禽霍亂（Fowl cholera）又名禽巴氏桿菌病，其病原為多殺性巴氏桿 菌（Pasteurella multocida），是一種禽類的高度接觸性傳染病。本病全世界范圍內(nèi)均有發(fā)生，該病急性暴發(fā)時，發(fā)病率和死亡率均較高，會對禽類養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。世衛(wèi)組織（OIE）將此病列為必須報告的動物疫病，我國將其列為二類動物疫病。

一、流行病學診斷

本病是由多殺性巴氏桿菌引起的多種禽類的傳染病，對雞、火雞、鴨、鵝等家禽以及其他鳥類均易感，家禽中火雞最易感。該病的發(fā)生無明顯的季節(jié)性，全年均可發(fā)生，但陰雨潮濕的季節(jié)最易感染。按病程可將禽霍亂分為最急性型、急性型和慢性型。所有日齡禽類均可感染發(fā)病，但性成熟的青壯年雞群最易感，而16周齡以下的雞有較強的抵抗力。

二、臨床診斷

1.最急性型。較多見于流行初期。病初禽類無明顯癥狀，突然表現(xiàn)為痙攣、掙扎并快速死亡。

2.急性型癥狀。急性型較常見于流行初期。病初無明顯癥狀，禽只突然死亡，隨后感染禽只厭食、抑郁、流涎、不安、痙攣、抽搐、，發(fā)熱、腹瀉、羽毛粗亂、呼吸困難，，此外還伴有劇烈的腹瀉，排出綠色、黃綠色清水樣稀便，惡臭。產(chǎn)蛋雞停止產(chǎn)蛋。最后衰竭、昏迷而死亡。臨死前出現(xiàn)發(fā)紺，雞冠、肉垂呈黑紫色。病程0.5～3 d，病死率高。

3.慢性癥狀。對急性型耐過的禽只或是感染了弱毒菌株的禽只表現(xiàn)為慢性型的病程。其特點是患病的禽只具有局部感染的特征。纖維性化膿性滲出、壞死或不同程度的纖維化發(fā)生在各個關節(jié)、腳趾墊、肌腱鞘、粘膜組織、氣囊、中耳、喉肺或骨髓等處。

4.病理變化。（1）最急型。禽只死亡后剖檢，其病理變化不顯著。（2）急性型。全身充血，以腹腔臟器的靜脈瘀血最為明顯。肝臟表面有邊緣規(guī)整的灰白色針尖大壞死點。心包存在積液，心臟的內(nèi)、外膜出血。肺出血、水腫。十二指腸黏膜彌漫性出血。脾臟壞死。腺胃出血。產(chǎn)蛋雞的成熟卵泡外觀松軟，血管模糊。（3）慢性型。主要表現(xiàn)為纖維素性化膿性滲出，壞死和不同程度的纖維化，具體表現(xiàn)因病原侵害的器官不同而有所差異。當侵染主要發(fā)生在呼吸道時，鼻腔鼻竇分泌大量黏性分泌物。當侵染主要發(fā)生在關節(jié)和腱鞘時，關節(jié)腫大變形，分泌炎性滲出物并出現(xiàn)干酪樣壞死。某些病禽有斜頸表現(xiàn)的病例中，中耳、顱骨和腦膜等處出現(xiàn)均一的異嗜細胞浸潤和纖維素。

三、血清學診斷

血清學檢測方法：瓊脂擴散試驗（不適用于檢測水禽體內(nèi)的禽霍亂抗體）

1.試劑材料。禽霍亂瓊脂擴散抗原、標準陽性血清（陽性對照）和標準陰性血清（陰性對照）

2.試驗所需溶液。1%硫柳汞溶液、0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液溶液（pH6.4）和無菌生理鹽水

3.操作方法。根據(jù)說明書的要求制備瓊脂板。凝固后，使用4 mm直徑打孔器，按六角形或梅花形進行打孔。中心孔與外孔的距離為3 mm。取出所打孔中的瓊脂，注意不要破壞邊緣的瓊脂，用酒精燈輕輕烘烤盤底，直到瓊脂稍微融化，達到封閉孔底的目的，以防止側(cè)漏。用無菌生理鹽水按試劑說明書要求的比例稀釋禽霍亂抗原，加入到中間孔中，在外周的1、4孔中加入陽性對照，在外周的2、3、5、6孔中依次加入陰性對照和待檢血清。然后靜止10 min，將平皿倒置于濕盒內(nèi)，放置于37℃，反應24 h和48 h分別進行觀察記錄。

4.結(jié)果。試驗成立標準：側(cè)光或燈下可觀察到，中心孔與陽性對照孔間有一條清晰的白色沉淀線（該沉淀線應與兩孔之間的連線垂直），而與陰性對照孔之間無沉淀線。

試驗結(jié)果確定：若被檢血清孔與中心孔間有明顯的沉淀線，切位置等同于陽性對照線，則該孔檢測結(jié)果為陽性；若被檢血清孔與中心孔間存在一條較不明顯的沉淀線，或是被檢血清孔與中心孔之間沒有沉淀線，但陽性對照線靠近被測樣品孔的一段向中心孔彎曲，均可判為弱陽性，需重復試驗，若兩次均為可疑，則判該樣品為陽性；若被檢血清孔與中心孔之間無沉淀線，則為陰性；若被檢血清孔與中心孔之間的沉淀線渾濁，并與陽性對照沉淀線交叉，則被檢血清孔為非特異性反應，需重復試驗。若兩次均為非特異性反應，則判該樣品為陰性。

陽性或弱陽性結(jié)果可確定體內(nèi)存在禽霍亂抗體。

四、病原學診斷

1.病源分離鑒定方法。（1）樣品采集。按照NY/T 541的要求采集并保存樣品；最急性或急性病例，可采集瀕死或死亡禽只的肝臟、脾臟、心臟和血液等。慢性病例，一般采集有病變的局部病灶組織；活禽可采集鼻腔黏液。不新鮮或可能存在污染的死亡禽只，可采集骨髓樣。

（2）鏡檢樣品的制備。制備過程應進行無菌操作，夾取病變組織（肝、脾、心臟），剪成小塊，并以其新鮮切面在載玻片上涂抹壓??；若樣品為血液，蘸取或剪取凝血塊，在載玻片上涂抹壓印；若是已經(jīng)培養(yǎng)純化的細菌，從菌落挑取少量涂片。

（3）細菌培養(yǎng)。可將病料接種于5%雞血清的葡萄糖淀粉瓊脂、鮮血瓊脂培養(yǎng)基或5%雞血清腦心浸出液瓊脂培養(yǎng)基，在35℃～37℃下培養(yǎng)18～24 h，產(chǎn)生的菌落直徑為1 mm ～ 3 mm 菌落外形呈露珠狀，符合其培養(yǎng)特性。

（4）病原鑒定。培養(yǎng)特性：該菌為兼性厭氧菌，其最適培養(yǎng)溫度為35℃～37℃，培養(yǎng)18～24 h可形成直徑為1 mm～3 mm的菌落，外觀呈散在的圓形凸起露珠狀，若是有莢膜的菌株則菌落稍大。

（5）顯微鏡鑒定。樣品的干燥和固定:挑取菌落，涂于載玻片，采用甲醇固定或火焰固定。

染色及鏡檢：使用甲醇固定法時，采用瑞氏或美藍染色法，鏡檢時呈兩極濃染的菌體，常有莢膜；使用火焰固定法時，采用革蘭氏染色法，鏡檢時為（0.2～0.4）μm×（0.6～2.5）μm大小的革蘭氏陰性球桿菌，單個或成對存在。

（6）生化鑒定特性。本菌在葡萄糖、半乳糖、燕糖或果糖等發(fā)酵管中接種時產(chǎn)酸但不產(chǎn)氣，在鼠李糖、水楊苷、戊醛糖、纖維二糖、棉子糖、菊糖或赤蘚糖等發(fā)酵管中不發(fā)酵；本菌在蛋白胨水培養(yǎng)基接種時，會產(chǎn)生吲哚；本菌在鮮血液瓊脂上接種時可生成灰白色，濕潤而粘稠的菌落，且不會發(fā)生溶血；本菌在麥康凱瓊脂上接種時無法生長；培養(yǎng)可產(chǎn)生過氧化筑酶、氧化酶，但無尿索酶、3-半乳糖管酶；維培（VP）試驗結(jié)果為陰性。

（7）動物接種試驗。在稀釋細菌純培養(yǎng)物后，以1 000CFU劑量細菌通過皮下或腹腔內(nèi)接種小鼠、兔或易感雞，被接種動物1～2 d內(nèi)死亡，隨后可從被接種動物的肝臟和血液中分離出本菌。

（8）結(jié)果判定。符合顯微鏡鑒定生化鑒定特性的鑒定特征，可確認分離到的病原為多殺性巴氏桿菌。

2.多殺性巴氏桿菌PCR檢測方法。（1）主要試劑：滅菌雙蒸水或超純水、電泳緩沖液（TAE）、1.5%瓊脂糖凝膠、PCR配套試劑：DNA提取試劑盒、10 X PCR Buffer、dNTPs、Taq 酶、DI 2000 DNA Marker。

3.樣品處理。（1）組織樣品的處理。取約0.5 g的待檢組織樣品于滅菌干燥的研缽中充分研磨，加2 mL滅菌生理鹽水混勻。反復凍融3 次，3 000 r/min 離心 5 min。取上清液轉(zhuǎn)至無菌的1.5 ml塑料離心管中，編號。樣本在2～8℃條件下保存，應不超過24 h。若需長期保存，應放在-70℃以下冰箱，但應避免反復凍融。

（2）純化和培養(yǎng)細菌樣品。用于分離和純培養(yǎng)的細菌液體培養(yǎng)樣品，直接保存在無菌的1.5毫升離心管中。將離心管密封、編號、保存并送檢。

（3）基因組DNA的提取。按照DNA提取試劑盒說明書提取處理后的樣品、陽性對照和陰性對照的基因組DNA。

（4）反應體系及反應條件。對提取的DNA進行擴增，每個樣品20L，反應體系組成如下:

10XPCR 緩沖液2.0 uL

dNTPs（2.5 mmol/L）1.5 uL

引物 KMTI T7（10 umol/uL）1.0 uL。

引物KMT I SP6（10 pmol/u.） 1.0 d。

模板 DNA（樣品） 1.0 uL。

Taq DNA 聚合酶 0.5 uL。

純水 13.0 pL。

總體積 20.0 uL。

反應條件設置：樣品反應管瞬時離心，置于PCR擴增儀內(nèi)進行擴增，95℃預變性 5 min，94℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，30 個 循 環(huán)，72℃延伸 10 min。

（5）凝膠電泳。在1 X TAE緩沖液中進行電泳，將擴增產(chǎn)物和DL2000 DNA Marker分別加人1.5%瓊脂糖凝膠孔中，每孔加擴增產(chǎn)物10L，80V～100V電壓電泳30 min，在紫外燈或凝膠成像儀下觀察結(jié)果。

（6）結(jié)果分析與判定。試驗成立條件：陽性對照樣品擴增出460 bp片段，且陰性對照沒有擴增出任何條帶。

結(jié)果判定：在試驗成立前提下，若擴增出的DNA片段為460 bp，可判定該樣品為陽性，否則為陰性。

4.莢膜多重PCR檢測方法。

（1）主要試劑。同前述PCR檢測方法中要求一致（2）樣品處理。同前述PCR檢測方法中要求一致（3）基因組DNA的提取。同前述PCR檢測方法中要求一致（4）反應體系及反應條件。對提取的DNA進行擴增，每個樣品25L，反應體系組成如下:

10 X PCR 緩沖液 2.5 uL

dNTPs（2.5 mmol/L）2 uL

MgCl2（50 mmol/L） 1.0 uL

上 游 引 物 （10 umol/uL） 各0.8 uL。

下 游 引 物 （10 pmol/u.） 各0.8 uL。

模板 DNA（樣品） 1.0 uL。

Taq DNA 聚合酶 0.5 uL。

純水 10.0 pL。

總體積 25.0 uL。

（5）凝膠電泳。同前述PCR檢測方法中要求一致。（6）診斷結(jié)果判定。試驗成立條件：首先，陰性對照不應擴增出任何條帶。其次，A型、B型、D型、E型和F型莢膜型陽性對照樣品擴增出 1 044 bp、760 bp、657 bp、511 bp、851 bp 片段。

結(jié)果判定：試驗成立的條件下，根據(jù)電泳結(jié)果出現(xiàn)目的條帶大小判定細菌的莢膜型。莢膜A型目的條帶為 1 044 bp，B 型目的條帶為760 bp，D 型目的條帶為 657 bp，E型目的條帶為511 bp，F(xiàn)型目的條帶為 851 bp。

5.診斷結(jié)果判定。

（1）若臨床癥狀符合禽霍亂臨床診斷特性，分離鑒定檢測結(jié)果或PCR檢測方法結(jié)果為陽性時均可確診。

（2）血清學檢測方法檢測結(jié)果為陽性時，可判定為禽只體內(nèi)存在禽霍亂抗體。

（3）根據(jù)莢膜多重PCR檢測方法的判定結(jié)果，可鑒定禽多殺性巴氏桿菌的莢膜型。