楊璇，王玉波，趙海軍，徐向純，崔賀斌，宋彬彬，于佳

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是胞質(zhì)內(nèi)由膜組成的一系列片狀或管狀的囊腔，彼此相通形成一個隔離于細胞基質(zhì)的管道系統(tǒng)。蛋白質(zhì)合成后進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔，經(jīng)過修飾和折疊，由在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上裝配的COPII有被小泡包裹離開內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，隨后被運送至高爾基體。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上COPII有被小泡形成的部位被稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)出口（endoplasmic reticulum exit sites，ERES）。細胞內(nèi)蛋白質(zhì)失衡可導致多種神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生，如阿爾茨海默病、帕金森病和亨廷頓病。因此作為蛋白分泌的第一步，理解ERES的結(jié)構(gòu)、形成以及功能的調(diào)節(jié)對于深入研究多種神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機制有著重要的意義。

1 ERES的結(jié)構(gòu)

ERES屬于粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，但并無核糖體附著。目前認為ERES不僅包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜部分，還包括未與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)高爾基體中間體融合的COPII包被的小管泡膜結(jié)構(gòu)。在光鏡下，可觀察到ERES位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的邊緣，典型特征是有COPII包被的小泡出芽[1]。ERES并非均一地分布于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面，在釀酒酵母菌中觀察發(fā)現(xiàn)ERES呈聚集的點狀結(jié)構(gòu)分布于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，進一步發(fā)現(xiàn)ERES主要分布在的高曲率的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上[2]。所有真核生物的細胞中均有ERES，但在不同種屬細胞間的數(shù)量存在差異。酵母菌細胞通常只有數(shù)個ERES，而在哺乳動物細胞中一般會有數(shù)百個ERES，這些ERES遍布于細胞質(zhì)并且在胞核周圍分布較多。在神經(jīng)元中，ERES還分布在樹突中[3]。ERES結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定，直徑大約0.5 μm，如果2個ERES發(fā)生碰撞，會融合形成一個較大的結(jié)構(gòu)，但這一結(jié)構(gòu)會發(fā)生收縮最終變?yōu)橹睆郊s為0.5 μm，利用延時成像技術(shù)觀察發(fā)現(xiàn)ERES幾乎不發(fā)生移動[4]。

2 ERES輸出分泌蛋白的分子機制

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輸出蛋白至高爾基體是由COPII有被小泡介導的。COPII也稱外被蛋白II，是由多個蛋白組裝形成的復合物，構(gòu)成COPII的蛋白有Sec23/Sec24、Sec13/Sec31。COPII的組裝需要小G蛋白Sar1參與。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上存在鳥嘌呤交換因子Sec12，Sec12是II型跨膜蛋白，在哺乳動物細胞中，Sec12集中分布在ERES。Sec12通過其WD40結(jié)構(gòu)域和Sar1相互作用，將Sar1錨定于ERES，促使Sar1和GTP結(jié)合使其激活，暴露其兩親性螺旋，促使Sar1插入到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜中，導致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜變形，以便于隨后膜發(fā)生裂變。GTP-Sar1通過和Sec23之間的直接相互作用將Sec23/Sec24異源二聚體募集到ERES，形成COPII有被小泡的內(nèi)層結(jié)構(gòu)。Sec23是Sar1的GTP酶活化蛋白（GTPase-activating protein，GAP），而Sec24則可和貨物蛋白或貨物蛋白受體相結(jié)合，將貨物蛋白包裹進入囊泡。隨后，Sec13/Sec31異源二聚體也被募集到ERES形成COPII有被小泡的外層結(jié)構(gòu)，至此COPII有被小泡完成組裝。Sec13/Sec31可大大提高Sec23對Sar1的激活作用，促使COPII有被小泡從ERES釋放[1]。

3 Sec16在ERES輸出分泌蛋白中的重要作用

體外實驗已證實將純化的Sec23/Sec24、Sec13/Sec31和GTP結(jié)合狀態(tài)的Sar1加入到脂質(zhì)小體中就足以形成有被小泡。但是，在體外COPII有被小泡的組裝所需Sec23/Sec24、Sec13/Sec31和Sar1的濃度較高，提示還有其他存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的因子促進COPII有被小泡的組裝。Sec16就是一個在ERES的形成和維持以及COPII有被小泡組裝中起到至關(guān)重要作用的蛋白[5]。

3.1 Sec16的表達和結(jié)構(gòu)

Sec16是在溫度敏感的釀酒酵母中首次被鑒定出，Sec16幾乎在所有真核生物中均有表達。在細胞內(nèi)，Sec16僅表達于ERES，因此可作為ERES的特異性標記物。Watson等[6]通過細胞組分提取實驗證實內(nèi)源性Sec16可利用高鹽或堿性溶液提取，而不需要Triton-X-100，提示Sec16并非分布于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜中，而是和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜緊密相連。

Sec16的分子量約為240 KD，在不同種屬間存在差異。哺乳動物有2個編碼同源SEC16蛋白的基因，分別編碼SEC16A和SEC16B。SEC16A是分子量為231 KD的大分子蛋白，其結(jié)構(gòu)和功能與其他生物中的Sec16相似，而SEC16B的分子量僅為117 KD[5]。

Sec16主要由3個結(jié)構(gòu)域組成，從氨基（N）端到羧基（C）端依次為ERES定位結(jié)構(gòu)域（ERES localization domain，ELD）、中間保守結(jié)構(gòu)域（central conserved domain，CCD）和羧基端保守結(jié)構(gòu)域（C-terminal conserved domain，CTCD）。ELD通常由300個氨基酸殘基組成，對于Sec16定位于ERES至關(guān)重要。Ivan等[7]進一步明確了果蠅Sec16定位于ERES主要是依賴ELD中富含精氨酸的860-925位氨基酸殘基。但是，僅有ELD并不能有效的將Sec16定位于ERES，Sec16的定位還需要CCD。CCD通常由400～500個氨基酸殘基組成，在不同物種間高度保守。Yorimitsu等[8]發(fā)現(xiàn)在在酵母中Sec16可通過位于其CCD形成同源二聚體。Bharucha等[9]將酵母ELD分別和CCD或FK506結(jié)合蛋白（FKBP）相融合，F(xiàn)KBP只能以單體形式存在而不能形成二聚體。結(jié)果發(fā)現(xiàn)ELD-CCD可正常定位于ERES，僅表達ELD也可定位于ERES，但其效率要明顯低于ELD-CCD，而ELD-FKBP卻在胞漿中彌散分布，不能定位于ERES，提示在酵母中Sec16 CCD所介導的Sec16的同源二聚化對其定位于ERES是必須的。但在其他生物如果蠅、人，Sec16定位于ERES不需其發(fā)生二聚化，提示在果蠅和哺乳動物中存在其他機制[7,10]。Maeda等[5]發(fā)現(xiàn)Hela細胞中位于ERES的TANGO1可與Sec16 CCD相互作用，從而協(xié)助Sec16定位于ERES[11]。CTCD是指位于C端的158-226個氨基酸，哺乳動物的SEC16B無此結(jié)構(gòu)域。

3.2 Sec16參與ERES的形成和維持

多項研究表明，在不同的種屬中，Sec16對于ERES的組裝和形態(tài)的維持起到關(guān)鍵作用。Ivan等[7]敲減了果蠅S2細胞中Sec16，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細胞中大部分Sec23呈彌散的小熒光點樣分布；而在電鏡下也無法觀察到ERES及COPII有被小泡。Sealey-Cardona等[12]也發(fā)現(xiàn)敲減布氏錐蟲中Sec16導致Sec24標記的ERES長度明顯縮短。Bhattacharyya等[13]觀察到在Hela細胞中敲減Sec16A或Sec16B導致幾乎所有細胞內(nèi)ERES消失。盡管如此，Budnik等[14]發(fā)現(xiàn)Sec16B并不能代償Sec16A在ERES的形成中起到的作用，因而Sec16B可能有一些特異性的功能，但是目前仍未能明確。

Connerly等[15]發(fā)現(xiàn)溫度敏感性的Sec16 P1092L突變導致酵母菌中Sec12的分布呈彌散裝，表明Sec16 P1092L突變破環(huán)了ERES的組裝。進一步研究發(fā)現(xiàn)，Sec16 P1092L突變導致ERES形成速度發(fā)生改變，在野生型酵母菌中每小時約有3.3個ERES形成，而在Sec16 P1092L突變的酵母菌中每小時有40個ERES形成[9]。此外，在表達野生型Sec16的酵母菌中的，ERES收縮較緩慢，半衰期約為11 min；而在表達Sec16 P1092L的酵母菌中ERES的收縮半衰期僅為20 s，過快的收縮導致ERES的尺寸明顯減小[9]。據(jù)此推測Sec16 P1092L導致ERES的形成和收縮均顯著加速，但是ERES收縮加速要遠遠高于形成加速，因此破環(huán)了ERES的正常形態(tài)。

3.3 Sec16調(diào)節(jié)COPII有被小泡的組裝

目前已在酵母菌細胞中證實Sec16和Sec12、Sar1、Sec23/Sec24、Sec13/Sec31均存在直接相互作用；在人類細胞中，Sec16也和Sec12、Sec13和Sec23有直接相互作用，提示Sec16可直接作用于COPII有被小泡蛋白調(diào)節(jié)ERES輸出分泌蛋白[5]。

在果蠅S2細胞中，研究者檢測到敲減Sar1或Sec23均未改變Sec16的定位。但是反過來，敲減Sec16會導致Sar1發(fā)生異位。而當將Sec16和內(nèi)體定位結(jié)構(gòu)域FYVE相融合并表達于果蠅S2細胞，則Sar1被募集至內(nèi)體當中[7]。Montegna等[16]觀察發(fā)現(xiàn)在畢氏酵母菌中過表達Sec12會導致Sec12在整個內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中均有分布，而在酵母菌中過表達Sec16則可以促使Sec12正確分布于ERES。以上結(jié)果證明，Sec16在ERES的定位并不依賴于COPII有被小泡組裝所需蛋白，而是COPII有被小泡組裝所需蛋白定位于ERES必需Sec16的存在。

Sec16可作為支架募集COPII有被小泡組裝所需蛋白。Supek等[17]發(fā)現(xiàn)在體外有Sec16存在情況下，Sec23/Sec24和Sec13/Sec31均可以有效被募集至脂質(zhì)小體中；在電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)在無Sec16存在情況下，僅有10.5%的脂質(zhì)小體表現(xiàn)出COPII有被小泡特征，而在Sec16存在情況下，有27.5%的脂質(zhì)小體表現(xiàn)出COPII有被小泡特征，上述結(jié)果提示Sec16可募集COPII有被小泡組裝所需蛋白，促進COPII有被小泡完成組裝。

Yorimitsu等[8]利用體外脂質(zhì)小體實驗觀察發(fā)現(xiàn)Sec16在Sec31存在情況下可以抑制Sar1活性，提示Sec16對Sar1活性的抑制是通過作用于Sec31實現(xiàn)的。Kung等[18]利用酵母雙雜交實驗觀察到Sec24突變體Sec24-m11（無法和Sec16結(jié)合發(fā)生相互作用）可降低Sec16對Sec31的抑制作用，因此推測Sec24和Sec16結(jié)合發(fā)生相互作用可以抑制Sec31激活Sar1。

4 ERES輸出分泌蛋白的調(diào)節(jié)機制

4.1 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激對ERES輸出分泌蛋白的調(diào)節(jié)

目前，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激對ERES輸出分泌蛋白的影響存在爭議。細胞內(nèi)蛋白的過度表達可引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，F(xiàn)arhan等[19]發(fā)現(xiàn)在Hela細胞中過表達γ氨基丁酸轉(zhuǎn)運體1（GABA transporter 1，GAT1）導致細胞內(nèi)Sec24和Sec16的水平均明顯升高，同時ERES的大小和數(shù)目均顯著增加，提示在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激過程中ERES功能上調(diào)。Amodio等[20]則利用毒胡蘿卜素（thapsigargin，TG）或二硫蘇糖醇（Dithiothreitol，DTT）誘導人肝癌huh7細胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細胞膜成分中的Sar1、Sec23和Sec31的含量均顯著下降，提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激降低了COPII有被小泡組裝蛋白與膜的結(jié)合，抑制COPII有被小泡組裝。

事實上，上述相反的結(jié)果可能是由誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的方式不同所引起的。TG是一個肌漿網(wǎng)/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+-ATP酶抑制劑，會破環(huán)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+穩(wěn)態(tài)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的大量熱休克蛋白需要依賴Ca2+發(fā)揮功能；DTT破環(huán)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)氧化還原環(huán)境，抑制二硫鍵形成。只有正確折疊的蛋白才能夠刺激COPII有被小泡的形成，以上藥物都破環(huán)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)正常的內(nèi)環(huán)境，抑制蛋白的正常折疊過程，使得蛋白無法輸出[21]。而在Farhan等[19]的研究中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激是由蛋白折疊過載引起的，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)本身的功能并未受到破環(huán)，因此可以增加ERES的蛋白輸出。

Farhan等[19]還發(fā)現(xiàn)ERES功能的提升需要未折疊蛋白反應（unfolded protein response，UPR）的參與。他們發(fā)現(xiàn)過表達GAT1可以誘導Hela細胞中剪接的X盒結(jié)合蛋白（spliced X-box binding protein1，XBP1s）的生成，提示UPR已被激活。在肌醇需求酶1（inositol-requiring enzyme 1，IRE1）表達缺失的小鼠胚胎成纖維細胞中過表達GAT1無法使ERES數(shù)目增加，提示UPR激活對于蛋白過載誘導ERES功能必不可少。

4.2 細胞自噬對ERES輸出分泌蛋白的調(diào)節(jié)

細胞自噬和早期分泌相關(guān)，大部分研究著眼于早期分泌途徑如何參與自噬體的形成，但近年來的研究顯示自噬也可調(diào)節(jié)早期分泌途徑。Joo等[22]發(fā)現(xiàn)在自噬起始因子UNC-51樣酶（unc-51 like kinase 1，ULK1）基因敲除小鼠胚胎成纖維細胞中，Sec16A以及Sec24陽性的點狀結(jié)構(gòu)數(shù)目明顯下降，同時抗Endo H的血清素轉(zhuǎn)運體（serotonin transporter，SERT）水平明顯下降，提示ULK1基因敲除抑制了ERES形成以及蛋白分泌。ULK1能夠磷酸化Sec16A S846位點，Sec16A S846A突變導致細胞內(nèi)Sec24陽性的點狀結(jié)構(gòu)數(shù)目明顯下降，而Sec16A S846D的作用則正相反，同時Sec16A S846D還可修復ULK1基因敲除小鼠胚胎成纖維細胞中ERES的功能。這表明ULK1促進ERES輸出分泌蛋白是通過磷酸化Sec16A介導的。但Gan等[23]的研究得到了相反的結(jié)果。他們發(fā)現(xiàn)過表達ULK1會抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輸出水泡性口炎病毒G蛋白（vesicular stomatitis virus G protein，VSVG），ULK1能夠磷酸化Sec23A S207位點，降低Sec23A和Sec31A的結(jié)合，進而抑制ERES和COPII有被小泡的組裝，抑制ERES輸出分泌蛋白。上述相矛盾的結(jié)論目前仍未有合理解釋，可能是由于兩項研究在不同的實驗體系中。因而自噬對ERES輸出分泌蛋白是促進或是抑制，細胞自噬是否還作用于其他ERES相關(guān)蛋白需要進一步探索。

4.3 MAPK家族對ERES輸出分泌蛋白的調(diào)節(jié)

Farhan等[24]發(fā)現(xiàn)細胞外信號調(diào)節(jié)激酶2（extracellular regulated kinase 2，ERK2）敲減的Hela細胞中ERES的數(shù)目下降了約30%，同時轉(zhuǎn)鐵蛋白受體從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)至高爾基體的運輸受抑制；ERK2可使Sec16 T415位點發(fā)生磷酸化，在Hela細胞中表達Sec16磷酸化失活突變T415I降低了細胞內(nèi)ERES數(shù)目，表明ERK2通過磷酸化Sec16促進ERES形成，提高蛋白分泌。

MAPK家族中還有另一個成員也被證實調(diào)節(jié)了ERES。Zacharogianni等[25]經(jīng)鑒定發(fā)現(xiàn)ERK7能夠調(diào)節(jié)果蠅S2細胞的早期分泌通路。ERK7可以和Sec16的C端相互作用，導致Sec16無法定位于ERES，而是在胞漿中彌散分布，進而抑制ERES形成。但是Sec16的C端并不介導其在ERES的定位，因而ERK7與Sec16相互作用的具體機制仍需要進一步明確。

5 ERES與神經(jīng)退行性疾病

神經(jīng)退行性疾病是一組由慢性進行性中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性變性而產(chǎn)生的疾病，其主要特征是中樞神經(jīng)系統(tǒng)不斷進展的神經(jīng)元變性、壞死和丟失，從而引起運動、感覺及認知和行為障礙，常見的有阿爾茨海默病、帕金森病、亨廷頓氏病、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥等。神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機制十分復雜，神經(jīng)退行性疾病相關(guān)蛋白基因突變和環(huán)境因素可能共同導致疾病的發(fā)生和進展。盡管目前對ERES功能障礙在神經(jīng)退行性病中的作用尚不明確，但近年來的研究結(jié)果顯示，神經(jīng)退行性疾病相關(guān)蛋白富含亮氨酸重復序列激酶2（leucine-rich repeat kinase 2，LRRK2）和p150glued調(diào)節(jié)了ERES輸出分泌蛋白的過程。

LRRK2突變是PD最為常見的遺傳因素。Kim等[26]發(fā)現(xiàn)敲減HEK293細胞中LRRK2導致自噬相關(guān)蛋白p62在細胞內(nèi)大量積聚，而培養(yǎng)基中的p62顯著降低，提示敲減LRRK2抑制p62的分泌。Cho等[27]利用質(zhì)譜分析鑒定并利用免疫共沉淀實驗證實LRRK2和Sec16A存在相互作用。在小鼠胚胎成纖維細胞中，LRRK2基因敲除或R1441C突變導致Sec16A在胞漿中彌散分布，無法錨定于ERES，同時VGSG輸出明顯延遲。在小鼠海馬神經(jīng)元中也存在相同機制，LRRK2表達缺失破壞了樹突中ERES的形成，并且抑制了谷氨酸受體的分泌。

p150glued是動力蛋白激活蛋白最大的亞基。p150glued突變已被證實與Perry綜合征（一種特殊帕金森綜合征）、肌萎縮側(cè)索硬化癥、進行性核上性麻痹等神經(jīng)退行性病相關(guān)[28]。Watson等[29]發(fā)現(xiàn)p150glued通過其C端與Sec23相互作用，介導ERES和微管相連，促進蛋白從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)至高爾基體的運輸。此外，Verissimo等[30]發(fā)現(xiàn)p150glued還有穩(wěn)定COPII有被小泡在ERES組裝的功能，且這一效應不依賴于p150glued和微管的相互作用。而利用p150glued C端片段競爭性抑制p150glued與Sec23的相互作用顯著降低了ERES對分泌蛋白的輸出。

ERES功能異常會導致蛋白無法正常被輸出，大量沉積在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，從而導致或加劇內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激。Joo等[22]發(fā)現(xiàn)ULK1通過磷酸化Sec16A促進ERES的形成，而ULK1表達缺失抑制ERES的形成以及蛋白輸出，導致細胞核中CHOP大量增加，提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的發(fā)生；而過表達Sec16A則可明顯逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激是神經(jīng)退行性病的一個共同病理過程，因而可以推測ERES功能異?？赡芡ㄟ^引起或加劇內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激參與神經(jīng)退行性病發(fā)病。此外，ERES功能障礙還會導致重要的神經(jīng)元膜蛋白，如谷氨酸受體無法被分泌運送表達于膜上[27]，從而影響神經(jīng)傳遞，加劇神經(jīng)退行性病變。近來的研究發(fā)現(xiàn)LRRK2突變可導致多巴胺能神經(jīng)元胞膜上多巴胺受體及多巴胺轉(zhuǎn)運體表達異常[31,32]，這一現(xiàn)象可能也是由LRRK2對ERES功能的調(diào)節(jié)功能介導的，因此在今后的研究中明確LRRK2對蛋白分泌的調(diào)節(jié)對于闡述帕金森病的發(fā)病機制有重要意義。

6 小結(jié)

ERES作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上COPII有被小泡形成的部位，是蛋白分泌的重要環(huán)節(jié)，Sec16是ERES的關(guān)鍵蛋白，Sec16可通過和多個COPII有被小泡組裝蛋白Sec12、Sar1、Sec23/Sec24、Sec13/Sec31相互作用，對上述蛋白進行募集或通過調(diào)節(jié)Sar1活性以形成或維持ERES。ERES的功能受到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激、細胞自噬、以及MAPK信號通路的調(diào)節(jié)。此外，神經(jīng)退行性病相關(guān)蛋白LRRK2和p150glued也作用于ERES。這種機制有著重要的病理意義，LRRK2和p150glued對ERES的調(diào)節(jié)可能會導致多個神經(jīng)元膜蛋白如谷氨酸受體、多巴胺受體、多巴胺轉(zhuǎn)運體等在胞膜上異常分布；或多種蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中沉積誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，從而參與多種神經(jīng)退行性病的發(fā)病。因此，明確LRRK2和p150glued以及其他神經(jīng)退行性疾病相關(guān)蛋白調(diào)節(jié)蛋白分泌的機制是未來研究神經(jīng)退行性病的發(fā)病機制的一個重要方向。