， *，，， ，

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530200；2.廣西壯族自治區(qū)食品藥品檢驗(yàn)所，廣西 南寧 530021)

龍眼葉藥材是龍眼屬龍眼(DimocarpuslonganLour.)的葉或嫩芽。味甘、淡，性平，具有發(fā)表清熱、利濕解毒之功效，主治感冒發(fā)熱、瘧疾、疔瘡、濕疹等[1]?，F(xiàn)代藥理研究表明龍眼葉具有很好的降血糖作用[2]。我國(guó)南方龍眼葉資源蘊(yùn)藏量豐富，國(guó)內(nèi)外關(guān)于龍眼葉降糖作用的研究報(bào)道較少。糖尿病是一種由多種病因引起的以慢性高血糖為特征的代謝紊亂性疾病[3]。人體血糖主要來(lái)源于食物中的糖類(lèi)和碳水化合物，當(dāng)過(guò)多的食物在體內(nèi)轉(zhuǎn)換成血糖供人體吸收后，人體就表現(xiàn)為高血糖狀態(tài)，進(jìn)而發(fā)展成為糖尿病。α-葡萄糖苷酶的作用是阻止食物中的糖類(lèi)和碳水化合物轉(zhuǎn)化成單糖而被吸收，從而降低血糖水平。α-葡萄糖苷酶抑制劑是目前用于臨床的口服降糖藥，能有效地控制餐后血糖[4]，由于其存在胃腸道不良反應(yīng)，因此，更安全有效的天然α-葡萄糖苷酶抑制劑研究成為熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)對(duì)龍眼葉用乙醇提取后，分別用不同溶劑萃取，得到石油醚提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物和水提取物，研究其對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

infinite M200 PRO酶標(biāo)儀；LRH-250-S 恒溫恒濕培養(yǎng)箱(韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司)；KQ-500DA超聲儀(昆山市超聲儀器有限公司)；HWS-24電熱恒溫水浴鍋(上海齊欣科學(xué)儀器有限公司)

1.2 試藥

龍眼葉藥材采自廣西賀州市，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)滕建北副教授鑒定為DimocarpuslonganLour.的葉。標(biāo)本存放于廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥物分析教研室。α-葡萄糖苷酶( G5003-100UN Sigma 公司，批號(hào)SLBS9070)；對(duì)硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷( PNPG，Sigma 公司，批號(hào)BCBR9743V) ；對(duì)硝基苯酚(PNP，天津市大茂化學(xué)試劑廠，批號(hào)：20170301)；還原型谷胱甘肽(GSH，Sigma 公司，批號(hào)213E053)；阿卡波糖( Acarbose，拜耳公司，批號(hào)BJ33686) ；二甲基亞砜(DMSO)、無(wú)水碳酸鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀均為分析純。

2 方法

2.1 龍眼葉不同提取物的制備

取龍眼葉粉末20g，用10倍量75%乙醇超聲提取1.5h，用50%乙醇超聲提取1h。冷卻，過(guò)濾，合并濾液濃縮成乙醇總提取物。加水混懸，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，濃縮萃取液，即得石油醚提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物、水提取物。

2.2 α-葡萄糖苷酶活性研究

將龍眼葉各提取物用DMSO溶解，并儲(chǔ)存于4℃冰箱中，以文獻(xiàn)[5-6]方法，活性檢測(cè)在96微孔板上進(jìn)行，反應(yīng)體系如下：取pH=6.8的磷酸鉀緩沖液50 μL，分別加入GSH 10 μL，樣品10 μL，0.57 U/mL α-葡萄糖苷酶5 μL，37 ℃恒溫反應(yīng)15 min，加入濃度為20 mmol/L PNPG 20 μL，37 ℃恒溫反應(yīng)15 min，再加入濃度為0.2 mol/L的NaCO3溶液40 μL，于400 nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值，每個(gè)樣品平行測(cè)定5次。以阿卡波糖為陽(yáng)性對(duì)照，按下式計(jì)算抑制率，并用SPSS22.0軟件求出相應(yīng)IC50值。

酶活性抑制率(%)=[A空白-(A樣品-A背景)]/A空白×100

注：A空白:無(wú)樣品加入反應(yīng)的吸光值；A樣品:加入樣品反應(yīng)的吸光值；A背景:無(wú)酶液加入的吸光值。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

根據(jù)采用的反應(yīng)體系，用磷酸鉀緩沖液(pH=6.8)配置1 000 μmol/L PNP，分別稀釋成400 μmol/L、300 μmol/L、200 μmol/L、100 μmol/L、80 μmol/L、40 μmol/L、20 μmol/L、0 μmol/L。分別取9種不同濃度的PNP溶液各160 μL，加入0.2 mol/L NaCO3溶液80 μL，混勻，在400 nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值，測(cè)3組取平均值。以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，PNP濃度為橫坐標(biāo)，做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3 結(jié)果

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

PNP標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的回歸方程為y=0.007 2x+0.098 9，R2=0.999 5，說(shuō)明PNP在0～1000 μmol/L與OD值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 PNP標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.2 龍眼葉提取物不同質(zhì)量濃度對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響

龍眼葉提取物不同質(zhì)量濃度對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響結(jié)果表明，5個(gè)不同提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性與濃度呈正量效關(guān)系，即劑量依賴(lài)性，抑制活性隨濃度提高而增強(qiáng)，其中乙酸乙酯提取物的濃度在0.1～1mg/mL范圍內(nèi)呈直線增加，當(dāng)濃度增加到一定時(shí)，濃度只有很小變化。在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，阿卡波糖的抑制率也隨濃度的增加而增加，而龍眼葉乙酸乙酯提取物及正丁醇提取物在此范圍內(nèi)抑制率均比陽(yáng)性對(duì)照抑制率高。結(jié)果見(jiàn)表1、圖2。

表1 龍眼葉提取物不同質(zhì)量濃度對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性 (n=5)

圖2 龍眼葉不同提取物濃度對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性

3.3 龍眼葉不同提取物的活性比較

由表2可知，在同一濃度下(0.5 mg/mL)，以阿卡波糖為陽(yáng)性對(duì)照，α-葡萄糖苷酶抑制活性結(jié)果顯示，龍眼葉乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物抑制率分別達(dá)到68.69 %(IC50=0.105 2 mg/mL)、66.85 %(IC50=0.126 1 mg/mL)，均高于陽(yáng)性對(duì)照藥阿卡波糖的63.57 %(IC50=0.196 0 mg/mL)。龍眼葉不同提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性從大到小依次為：乙酸乙酯提取物>正丁醇提取物>阿卡波糖>乙醇總提取物>石油醚提取物>水提取物。結(jié)果見(jiàn)表2、圖3。

表2 龍眼葉不同提取物α-葡萄糖苷酶抑制活性 (n=5)

圖3 不同提取物α-葡萄糖苷酶抑制活性比較

4 討論

本實(shí)驗(yàn)在體外實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，首次發(fā)現(xiàn)龍眼葉乙酸乙酯提取物及正丁醇提取物具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的作用，龍眼葉乙酸乙酯提取物抑制率為為68.69%，正丁醇提取物抑制率66.85%，兩個(gè)部位的提取物抑制率都比阿卡波糖(63.57%)高。實(shí)驗(yàn)還探討了不同質(zhì)量濃度對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響，結(jié)果表明，在一定范圍內(nèi)，抑制活性與濃度呈正相關(guān)，即隨著濃度的增高，抑制活性也不斷增強(qiáng)，但隨著濃度超過(guò)一定范圍，抑制率僅有很小程度的變化，說(shuō)明濃度越高，抑制活性并非一直增強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明龍眼葉乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物均通過(guò)抑制α-葡萄糖苷酶而實(shí)現(xiàn)降血糖作用。