李浩然 曲 蕾 孫豐盛 郭霧晴 孫浩偉 王 鑫

（臨沂大學(xué)農(nóng)林科學(xué)學(xué)院，山東臨沂 276005）

體細(xì)胞克隆技術(shù)是指把動物體細(xì)胞經(jīng)過抑制培養(yǎng)，使細(xì)胞處于休眠狀態(tài)。采用核移植的方法，利用細(xì)胞拆合或細(xì)胞重組技術(shù)，將卵母細(xì)胞去核作為核受體，以體細(xì)胞或含少量細(xì)胞質(zhì)的細(xì)胞核即核質(zhì)體作為核供體，將后者移入前者中，構(gòu)建重組胚，供體核在去核卵母細(xì)胞的胞質(zhì)中重新編程，并啟動卵裂，開始胚胎發(fā)育過程，妊娠產(chǎn)仔，克隆出動物的技術(shù)，又可稱之為體細(xì)胞核移植技術(shù)。

1 背景

自1996年7月5日，英國科學(xué)家伊恩·維爾穆特博士用一個成年羊的體細(xì)胞成功克隆出“多莉羊”，“克隆”一詞開始走進(jìn)了大眾的視野。隨著“多莉羊”被克隆出，許多哺乳動物的體細(xì)胞克隆動物也相繼誕生，但是與人相近的靈長類動物的體細(xì)胞克隆技術(shù)一直沒有成功過[1]，沒有克隆猴，就很難建立模擬人類疾病的動物模型。而實驗動物，如小白鼠，大白兔等，作為一部分特殊的動物群體，在人類疾病研究等方面做出了巨大的貢獻(xiàn)，但是這些實驗動物與人之間的巨大物種差異使得目前大多數(shù)利用小白鼠、大白兔等實驗動物為研究對象獲得的研究成果不能被直接用于人類疾病的臨床治療[2]，而倫理與現(xiàn)實的制約因素也使得直接以人為研究對象變得不可行。因此，建立與人類最為接近的非人靈長類動物的實驗動物模型，成為科學(xué)家們亟待解決的問題。

2 體細(xì)胞克隆猴技術(shù)

早在1997年，美國Don Wolf實驗室用6-16細(xì)胞時期早期胚胎細(xì)胞作為核供體細(xì)胞功克隆出一雌一雄兩只恒河猴。而關(guān)于非人靈長類體細(xì)胞克隆工作的研究報道最早是出現(xiàn)在2002年[3]，之后不同國家的多個實驗室對體細(xì)胞克隆猴這一技術(shù)進(jìn)行多次實驗，但都沒有成功。2017 年中國科學(xué)院神經(jīng)科學(xué)研究所非人靈長類研究平臺團隊經(jīng)過5年攻關(guān)，終于突破了這一世界性難題。他們利用體細(xì)胞克隆技術(shù)成功地獲得了2只克隆猴“中中”和“華華”。這是人類歷史上首次使用體細(xì)胞作為供體獲得的克隆非人靈長類后代，其成功不僅在生物學(xué)研究領(lǐng)域具有“里程碑式”的意義，而且對提升非人靈長類實驗動物福利也有重要幫助。

3 體細(xì)胞克隆猴技術(shù)存在的問題及三大難點

目前，科隆率低是克隆技術(shù)存在的最大問題。據(jù)統(tǒng)計分析表明，牛的效率為10%～20%，山羊為3%～10%，而小鼠的克隆效率僅有4～5%，而導(dǎo)致體細(xì)胞克隆效率低下的主要原因是克隆動物常常出現(xiàn)的“三高”，即克隆胎兒流產(chǎn)率高、圍產(chǎn)期死亡率高、新生動物死亡率高[4]。此外，克隆動物胚胎、胎兒發(fā)育異常，克隆動物發(fā)育缺陷等也是克隆技術(shù)中存在的較為嚴(yán)重的問題。

體細(xì)胞克隆猴有三大難點：一是在實驗過程中所提供的卵母細(xì)胞的細(xì)胞核不易辨別，這導(dǎo)致去核的難度增大，作為受體細(xì)胞，要將細(xì)胞核“摘除”才能容納“外來細(xì)胞核”若去核不成功，無法保證所有的核遺傳物質(zhì)全來自與供體所提供的細(xì)胞核。二是在卵母細(xì)胞進(jìn)行核移植前卵母細(xì)胞處于“沉默”狀態(tài)，而難點就在這里，卵細(xì)胞容易提前被激活，在克隆過程中，在體細(xì)胞進(jìn)入卵細(xì)胞時才將卵細(xì)胞激活后而進(jìn)行一系列的發(fā)育過程，這就需要卵細(xì)胞被激活的時間要精準(zhǔn)，但在實驗過程中，若采取傳統(tǒng)的激活方法，難以控制“時機”，進(jìn)而使實驗的難度增大。三是對于體細(xì)胞克隆來說，體細(xì)胞的全能性較胚胎細(xì)胞的全能性較低，這使得胚胎的發(fā)育率較低。

4 體細(xì)胞克隆猴技術(shù)的意義及前景

隨著人類科學(xué)的不斷進(jìn)步，對于利用高等動物作為實驗對象開展相關(guān)研究的需求與日俱增，其中非人靈長類占有很大的比例。由于沒有遺傳背景均一的近交系猴，因此只能通過使用更多的實驗動物來消除因個體間差異而導(dǎo)致的實驗誤差。體細(xì)胞克隆猴技術(shù)不僅可以幫助我們得到一群基因背景近乎一致的猴子，極大地克服了靈長類動物之間個體差異大、實驗可重復(fù)性差等缺陷，還可對體細(xì)胞進(jìn)行定向基因打靶，通過一系列篩選步驟篩選出陽性克隆后將其用作核移植的供體細(xì)胞，從而克隆出特定的疾病模型猴并進(jìn)一步開展相關(guān)疾病的研究。最后，由于疾病模型猴的基因背景一致，可大大減少生物醫(yī)療領(lǐng)域?qū)嶒瀯游锏氖褂昧?，幫助篩選人類疾病的有效藥物，縮減新藥研發(fā)、臨床實驗等的周期和費用，從整體上提升非人靈長類實驗動物福利?？寺『锏某晒σ馕吨鴮嶒瀯游飳W(xué)科發(fā)展到了一個新的高度。體細(xì)胞克隆猴的成功對于自閉癥，老年癡呆癥，帕金森綜合征及其他退行性疾病患者來說，都是一個極大福音。

5 討論

科學(xué)技術(shù)的發(fā)展為人類在各項領(lǐng)域的研究提供了嶄新的思路，推動著人們?nèi)ヌ剿鞲嗟奈粗澜?，正如克隆技術(shù)被發(fā)現(xiàn)后，使得生命科學(xué)領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)了巨大的突破，但是，人們在歡欣鼓舞的同時，也存在著隱隱的不安：是不是終有一天人也會被克?。科鋵嵾@已經(jīng)不需要回答了，從“多莉羊”誕生再到體細(xì)胞克隆猴技術(shù)的成功，人們就已知道，克隆人不再是一個理論難題，技術(shù)層次的突破只是一個時間的問題，那么我們應(yīng)該如何去處理這中間存在的諸多問題，譬如倫理道德問題？事實上，早在“多莉羊”誕生以來，圍繞克隆技術(shù)的倫理問題的爭論就從未停止過，正確把握科研需要與倫理道德之間的平衡，將是未來科研工作者必須具備的一項基本素質(zhì)。

我國在2003年發(fā)布的《人胚胎干細(xì)胞研究倫理指導(dǎo)原則》中就明確規(guī)定：禁止進(jìn)行生殖性克隆人的任何研究。我國目前科研倫理規(guī)范主要有以下三個文件，分別是國家衛(wèi)生和計劃生育委員會于2016年10月發(fā)布的《涉及人的生物醫(yī)學(xué)研究倫理審查辦法》，原國家食品藥品監(jiān)督管理局于2003年6月發(fā)布的《藥物臨床試驗質(zhì)量管理規(guī)范（GCP）》以及2012年中國疾病預(yù)防控制中心發(fā)布的《關(guān)于非人靈長類動物實驗和國際合作項目中動物實驗的實驗動物福利倫理審查規(guī)定（試行）》[5]，我國進(jìn)行的體細(xì)胞克隆猴技術(shù)是在嚴(yán)格的倫理規(guī)范下進(jìn)行的。當(dāng)然，涉及到人類延續(xù)和發(fā)展的倫理問題時，還是需要在更加謹(jǐn)慎的思考和嚴(yán)謹(jǐn)?shù)恼{(diào)查下進(jìn)行，相信在不久地將來，會有更加健全的法律法規(guī)出臺，在正確的法律規(guī)范和道德觀念的引導(dǎo)下，體細(xì)胞克隆技術(shù)會迎來更加廣闊的研究前景并為人類疾病研究帶來巨大福音。