龔 娜，劉國麗，陳 珣，曹 君，楊 鎮(zhèn)，張 敏，馬世宇，

（1.遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，遼寧 沈陽 110161；2.葫蘆島農(nóng)函大玄宇食用菌野馴繁育有限公司，遼寧 興城 125125）

平菇（Pleurotus ostreatus） 是全球栽培面積和消費量最大的食用菌之一[1]，由于近年來我國平菇生產(chǎn)規(guī)模的逐步擴大，使得栽培平菇的基質(zhì)日趨緊張，玉米芯資源豐富，可替代木屑，且其價格較棉籽殼、木屑便宜，是栽培平菇主要培養(yǎng)原料之一[2-3]。玉米芯易于就地取材，可實現(xiàn)廢棄物利用，并且含有豐富的蛋白質(zhì)、糖和纖維素等[4]。平菇菌絲在生長發(fā)育中通過分泌多種胞外酶將基質(zhì)中的纖維素、木質(zhì)素等水解成小分子物質(zhì)作為主要碳素營養(yǎng)[5]，其生長分化與分泌胞外纖維素酶的能力大小密切相關(guān)[6]。

不同平菇菌株對原料的利用和轉(zhuǎn)化效果有很大差異，菌種是制約食用菌生產(chǎn)的關(guān)鍵因素[7]，不同菌株在玉米芯基質(zhì)上的分解能力不同，成為平菇基質(zhì)利用的主要障礙。傳統(tǒng)的菌株篩選方法是利用栽培試驗，周期長，所需空間大，操作過程復(fù)雜，成本高[8]。本研究采用平皿法、剛果紅杯碟快速篩選法對18株平菇菌株在以玉米芯為營養(yǎng)源的培養(yǎng)基上進(jìn)行生長和降解效果的篩選，以期篩選出適于玉米芯栽培的高產(chǎn)胞外纖維素酶的優(yōu)勢平菇菌株，為平菇遺傳育種篩選高酶活菌株提供科學(xué)依據(jù)，對提高平菇綜合生產(chǎn)能力起到重要作用。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試菌株

供試菌株為遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所試驗室引種保存的18個平菇菌株，如表1所示。

表1 供試菌株Tab.1 Strains of Pleurotus ostreatus used in the study

1.1.2 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：葡萄糖2%、馬鈴薯20%、瓊脂1.5%，采用自來水配置，pH 7.0。

玉米芯培養(yǎng)基：玉米芯5%、瓊脂1.5%，采用自來水配置，pH 7.0。

剛果紅-羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基[9]：羧甲基纖維素鈉 2.0 g·L-1、MgSO4·7H2O 1.88 g·L-1、KH2PO40.5 g·L-1、蛋白胨 2.0 g·L-1、剛果紅 0.25 g·L-1、瓊脂粉15 g·L-1，pH 7.0。

1.2 方法

1.2.1 測量和統(tǒng)計

菌種活化：取出保藏在冰箱中的母種，在超凈工作臺上接種試管斜面PDA培養(yǎng)基，每個菌株接種3支，23℃培養(yǎng)5 d。

原種的擴大培養(yǎng)：6 d后選取生長狀況最好的活化菌株，在超凈工作臺上接種到PDA平板正中央，以保證菌落邊緣連續(xù)，菌絲生長均勻。23℃培養(yǎng)8 d，每個菌株3次重復(fù)。

打孔接種：培養(yǎng)8 d后選取菌絲生長一致的平板，在超凈工作臺上用無菌打孔器在與平板中央距離相同位置上打孔，接種到玉米芯培養(yǎng)基平板中央，23℃培養(yǎng)8 d，每個菌株3次重復(fù)。

剛果紅染色法[10-12]：用打孔器（直徑約5 mm）將單菌落接種至CMC-Na平板培養(yǎng)基中，30℃恒溫培養(yǎng)8 d，然后觀察變色圈的大小，用游標(biāo)卡尺測菌落直徑d（mm） 和變色圈直徑D（mm）。

1.2.2 數(shù)據(jù)分析

菌絲生長速率測定：接種第3天開始，每隔1 d通過十字劃線測定菌落直徑，精確到毫米，記錄時間和生長量，每個菌株3次重復(fù)。

菌絲生長指數(shù)[13]：菌絲生長指數(shù)為菌絲長勢評分乘以菌絲生長速率（mm·d-1）。

菌落直徑：培養(yǎng)7 d之后測量的菌落直徑。

菌絲長勢：設(shè)定5為旺盛，4為較旺盛，3為長勢一般，2為長勢較差，1為長勢最差。

酶指數(shù)采用EI表示，EI=D/d。

采用SPSS軟件進(jìn)行差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米芯培養(yǎng)基對不同平菇菌株菌絲生長的影響

玉米芯培養(yǎng)基對不同平菇菌株菌絲生長的影響見表2。

由表2可見，18種平菇在玉米芯培養(yǎng)基上均可生長，但其菌絲生長速率、長勢評分、菌落直徑、菌絲生長指數(shù)間有較大的差異，其中10號菌絲濃密、粗壯、生長旺盛，生長速率、菌落直徑、生長指數(shù)最大。菌株長勢情況，10號、2號、12號生長旺盛，菌株生長速度最快，5號、6號、8號、9號、15號、18號菌株次之，較旺盛，1號、4號、14號、16號、17號長勢一般、生長速度慢，13號長勢較差，3號、7號、11號長勢最差。綜合各項生長指標(biāo)得到平菇在玉米芯培養(yǎng)基上生長狀態(tài)的排序為10號＞2號＞12號＞15號＞6號＞9號＞18號＞5號＞8號＞1號＞4號＞16號＞14號＞17號＞13號＞7號＞3號＞11號。

2.2 不同平菇菌株在玉米芯培養(yǎng)基上的菌絲生長曲線

不同平菇菌株在玉米芯培養(yǎng)基上的菌絲生長曲線見圖1。

表2 玉米芯培養(yǎng)基對不同平菇菌絲生長的影響Tab.2 Effect of corncob medium on mycelium growth of Pleurotus ostreatus

圖1 平菇在玉米芯培養(yǎng)基上的菌絲生長曲線Fig.1 Growth curve of Pleurotus ostreatus on the corncob medium

由圖1可見，18種平菇菌株在玉米芯培養(yǎng)基上的生長曲線可以分為5組：10號、2號、12號菌絲生長曲線為一組（第1組），5號、6號、8號、9號、15號、18號菌絲生長曲線為1組（第2組），1號、4號、14號、16號、17號菌絲生長曲線為1組（第3組），13號菌絲生長曲線為1組（第4組），3號、7號、11號菌絲生長曲線為1組（第5組）。從菌絲生長曲線的變化趨勢可見，第1組10號、2號、12號菌絲的生長效果最好，菌絲萌發(fā)快，隨著培養(yǎng)時間的增加，菌絲生長指數(shù)呈直線上升趨勢，而且上升幅度比較大。第2組與第3組菌絲生長曲線非常接近，其生長明顯低于第1組，但明顯高于第4組和第5組。

2.3 剛果紅染色法快速篩選高產(chǎn)纖維素酶平菇菌株

剛果紅染色法快速篩選高產(chǎn)纖維素酶平菇菌株，結(jié)果見表3。

由表3可知，降解的羧甲基纖維素鈉不再與剛果紅結(jié)合形成紅色復(fù)合物，通過剛果紅染色法獲得其水解纖維素酶能力，結(jié)果表明平菇菌株的菌落周圍均可產(chǎn)生透明圈，均能夠顯現(xiàn)羧甲基纖維素鈉的酶活。其中10號菌株（3302）變色圈出現(xiàn)較早，變色圈更大，變色圈直徑為41.67 mm。結(jié)合酶指數(shù)可以篩選出降解效果較好的菌株為10號菌株（3302），其降解纖維素的能力最強。

表3 剛果紅染色法快速篩選高產(chǎn)纖維素酶平菇菌株Tab.3 Cellulose-degrading Pleurotus ostreatus screened by congo red saucer rapid screening method

3 結(jié)論與討論

平菇適應(yīng)性廣、栽培方法簡單，多種作物秸稈均可作為基質(zhì)生產(chǎn)平菇[14-16]。隨著栽培面積的增加，棉籽殼、木屑資源緊缺，容易造成“菌林矛盾”等生態(tài)環(huán)境問題，栽培成本也隨之攀升。玉米芯屬于農(nóng)業(yè)廢棄物，對于木屑較少、玉米芯較多的栽培區(qū)域，既可降低培養(yǎng)成本，又能充分利用資源，使其變廢為寶，提高經(jīng)濟效益。食用菌胞外酶活性的變化因菌種和酶的不同而有所不同，但其變化也有一定的規(guī)律性，并且能夠較直接反映出食用菌對培養(yǎng)基質(zhì)的降解情況[17]，平菇整個生長周期和酶活的變化趨勢與菌絲生長勢基本相同[18]。目前，我國已有對平菇營養(yǎng)生理的研究，但對平菇多種不同菌株胞外纖維素酶對比鮮有報道。篩選高效纖維素降解菌株是高效利用纖維素類物質(zhì)的關(guān)鍵，纖維素酶活力是評價菌株降解纖維素能力的重要指標(biāo)[19]。優(yōu)勢平菇菌株是產(chǎn)業(yè)發(fā)展的基礎(chǔ)，能極大地提升栽培效益。以栽培的方式設(shè)計玉米芯含量不同的培養(yǎng)料配方的研究方法受到培養(yǎng)條件的限制，需要的空間大，周期長。本研究以玉米芯為營養(yǎng)源，采用平板法快速篩選適于玉米芯栽培的平菇菌株。結(jié)果表明，在含玉米芯的培養(yǎng)基上，18株平菇菌株菌絲均能生長，但是菌絲生長曲線差異較大，菌株3302、9408和抗病2號菌絲長勢較好，3302長勢最好，菌絲生長速率和菌絲生長指數(shù)分別為11.28 mm·d-1和56.39，變色圈最大，直徑為41.67 mm。今后可在本試驗基礎(chǔ)上對所篩選出的優(yōu)勢菌株進(jìn)行代料栽培，進(jìn)行培養(yǎng)料與子實體的相關(guān)性的研究等，此試驗也為今后選育適合玉米芯栽培的平菇菌株提供了親本菌株參考。