸脾湯組(D組)每組各20只。實(shí)驗(yàn)前正常預(yù)養(yǎng)1周。

2.1.2 CIF模型制備及灌胃方法 參考文獻(xiàn)[5]方法，將除A組以外的小鼠腹腔注射5-氟尿嘧啶(5-Fu)，劑量為40 mg/kg，每天給藥1次，連續(xù)5天。同時(shí)，空白對(duì)照組給予生理鹽水腹腔注射。造模前兩天C組給予2 mg/kg香菇多糖0.5 mL/只、D組給予歸脾湯灌胃(0.3 mL/10g·BW)，A組和B組等量生理鹽水灌胃0.5 mL/只，共14天。第15天處死取腹腔巨噬細(xì)胞、脾和胸腺。

2.2 觀察歸脾湯對(duì)CIF模型疲勞狀況的影響

2.2.1 小鼠體重變化 每6天測(cè)一次各組小鼠體重。

2.2.2 抓力測(cè)定 先用右手將鼠放在抓力儀上，左手向前推抓力板，然后右手向后滑至鼠尾，左手輕輕松開抓力板，待鼠用力抓住抓力板時(shí)，及時(shí)加力向后拉，以得到最大抓力。

2.3 觀察歸脾湯對(duì)CIF模型TNF-α分泌的影響

2.3.1 腹腔巨噬細(xì)胞提取和培養(yǎng) 實(shí)驗(yàn)前三天，向小鼠腹腔內(nèi)注入6 %無(wú)菌淀粉肉湯lmL，以刺激聚集大量的巨噬細(xì)胞。頸椎脫臼處死小鼠，將其全部浸入75 %乙醇中浸泡5 min。注射器吸取5 mL PBS液注入小鼠腹腔中，同時(shí)用手指從兩側(cè)壓揉腹膜壁，使液體在腹腔內(nèi)流動(dòng)。用針頭輕輕挑起腹壁并微微傾向一側(cè)，使腹腔中液體集中于針頭下，將腹腔液吸取入針管內(nèi)。小心拔出針頭，把液體注入離心管。4℃下2 000 rpm離心10 min后，棄上清，加3 mL含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液。計(jì)數(shù)細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL。每孔加入100 μL細(xì)胞懸液，空白對(duì)照孔只加100 μL含10 %胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液。37 ℃，5 %CO2培養(yǎng)箱中孵育2h，倒置顯微鏡下觀察。除去未貼壁細(xì)胞，PBS液沖洗1～2次。每孔加入含10 %胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，置37 ℃，5 %CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后取培養(yǎng)上清液。

2.3.2 炎性細(xì)胞因子TNF-α的水平檢測(cè) 取腹腔巨噬細(xì)胞，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書步驟操作，觀察各組TNF-α的分泌水平。

2.4 統(tǒng)計(jì)方法

3 結(jié)果

3.1 歸脾湯對(duì)CIF小鼠體重的影響

由表1可見，實(shí)驗(yàn)初始時(shí)，各組小鼠的體重?zé)o明顯差異。實(shí)驗(yàn)第6天時(shí)，與A組相比，B、C組小鼠的體重均顯著低于A組(均P<0.01)，而D組小鼠經(jīng)過(guò)歸脾湯的治療，體重明顯高于B組(P<0.01)。實(shí)驗(yàn)第12天時(shí)，B組與C組小鼠的體重仍顯著低于A組(均P<0.01)，而D組小鼠體重繼續(xù)增長(zhǎng)，仍顯著高于B組(P<0.01)，且已與A組無(wú)差異(P>0.05)。

組別初始第6天第12天A組23.83±0.7324.40±1.84△△24.21±1.08△△B組23.58±0.7122.01±0.95??21.48±1.37??C組23.23±0.6121.54±1.00??22.20±1.55?D組23.32±1.0823.72±1.15△△24.64±1.20△△

注：**表示與A組相比,P<0.01；△表示與B組相比,P<0.05；△△表示與B組相比,P<0.01。

3.2 歸脾湯對(duì)CIF小鼠抓力的影響

由表2可知，實(shí)驗(yàn)初始時(shí)，各組小鼠的抓力無(wú)明顯差異。實(shí)驗(yàn)第6天時(shí)，與A組相比，B組小鼠抓力顯著降低(P<0.05)，C組小鼠抓力比B組高，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而D組小鼠的抓力明顯高于B組(P<0.01)。實(shí)驗(yàn)第12天時(shí)，除A組小鼠的抓力仍繼續(xù)增長(zhǎng)外，B組基本無(wú)變化，而C組和D組小鼠抓力均比第6天時(shí)有所下降。

3.3 歸脾湯對(duì)CIF小鼠胸腺指數(shù)和脾指數(shù)的影響

由表3可見，B、C、D組小鼠的胸腺指數(shù)均顯著低于A組(均P<0.01)。與B組相比，C組小鼠的胸腺指數(shù)略高于B組，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而D組小鼠的胸腺指數(shù)顯著高于B組(P<0.01)。

組別初始第6天第12天A組189.0±24.5225.2±57.6△248.8±57.3△△B組186.5±27.1179.8±41.4?180.0±39.3??C組187.9±36.9213.0±60.9193.0±62.9?D組184.4±18.0241.2±35.9△△230.3±41.1

注：*表示與A組相比,P<0.05；**表示與A組相比,P<0.01；△表示與B組相比,P<0.05；△△表示與B組相比,P<0.01。

組別胸腺指數(shù)脾指數(shù)A組1.6±0.14△△3.1±0.93B組0.6±0.19?3.0±0.86C組0.8±0.11?3.6±0.33?△△D組1.1±0.14?△△3.8±0.96?△△

注：*表示與A組相比,P<0.01；△表示與B組相比,P<0.05；△△表示與B組相比,P<0.01。

同時(shí)，與A組相比，B組的脾指數(shù)無(wú)明顯變化，但C、D組小鼠的脾指數(shù)均顯著高于A組和B組(P<0.01)。

3.4 歸脾湯對(duì)CIF小鼠TNF-α分泌的影響

由圖1可知，與A組相比，B組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞TNF-α的分泌水平明顯升高(P<0.01)。與B組相比，C組TNF-α的分泌水平降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而D組TNF-α的分泌水平顯著低于B組(P<0.01)。

圖1 歸脾湯對(duì)CIF小鼠TNF-α分泌的影響

組別TNF-αA組126.5±28.04△B組219.4±48.68?C組170.9±38.28D組140.3±33.01△

注：*表示與A組相比,P<0.01；△表示與B組相比,P<0.01。

4 討論

實(shí)驗(yàn)初各組小鼠的體重和抓力無(wú)顯著性差異，B組與C組小鼠的體重在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中均先降低后升高，但仍顯著低于A組(P<0.01)。而D組小鼠的體重一直呈上升趨勢(shì)，在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)的體重與A組已無(wú)差異(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)第6天時(shí)，B組抓力顯著降低，抓力的下降說(shuō)明造模成功。C組小鼠抓力高于B組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，D組小鼠的抓力較B組明顯升高(P<0.01)。這說(shuō)明化療在大幅度消耗體重的同時(shí)也會(huì)損害肌力從而使抓力下降，經(jīng)過(guò)歸脾湯的治療會(huì)使體重和抓力均明顯升高，而香菇多糖的治療效果不如歸脾湯。脾主四肢(肌肉)，歸脾湯具有健脾益氣的作用，所以經(jīng)過(guò)治療后抓力會(huì)上升，而后可能由于物質(zhì)消耗或者化療藥物的毒副作用在小鼠體內(nèi)不斷累積而使小鼠在第12天時(shí)的抓力較第6天時(shí)有所下降。

與A組相比，B、C、D組小鼠的胸腺指數(shù)顯著降低(P<0.01)，這表明化療會(huì)損傷胸腺而使胸腺指數(shù)明顯降低。C組和D組小鼠的胸腺指數(shù)雖低于A組但均高于B組，且D組小鼠的胸腺指數(shù)高于C組，這說(shuō)明經(jīng)過(guò)藥物的治療后會(huì)使胸腺指數(shù)升高，且歸脾湯療效高于香菇多糖。胸腺是T淋巴細(xì)胞發(fā)育成熟的場(chǎng)所，而T淋巴細(xì)胞可通過(guò)細(xì)胞免疫機(jī)制調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫水平，歸脾湯可以使胸腺指數(shù)升高，說(shuō)明歸脾湯對(duì)免疫功能具有一定的促進(jìn)作用[6]。此外，歸脾湯具有益氣養(yǎng)血和健脾的作用，且C組小鼠的脾指數(shù)高于A組,這說(shuō)明歸脾湯對(duì)脾臟有一定的免疫調(diào)節(jié)功能。

TNF-α屬于Th1型細(xì)胞因子，主要由單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，具有極強(qiáng)的促炎作用，可誘發(fā)并加重炎癥反應(yīng)，過(guò)量的TNF-α?xí)鹈庖呦到y(tǒng)功能的紊亂從而對(duì)機(jī)體產(chǎn)生損傷反應(yīng)[7]。此外，TNF-α在介導(dǎo)機(jī)體感染免疫、腫瘤免疫、自身免疫等多方面均發(fā)揮著重要的作用[8]。B組小鼠TNF-α的分泌水平明顯升高可能是CIF的發(fā)病機(jī)制之一，而經(jīng)過(guò)歸脾湯治療后，TNF-α的分泌明顯降低，接近但不能恢復(fù)到正常水平，說(shuō)明歸脾湯有一定的降低TNF-α分泌水平的作用。

化療引起的相關(guān)性疲勞，從中醫(yī)學(xué)角度看，可歸屬于中醫(yī)“虛勞”的范疇。虛勞時(shí)人體處于臟腑氣血陰陽(yáng)虧虛的狀態(tài)，而中醫(yī)認(rèn)為，“脾胃為氣血生化之源”。脾胃的化源不足、升降失司會(huì)引起功能的異常，從而有身重體倦、四肢乏力及免疫力低下的表現(xiàn)。歸脾湯具有顯著的健脾功能，可以通過(guò)提高胸腺指數(shù)、脾指數(shù)并降低TNF-α的分泌水平，提高機(jī)體免疫力，從而有效緩解化療引起的相關(guān)性疲勞，更深入的機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。