楊愛霞，吳彪，何偉，胡必成，黃鶴歸，徐蕾，張力凡

(武漢市第一醫(yī)院1.藥學(xué)部；2.胃腸外科；3.實(shí)驗(yàn)中心，武漢 430022)

結(jié)直腸癌是全球發(fā)病率最高的三大常見癌癥之一[1]，發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢[2]。目前的治療方法主要有手術(shù)切除、輔助化療和放射治療(放療)等[3]。研究者們發(fā)現(xiàn)一些藥物能夠通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生壞死性凋亡達(dá)到廣譜抗腫瘤作用。壞死性凋亡(necroptosis)是區(qū)別于壞死和凋亡的一種新的死亡方式，是非Caspase依賴的程序性死亡，在腫瘤和心血管、神經(jīng)退行性疾病[4-5]的發(fā)生發(fā)展中有著重要意義。黃芩苷具有明顯的抗腫瘤作用，可以通過多途徑來產(chǎn)生抗腫瘤作用[6-7]，包括抗癌、抗炎、抗氧化和神經(jīng)保護(hù)等[8-11]。黃芩苷是從中藥黃芩中提取的一種黃酮類化合物[12]，具有明顯的抗癌作用。筆者通過體外實(shí)驗(yàn)觀察黃芩苷誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞發(fā)生壞死性凋亡，為黃芩苷臨床抗腫瘤應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1儀器 流式細(xì)胞儀(德國Leica公司，型號(hào)：FACSVantage SE)；激光共聚焦熒光顯微鏡(德國Leica公司，型號(hào)：TCS SP5)；倒置顯微鏡(日本 OLYMPUS公司，型號(hào)：IX71)、照像系統(tǒng)(日本 OLYMPUS公司)；QPCR設(shè)備(Funglyn Biotech公司，型號(hào)：FTC2000)；Western blotting設(shè)備(BIO-RAD公司) ；二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱(日本三洋公司)；多功能酶標(biāo)儀(美國 Thermo Fisher公司)；細(xì)胞培養(yǎng)瓶及細(xì)胞培養(yǎng)板購于美國Costar公司；PHILIPS TECNAI-10透射電子顯微鏡(荷蘭飛利浦公司)。

1.2試劑 黃芩苷購自中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110715，含量：93.3%，使用二甲亞砜(DMSO)配制成濃度為100 μmol·L-1的溶液。RPMI 1640 培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Gibco公司，胰蛋白酶、青霉素-鏈霉素溶液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；磷酸鹽緩沖液(PBS，北京中杉公司)； DMSO(美國Amresco公司)；CCK-8試劑盒(貨號(hào)：96992)購于美國Sigma公司；碘化丙啶(PI，貨號(hào)：ST511)、DAPI(貨號(hào)：C1006) 染色液、抗熒光淬滅劑均購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；一抗：RIP3(兔來源)(貨號(hào)：ab62344)、內(nèi)參一抗β-actin(兔來源)購于美國Abcam公司；二抗：羊抗兔購于美國IgGAbcam公司。 z-VAD-fmk(Caspases抑制劑，貨號(hào)：187389-52-2)。

1.3細(xì)胞株 小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞CT26.WT細(xì)胞系，購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.4細(xì)胞培養(yǎng)及分組 將細(xì)胞培養(yǎng)于含10%優(yōu)質(zhì)胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)基中，2～3 d換液1次，細(xì)胞80% 融合度時(shí)傳代，可按照1∶3傳代比例進(jìn)行，于37 ℃，5% CO2及飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞分組：①正常對照組，加入新鮮培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)；②黃芩苷組，加入100 μmol·L-1黃芩苷；③ z-VAD-fmk組，加入20 μmol·L-1z-VAD-fmk抑制劑；④聯(lián)合用藥組，加入終濃度為 20 μmol·L-1z-VAD-fmk1 h后加入100 μmol·L-1黃芩苷，繼續(xù)培養(yǎng)72 h后收集樣本作為藥物模型(100 μmol·L-1黃芩苷)進(jìn)行后續(xù)檢測。

1.5CCK8法檢測CT26.WT細(xì)胞存活率 收集生長狀態(tài)良好的CT26.WT細(xì)胞，計(jì)數(shù)調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105·mL-1，每組細(xì)胞設(shè)復(fù)孔3個(gè)，將96孔板移入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，孵育過夜，使細(xì)胞完全貼壁。將96孔板移入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(37 ℃，5%CO2)，培養(yǎng)適當(dāng)時(shí)間(24，48，72 h)。每孔加入CCK-8溶液10 μL，于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h。用多功能酶標(biāo)儀測定在450 nm處吸光度值。z-VAD-fmk預(yù)處理>1 h，將黃芩苷與抑制劑聯(lián)合使用，加入96孔板中再進(jìn)行檢測。

細(xì)胞活力(%)=(A實(shí)驗(yàn)組-A空白組)/(A對照組-A空白組)×100%，細(xì)胞抑制率(%)=1-細(xì)胞活力。

1.6PI單染流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測細(xì)胞死亡率 將處于對數(shù)生長期的CT26.WT細(xì)胞用6孔板培養(yǎng)，待細(xì)胞生長達(dá)到60%～70%，吸出舊培養(yǎng)基，按上述分組加藥分別再繼續(xù)培養(yǎng)8，16，24，32 h后，把細(xì)胞培養(yǎng)液吸出至合適離心管內(nèi)，PBS洗滌貼壁細(xì)胞一次，加入適量胰酶細(xì)胞消化液消化細(xì)胞。室溫孵育至輕輕吹打可以使貼壁細(xì)胞吹打下來時(shí)，吸除胰酶細(xì)胞消化液。需避免胰酶過度消化，加入之前收集的細(xì)胞培養(yǎng)液，混勻，轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，1000×g離心5 min，棄去上清液，收集細(xì)胞，用PBS輕輕重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)。加入PI染色液10 μL，輕輕混勻，冰浴避光放置。隨即進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測。

1.7用DAPI染色檢測CT26.WT細(xì)胞核的變化 細(xì)胞經(jīng)過洗滌，在培養(yǎng)板中將已制備完成的細(xì)胞爬片用1×PBS浸洗3次，每次3 min；固定：用4%多聚甲醛(PBS配制)常溫固定細(xì)胞爬片15 min。洗滌：1×PBS浸洗細(xì)胞爬片3次，每次3 min，吸水紙吸干殘留較多的PBS。染核：滴加DAPI避光孵育5 min，對標(biāo)本進(jìn)行染核，1×PBS浸洗爬3次，每次3 min，洗去多余DAPI。用吸水紙吸干爬片上的殘留PBS，用含抗熒光淬滅劑封片；然后在激光掃描聚焦顯微鏡下觀察采集圖像。

1.8透射電鏡觀察CT26.WT細(xì)胞死亡形式 將固定好的組織樣本做透射電子顯微鏡觀察組織細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器形態(tài)變化。透射電子顯微鏡由華中科技大學(xué)電子顯微鏡室提供技術(shù)支持。對CT26.WT細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，待細(xì)胞生長增殖良好，并有8個(gè)10 cm2瓶皿70%細(xì)胞量時(shí)，對細(xì)胞分組，分別進(jìn)行以上加藥處理72 h。收集：將細(xì)胞用胰酶消化，調(diào)整濃度為(1～5)×105·mL-1，轉(zhuǎn)移到EP管中，3000 r·min-1(有效離心半徑10 cm)離心3 min，棄去上清液。依次用4 ℃，2.5%戊二醛2 h，1%四氯化鋨25～30 min進(jìn)行固定，用PBS洗2遍，每次10 min，將固定的細(xì)胞團(tuán)塊移入滅菌的青霉素小瓶中。再依次用50%，70%丙酮溶液各1次，90%丙酮2次，100%丙酮3次，每次12 min，進(jìn)行脫水。棄去殘余脫水劑，室溫下依次加入丙酮-EPON812包埋劑3～4 mL，維持30 min、純包埋劑1～2 mL，反應(yīng)2 h，進(jìn)行完全包埋。在60 ℃烤箱下烘烤24 h，混合包埋劑包埋的樣品直至固化為包埋硬塊。用超薄切片機(jī)將標(biāo)記好包埋硬塊切為厚度約1 μm的半薄切片。經(jīng)干燥、染色、再次切片、形成薄膜、再染色，用醋酸雙氧鈾染色液及鉛染色液于室溫下各染色10，12 min，沖洗并用濾紙吸干后用透射電子顯微鏡仔細(xì)觀察樣品細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。

1.9QPCR法檢測細(xì)胞RIP3 mRNA的變化 將分組細(xì)胞勻漿：對于貼壁生長的細(xì)胞，可將培養(yǎng)基棄除后，直接將總RNA提取劑TRIzol試劑加到培養(yǎng)板中。每10 cm2加入TRIzol試劑1 mL，用微量加樣吸頭反復(fù)吹打勻漿，直至細(xì)胞全部溶化。將上述勻漿液室溫放置5 min，待核酸和蛋白充分解離。每毫升TRIzol 試劑用量的勻漿液中加入三氯甲烷0.2 mL，蓋緊管蓋，手動(dòng)劇烈震搖15 s，然后室溫靜置2～3 min。4 ℃，10 000 r·min-1(有效離心半徑10 cm)離心10 min。將上清液棄除，每管加入75%乙醇1 mL潤洗，蓋緊管蓋，輕輕晃動(dòng)試管，以去除殘留的異丙醇和鹽份。4 ℃ 7 500 r·min-1(有效離心半徑10 cm)離心5 min。將上清液棄除，打開管蓋，將RNA 沉淀干燥(室溫?fù)]發(fā)或真空干燥)。將RNA 沉淀溶解于適量(20～50 μL)的無RNase水中。QPCR法檢測各組RIP3mRNA表達(dá)水平。CT值表示每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。△Ct=目的基因Ct-內(nèi)參基因Ct，相對表達(dá)量=2(-△Ct)，相對比值=目的基因相對拷貝數(shù)/內(nèi)參基因相對拷貝數(shù)。

1.10Western blotting 法檢測CT26.WT細(xì)胞壞死性凋亡相互作用蛋白R(shí)IP3蛋白表達(dá) 總蛋白提?。杭?xì)胞裂解貼壁細(xì)胞，棄掉培養(yǎng)基，用PBS洗1次。懸浮細(xì)胞，收集細(xì)胞離心，PBS洗1次。通常每106個(gè)細(xì)胞加細(xì)胞組織快速裂解液RIPA緩沖液0.1 mL。裂解液和細(xì)胞充分接觸冰上放置，用槍頭輕輕吹打，使細(xì)胞充分裂解。再輕輕傾斜培養(yǎng)皿，然后將其轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管，劇烈振蕩30 s。4 ℃，12 000 r·min-1(有效離心半徑10 cm)，離心15 min，吸取上清液，電泳。電壓80 V跑過濃縮膠后轉(zhuǎn)換至120 V，待溴酚藍(lán)跑至膠板底部剛好沒有跑出即可。將夾子打開使黑的一面保持水平，在上面依次墊海綿墊、濾紙、膠、PVDF膜(經(jīng)甲醇活化)、濾紙、海綿墊；同時(shí)將電泳液換成轉(zhuǎn)移液。將電流調(diào)整到恒流200 mA，轉(zhuǎn)移1～3 h。取出膜，并做好正反面標(biāo)記，在TBST中清洗1 min，然后用5%脫脂牛奶封閉液室溫封閉2 h。用封閉液將對應(yīng)一抗稀釋成一定的濃度(1：500)，內(nèi)參一抗的稀釋終濃度為1：1000，然后溫育1.5 h或4 ℃孵育過夜。用TBST洗3次，每次5 min。用封閉液將二抗稀釋成一定的濃度(1：1000)，然后溫育1.5 h。用TBST清洗4次，每次5 min。曝光。將電致化學(xué)發(fā)光(electrochemilu-cminesence，ECL)曝光液按A液：B液1：1混勻后均勻覆蓋在整片膜上，反應(yīng)2 min，放入曝光儀曝光檢測。

2 結(jié)果

2.1黃芩苷對小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞CT26.WT的增殖抑制作用 隨著黃芩苷濃度的增加和作用時(shí)間的延長，CT26.WT細(xì)胞的存活率明顯降低(圖1)。黃芩苷濃度為100 μmol·L-1時(shí)，24，48，72 h細(xì)胞存活率分別為(93.58±1.25)%，(78.55±6.31)%和(44.60±4.89)% 。實(shí)驗(yàn)中將100 μmol·L-1作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)中所用的濃度。在Caspase抑制劑處理 >1 h后，加用黃芩苷100 μmol·L-1處理72 h細(xì)胞的存活率，與正常對照組比較，黃芩苷組和聯(lián)合用藥組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

2.2CT26.WT細(xì)胞的死亡率 PI染色結(jié)果顯示：黃芩苷處理不同時(shí)間后各組細(xì)胞死亡情況，正常對照組細(xì)胞死亡率為(10.54±0.19)%；與對照組比較，黃芩苷組死亡率為(34.93±0.16)%，明顯上升；與黃芩苷組比較，聯(lián)合用藥組死亡率為(23.27±1.20)%，明顯降低(P<0.01)，即Caspase抑制劑降低黃芩苷的作用，抑制劑處理過的細(xì)胞死亡比例明顯下降。z-VAD-fmk組細(xì)胞死亡率為(11.23±0.59)%，與聯(lián)合用藥組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.3CT26.WT細(xì)胞核的改變 細(xì)胞進(jìn)行DAPI染色后，用熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示，DAPI染色呈藍(lán)白色熒光。正常對照組與z-VAD-fmk組細(xì)胞核呈淺藍(lán)色，均勻淡染；與正常對照組比較，黃芩苷組核濃染，出現(xiàn)碎裂現(xiàn)象；與黃芩苷組比較，聯(lián)合用藥組核濃染，有更加明顯核碎裂現(xiàn)象。激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察CT26.WT細(xì)胞圖像見圖3。

A.正常對照組；B.黃芩苷組；C.z-VAD-fmk組；D.聯(lián)合用藥組；與正常對照組比較，*1P<0.01；與z-VAD-fmk組比較，*2P<0.01

A.normal control group；B.baicalin group；C.z-VAD-fmk group；D.baicalin+z-VAD-fmk group；Compared with normal control group，*1P<0.01； Compared with z-VAD-fmk group，*2P<0.01

2.4CT26.WT細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化 用透射電子顯微鏡觀察結(jié)果表明，與正常對照組比較，黃芩苷作用后細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)明顯改變，細(xì)胞破裂。線粒體腫脹、細(xì)胞內(nèi)容物外泄；與黃芩苷組比較，聯(lián)合用藥組細(xì)胞略顯皺縮，染色質(zhì)邊聚，線粒體腫脹程度減弱。透射電鏡觀察CT26.WT細(xì)胞藥物處理后超微結(jié)構(gòu)改變見圖4。

2.5細(xì)胞RIP3 mRNA的表達(dá) 熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，單獨(dú)使用黃芩苷與聯(lián)合抑制劑處理細(xì)胞均能顯著上調(diào)其mRNA表達(dá)(P<0.01)，說明黃芩苷可以上調(diào)細(xì)胞的RIP3 mRNA的表達(dá)；而抑制劑可以減弱RIP3的基因表達(dá)作用(P<0.01)。黃芩苷與聯(lián)合使用Caspase抑制劑z-VAD-fmk對RIP3 mRNA表達(dá)的改變見圖5。

2.6CT26.WT細(xì)胞RIP3蛋白表達(dá)量 Western blotting結(jié)果顯示，與正常對照組比較，黃芩苷可以明顯激活RIP3蛋白的表達(dá)；聯(lián)合用藥也可以激活RIP3蛋白的表達(dá)，而作用弱于黃芩苷；z-VAD-fmk組RIP3蛋白的表達(dá)減弱，黃芩苷組、z-VAD-fmk組與聯(lián)合用藥組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖6。

3 討論

壞死性凋亡是一種與壞死具有相似的形態(tài)學(xué)特征，細(xì)胞體積及胞內(nèi)細(xì)胞器腫脹，包膜完整性破壞，內(nèi)容物外泄，且為非Caspases 依賴性的程序性細(xì)胞死亡，即在泛Caspases 抑制劑(z-VAD-fmk)的條件下，死亡受體與配體的結(jié)合可觸發(fā)壞死性凋亡。 RIP3 是誘導(dǎo)細(xì)胞壞死過程所必需的，而RIP1只有在 RIP3 存在的條件下才能發(fā)揮誘導(dǎo)細(xì)胞壞死的作用，在非Caspase酶依賴性的細(xì)胞壞死中起重要作用。壞死性凋亡的調(diào)節(jié)涉及一系列分子的表達(dá)與活化，RIP3在此過程中發(fā)揮重要的作用[13-14]。

A.正常對照組；B.黃芩苷組；C.z-VAD-fmk組；D.聯(lián)合用藥組

A.正常對照組；B.黃芩苷組；C.z-VAD-fmk組；D.聯(lián)合用藥組

A.正常對照組；B.黃芩苷組；C.z-VAD-fmk組；D.聯(lián)合用藥組；與黃芩苷組比較，*1P<0.01；與z-VAD-fmk組比較，*2P<0.01

A.normal control group；B.baicalin group；C.z-VAD-fmk group；D.baicalin+z-VAD-fmk group；Compared with baicalin group，*1P<0.01； Compared with z-VAD-fmk group，*2P<0.01

采用CCK-8法檢測細(xì)胞活性的改變，經(jīng)過不同處理的4組樣品，結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示黃芩苷可以誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞的死亡；分析方法中采用流式細(xì)胞法檢測細(xì)胞的凋亡情況，源于現(xiàn)有報(bào)道中反映黃芩苷能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。凋亡的發(fā)生均有Caspase酶的參與，因此采用廣譜Caspase抑制劑作為對照，易于觀察出區(qū)別于細(xì)胞的形態(tài)和指標(biāo)的變化，區(qū)別凋亡和壞死性凋亡的發(fā)生。本研究顯示，黃芩苷在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的同時(shí)，細(xì)胞也發(fā)生區(qū)別于凋亡的死亡方式。為證明細(xì)胞在藥物處理后細(xì)胞核也發(fā)生的變化，本實(shí)驗(yàn)中采用DAPI對細(xì)胞核直接染色，隨后在熒光顯微鏡下觀察，經(jīng)過黃芩苷處理過的細(xì)胞，細(xì)胞核濃染，出現(xiàn)明顯的核碎裂現(xiàn)象。采用透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞質(zhì)中線粒體的形態(tài)改變，線粒體發(fā)生明顯的壞死特征，腫脹明顯，并有內(nèi)容物外泄，這是區(qū)別于凋亡的關(guān)鍵特點(diǎn)。RIP3是壞死性凋亡最關(guān)鍵的標(biāo)志性蛋白，通過QPCR和WB法檢測到它的基因和蛋白的表達(dá)明顯增加。

A.正常對照組；B.黃芩苷組；C.z-VAD-fmk組；D.聯(lián)合用藥組；與黃芩苷組比較，*1P<0.05；與z-VAD-fmk組比較，*2P<0.05

圖64組細(xì)胞RIP3蛋白條帶與蛋白表達(dá)情況

A.normal control group；B.baicalin group；C.z-VAD-fmk group；D.baicalin+z-VAD-fmk group；Compared with Baicalin group group，*1P<0.05； Compared with z-VAD-fmk group，*2P<0.05

Fig.6ProteinbandsandproteinexpressionofRIP3infourgroupsofcells

經(jīng)過上述實(shí)驗(yàn)：從細(xì)胞形態(tài)上，細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)的線粒體、細(xì)胞核都發(fā)生形狀的改變；以及壞死性凋亡受體相互作用蛋白R(shí)IP3水平發(fā)生明顯的變化。由于本課題尚未完成，關(guān)于線粒體膜電位、ATP水平、LDH水平將在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中逐步完善。因此，可以初步推斷黃芩苷誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞發(fā)生了壞死性凋亡，且發(fā)現(xiàn)在聯(lián)合使用Caspase抑制劑z-VAD-fmk時(shí)，黃芩苷誘導(dǎo)壞死性凋亡水平有所降低。因此，筆者認(rèn)為：經(jīng)黃芩苷處理后的細(xì)胞在發(fā)生凋亡的同時(shí)，也發(fā)生壞死性凋亡。

隨著對壞死性凋亡研究的深入，在腫瘤對化療藥物引導(dǎo)的細(xì)胞凋亡產(chǎn)生抵抗情形下，研究者將治療腫瘤的方向逐漸轉(zhuǎn)向藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞壞死性凋亡，并發(fā)現(xiàn)一些藥物能夠通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生壞死性凋亡達(dá)到抗腫瘤作用。多種癌癥研究中均發(fā)現(xiàn)，黃芩苷可以通過多條途徑產(chǎn)生抗腫瘤作用。通過本研究加深了對細(xì)胞死亡方式的理解和認(rèn)識(shí)，為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)，也為黃芩苷在凋亡抑制或抵抗的情況下，在臨床抗腫瘤應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。