張丹參 張健美

河北科技大學(xué)，石家莊，050000，中國

肺炎（pneumocystis carinii pneumonia，PCP）是由流感病毒引起的一種急性呼吸道傳染性疾病，是指終末氣道、肺泡和肺間質(zhì)的炎癥，可由病原微生物、免疫損傷、理化因素、過敏等因素所致［1］。通常所講的肺炎主要是指細(xì)菌感染引起的肺炎，是最常見一種，典型臨床表現(xiàn)主要有寒顫與高熱，咳嗽咳痰，呼吸困難，胸痛，嚴(yán)重者可出現(xiàn)神志模糊、煩躁、嗜睡、昏迷等［2］，具有流行廣、傳染性強(qiáng)的特點(diǎn)，嚴(yán)重威脅人類的健康，因此建立合適的肺炎動(dòng)物模型對人類臨床研究具有重大意義。本文對誘導(dǎo)肺炎動(dòng)物模型進(jìn)行了整理，希望為肺炎相關(guān)機(jī)制的研究及抗肺炎制劑的開發(fā)提供一定的參考和依據(jù)。

肺炎的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對象多為鼠科類，包括大鼠、小鼠、倉鼠、豚鼠、裸鼠，但也有人用豬、犬、猴和新西蘭白兔［1］。研究顯示大鼠是建立肺炎模型較為理想的動(dòng)物，具有死亡率低、陽性率高、易得到較多數(shù)量菌體等優(yōu)點(diǎn)。肺炎是威脅人類健康的重要疾病，隨著社會(huì)人口的老齡化、免疫受損宿主的增加、病原體的變遷和抗生素耐藥性的上升，肺炎的治療表現(xiàn)為治療困難、病死率高、預(yù)后差等特點(diǎn)。在肺炎的動(dòng)物模型方面，國內(nèi)外學(xué)者先后建立了多種類型的肺炎模型，這些模型的建立為研究肺炎的發(fā)病機(jī)制和評價(jià)治療水平奠定了基礎(chǔ)［3］。

1 動(dòng)物的選擇

1.1 大鼠

大鼠是建立肺炎動(dòng)物模型常用的動(dòng)物之一，經(jīng)皮肺穿刺法和經(jīng)皮氣管穿刺法適合大鼠肺炎模型的建立，一是操作時(shí)直接用胰島素注射器插入大鼠右肺中葉后注入肺炎鏈球菌，二是用微量注射器吸取一定量菌液于環(huán)狀軟骨之間插入氣管后注射菌液，后直立動(dòng)物，使得菌液均勻到達(dá)兩肺，此兩種方法用大鼠更容易操作更快速建立動(dòng)物模型［3］。

1.2 小鼠

小劑量、反復(fù)式鼻腔吸入接種更適用于小鼠造模，損傷小，死亡率低，操作簡單，目前小鼠是建立衣原體肺炎模型的最佳實(shí)驗(yàn)對象［4］。

1.3 新西蘭白兔

李斌等［5］采用經(jīng)皮氣管穿刺法和鼻噴霧吸入法反復(fù)感染家兔，其結(jié)果均成功建立肺炎模型，采用新西蘭白兔此種方法具有可操作性、可控性、可適性等優(yōu)點(diǎn)。

2 誘發(fā)肺炎的感染途徑及方法

肺炎的接種方式中，不同細(xì)菌攻擊方式對實(shí)驗(yàn)結(jié)果有明顯差異。文獻(xiàn)報(bào)道不一，常用的有氣管插管法、經(jīng)鼻腔滴入法、腹腔注射感染法、吸煙感染法、放射性感染法等。國外文獻(xiàn)有密閉定流量細(xì)菌噴霧箱及氣管切開細(xì)菌注入等。

2.1 經(jīng)鼻感染法

經(jīng)鼻感染法就是將一定濃度的細(xì)菌混懸液經(jīng)一側(cè)鼻腔滴入，動(dòng)物處于垂直位約1～2 min，使菌液進(jìn)入肺內(nèi)，此操作簡單［1］。滴鼻法制備肺炎模型操作簡單，可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)的病原體選擇不同種屬、不同狀態(tài)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。但其可控性差，菌液可停留在鼻咽部、進(jìn)入消化道或者因呼氣、打噴嚏而丟失，使劑量難以確定，導(dǎo)致模型不穩(wěn)定。經(jīng)鼻吸入法多采用密閉定流量細(xì)菌噴霧箱，將一定濃度的菌液置超聲霧化器中，以一定的霧化速度開啟霧化器，霧化器接入塑料容器其中1個(gè)入口，從另外一端的出口排出，霧化一定時(shí)間，此可大批量同時(shí)操作，動(dòng)物間差異小，相似性、重復(fù)性、可靠性、適用性、可控性均較高，操作較簡易，傷口感染、出血等并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)小，更符合真實(shí)的感染途徑，可模擬臨床細(xì)菌感染性肺炎的整個(gè)過程，利于臨床研究，實(shí)用性強(qiáng)，但設(shè)備較復(fù)雜，且易造成對環(huán)境及實(shí)驗(yàn)人員的污染和傷害［1］。

這些實(shí)驗(yàn)方法在操作過程中各有優(yōu)缺點(diǎn)：①氣管插管法，操作相對復(fù)雜；②經(jīng)鼻滴入，操作簡便，但接種動(dòng)物通過咽喉反射致部分接種菌液進(jìn)入消化道，致使劑量難以確定；③氣管穿刺能準(zhǔn)確把握接種菌液劑量，但難以準(zhǔn)確定位穿刺部位，因此有一定難度；④密閉定流量細(xì)菌噴霧箱需要較為復(fù)雜的設(shè)備，而且易造成對環(huán)境的污染；⑤直視下氣管穿刺法，雖操作簡單、劑量易控制、效果肯定，但應(yīng)注意正規(guī)無菌操作，否則以免引起大鼠局部或全身感染，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2.1.1 小鼠經(jīng)鼻感染法

清潔級(jí)BALB/c 小鼠，8～9周齡，體質(zhì)量20～25 g，先將動(dòng)物用乙醚吸入麻醉，然后用加樣器吸取相應(yīng)體積的肺炎支原體菌液或生理鹽水緩慢滴入小鼠的鼻腔引發(fā)肺炎［6］。研究表明鼻黏膜滴注是模仿自然感染的最佳途徑，胡起波等［7］通過滴鼻法成功制備了BALB/c小鼠肺炎支原體（mycoplasma，MP）肺炎模型，并證實(shí)小劑量、間隔式的反復(fù)滴鼻接種方法更易于造成小鼠MP 感染。孟一鳴等［8］通過實(shí)驗(yàn)證明小鼠淺麻醉狀態(tài)下，破損鼻黏膜，滴注一定量肺炎鏈球菌菌液。于3 d、7 d、14 d 和21 d 分別處死小鼠，取肺臟進(jìn)行組織病理學(xué)觀察，確定肺炎小鼠模型制備的最佳方式。結(jié)果鼻黏膜破損組小鼠3 d 時(shí)肺泡間隔內(nèi)毛細(xì)血管擴(kuò)張，肺泡腔內(nèi)以紅細(xì)胞和纖維素滲出為主；7 d 時(shí)病變以纖維素和中性粒細(xì)胞浸潤為主；14 d 時(shí)肺泡腔內(nèi)滲出減少，炎癥開始減輕；21 d 時(shí)肺臟外觀趨于正常，肺泡腔內(nèi)滲出物質(zhì)基本溶解吸收。

2.1.2 恒河猴經(jīng)鼻感染致肺炎法

黎東明等［9］用H5N1 病毒感染恒河猴，建立非致死性流感病毒性肺炎模型，以H5N1 病毒液經(jīng)鼻滴入恒河猴，染毒后第0 h、12 h、1 d、2 d、3 d、4 d、6 d、10 d、12 d 和14 d 采血作血液學(xué)和流感特異抗體檢測，實(shí)驗(yàn)前恒河猴麻醉后將體溫芯片植入其頸部后方、肩胛骨上方的背中線位置，用數(shù)據(jù)收集器掃描芯片來測量猴的體溫，觀察是否出現(xiàn)流感相關(guān)癥狀和體征，每天2次。感染前按照0.2 mL·kg-1氯胺酮肌肉注射麻醉恒河猴后，經(jīng)鼻向1～4 號(hào)恒河猴滴入H5N1 病毒液2 mL，結(jié)果表明經(jīng)鼻感染后可成功建立非致死性流感病毒性肺炎模型。

2.2 經(jīng)氣管感染法

分為器官穿刺和氣管插管，穿刺通常將麻醉動(dòng)物的頸部切開，暴露氣管后，進(jìn)樣針穿刺氣管注射菌液；插管操作相對復(fù)雜，有內(nèi)窺鏡輔助插管、氣管切開下插管、直視下鋼絲引導(dǎo)插管、盲插［10］。該法可以直接有效地將細(xì)菌接種到肺內(nèi)，劑量控制準(zhǔn)確，但難以準(zhǔn)確定位穿刺部位，刺穿法導(dǎo)管完全進(jìn)入氣管，可以使菌液快速到達(dá)肺氣管，避免了模型動(dòng)物因菌液堵塞下段氣管造成的窒息，雖快速簡便，但操作對動(dòng)物機(jī)體傷害比較大。

2.2.1 新西蘭白兔經(jīng)氣管感染法

李斌等［5］采用經(jīng)皮氣管穿刺法，用新西蘭大白兔成功制備了銅綠假單胞菌肺炎動(dòng)物模型，將 48只兔隨機(jī)分為4組，每組12只：經(jīng)皮氣管穿刺組（A組）、經(jīng)鼻噴霧吸入組（B組）、穿刺對照組（C組）、吸入對照組（D組），于上海市公共衛(wèi)生臨床中心 P2 實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物房內(nèi)分籠飼養(yǎng)。經(jīng)耳緣靜脈注射 2 % 戊巴比妥鈉1 mL·kg-1麻醉后，A組用 2 mL 一次性無菌注射器吸取1.5×108CFU·mL-1的菌懸液 1.5 mL 采用經(jīng)皮氣管穿刺法接種，B組用噴霧吸入器使家兔經(jīng)鼻咽吸入等量菌懸液；C、D組接種感染方式分別與 A、B組相同，以 1.5 mL 無菌生理鹽水替代菌懸液。所有兔均隔日施以處理因素，35 d 后停止。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明使用經(jīng)皮氣管穿刺法和噴霧吸入法接種 PA 至新西蘭兔肺部均可成功建立兔 PA 急慢性病程演變的原發(fā)肺部感染模型。

2.2.2 大鼠經(jīng)氣管感染法

郭向華等［11］探討人工綠膿桿菌（pseudomonas aruginosa，PA）生物膜肺部感染大鼠模型肺部細(xì)胞因子水平的變化，由支氣管內(nèi)直接注入PA（菌種為PAO579）藻酸鹽微粒（1×109CFU·mL-1），建立慢性PA 生物膜肺部感染大鼠模型，以支氣管內(nèi)注入生理鹽水作為對照，兩周后評估各組動(dòng)物肺部白細(xì)胞介素（interleukin-4，IL-4）、γ-干擾素（interferon-γ，IFN-γ）及肺腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）水平及肺組織病理學(xué)的變化，結(jié)果成功建立大鼠肺炎動(dòng)物模型。姚澤忠等人［12］將SD 大鼠用異氟醚麻醉，迅速綁扎在固定臺(tái)上，用止血鉗拉舌固定于口外。接種時(shí)在小兒喉鏡提供光源情況下，一人用長葉鼻鏡暴露聲門，并且用帶內(nèi)芯的切合大鼠氣管直徑（1 mm 左右）的導(dǎo)管緩緩插入氣管，待插入適當(dāng)（0.5 cm 左右）的深度后；另一人緩緩拔出導(dǎo)絲，用注射器把已準(zhǔn)備好的0.2 mL 菌液經(jīng)導(dǎo)管注入模型組大鼠氣管，再注入少許空氣，使菌液盡可能全部進(jìn)入氣管。立即豎立固定臺(tái)，使大鼠保持直立位約20 s，并左右搖晃，使菌液均勻分布于兩肺，建立肺炎模型。

2.2.3 小鼠經(jīng)氣管感染法

肖舒心等［13］建立耳窺鏡直視下氣管插管法構(gòu)建小鼠鮑曼不動(dòng)桿菌肺炎模型，采用美國Braintree 公司工具盒建立在耳窺鏡直視下小鼠氣管插管方法。采用1.25% 2，2，2-三溴乙醇（25 mg·kg-1）腹腔注射，待小鼠麻醉后仰臥位固定小鼠于嚙齒動(dòng)物工作臺(tái)上，采用門齒環(huán)一端鉤住小鼠門齒，另一端固定于操作臺(tái)，緩慢傾斜工作臺(tái)至45°，操作者右手持直頭鑷牽拉小鼠舌頭，左手持帶電池手柄的耳窺鏡，耳窺鏡尖端深入小鼠舌上，透過耳窺鏡的放大鏡，操作者可觀察到小鼠的聲門隨呼吸而開啟、閉合。在小鼠聲門開啟的瞬間，操作者迅速將已安裝氣管插管的氣管內(nèi)導(dǎo)管插入氣道，并退出導(dǎo)管。將喉鏡緊貼氣管插管口，喉鏡表面有霧氣形成表明插管成功。

2.3 腹腔注射感染法

給小鼠腹腔注射細(xì)胞病毒建立間質(zhì)性肺炎模型［14］。構(gòu)建的模型表現(xiàn)出肺泡壁增厚、水腫，以大量單核細(xì)胞為主的炎性細(xì)胞浸潤，肺泡腔內(nèi)有蛋白滲出，肺組織細(xì)胞壞死，正常細(xì)胞器結(jié)構(gòu)消失，該法雖然能構(gòu)建出肺炎模型，但其與生理情況感染方式大不同，實(shí)用性不強(qiáng)。候舒［15］等人取4周齡SPF 級(jí)BALB/c 小鼠60只隨機(jī)分成6組，建立人巨細(xì)胞病毒HCMV 小鼠肺炎模型。

2.4 吸煙感染法

將小鼠在密閉玻璃吸煙箱內(nèi)，每天被動(dòng)吸煙其吸入量與干濕肺重比、白細(xì)胞數(shù)目以及炎癥因子值呈線性關(guān)系。小鼠對于吸煙暴露有較好的耐受性與敏感性，是急性吸煙建模的良好選擇。將ICR 小鼠，在密閉玻璃吸煙箱內(nèi)，每天被動(dòng)吸煙3次，一次2 支，每次持續(xù)20 min，ICR 小鼠急性吸煙3 d為急性炎癥的高峰，干濕肺重比、白細(xì)胞數(shù)目以及炎癥因子MPO、TNF-α、MMP-12 的活性均在3 d 達(dá)到峰值，之后遷延轉(zhuǎn)入慢性炎癥［9］。

2.5 放射性感染法

胸部照射選擇全胸照射，照射方法采用直線加速器大劑量單次照射［1］。用濃度為10%的水合氯醛對大鼠麻醉處理之后，讓其保持仰臥狀態(tài)，將大鼠四肢固定在照射臺(tái)之上，確保胸部處于暴露狀態(tài)，且用鉛板將頭部和腹部進(jìn)行遮擋，調(diào)整照射的范圍，使照射范圍自大鼠雙上肢兩腋窩中點(diǎn)連線至劍突水平［16-17］。放射性感染法：一般于放療后的第1 到第3個(gè)月開始出現(xiàn)。放射性肺炎的發(fā)生、嚴(yán)重程度主要與照射方法、照射劑量、照射面積和照射速度有關(guān)［17］。

2.5.1 大白兔放射性感染法

用新西蘭大白兔制備放射性肺炎模型，家兔麻醉后仰臥位固定，先CT 掃描定位全肺，勾畫出照射靶區(qū)，用鉛塊遮擋靶區(qū)以外區(qū)域，6 MV-X 射線單次大劑量照射單側(cè)肺，前后對穿射野，總劑量為25 Gy，吸收劑量率2 Gy·min-1，照射距離100 cm。實(shí)驗(yàn)組兔的肺在照射1 h 后即出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤，12～24 h 肺泡壁開始明顯增厚；肺組織觀察顯示照射2周后，在肺組織表面和切面出現(xiàn)出血點(diǎn)，照射16周后的兔肺組織明顯皺縮，色澤蒼白，各葉分界不清，中量混濁胸水。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，單肺單次MV-X 射線25 Gy 劑量照射能制作可靠、穩(wěn)定的兔放射性肺炎模型。

2.5.2 小鼠放射感染致肺炎

用6 MV-X 射線對C57BL/6 小鼠進(jìn)行單次全胸照射建立放射性肺炎模型，照射劑量18 Gy，照射野30 cm×1.8 cm（1.8 cm為小鼠頸部至胸段距離），吸收劑量率200 c Gy.min-1，距離100 cm［16］。

3 誘發(fā)肺炎動(dòng)物模型的病原體及方法

3.1 大腸桿菌致肺炎動(dòng)物模型

李惠德等［20］建立了大腸桿菌肺炎動(dòng)物模型，大腸桿菌于營養(yǎng)瓊脂斜面存種，4℃冰箱保存，使用前在無菌操作臺(tái)用內(nèi)接種環(huán)勾取，轉(zhuǎn)種于普通肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，置37℃恒溫箱內(nèi)增菌48 h，用0.9%氯化鈉稀釋計(jì)數(shù)，滴定濃度為每毫升3.8×106個(gè)，用于感染動(dòng)物。

新西蘭白兔，體重1.7～2.3 kg，背位固定，用細(xì)繩牽引門齒，充分暴露頸部，剪去頸周兔毛，用75% 乙醇消毒，將抽取大腸桿菌液的注射器經(jīng)皮膚插入環(huán)狀軟骨下的氣管內(nèi)，回抽見有大量氣泡后注入菌液0.8～1.2 mL·kg-1，然后抬高兔頭頸部，使菌液緩慢流入氣管下段及肺部。

家兔接種后0.5～1 h 出現(xiàn)噴嚏、喉鳴、拒食、聳毛、蜷縮、顫抖，持續(xù)1～3 h，于5～6 h 體溫上升，聳毛、蜷縮、顫抖消失，并開始飲水。12 h 體溫顯著升高，呼吸增快，煩躁不安。部分動(dòng)物出現(xiàn)紫紺。病理檢查肺臟明顯充血、水腫，有瘀點(diǎn)、出血點(diǎn)或出血，斑點(diǎn)、斑片彌漫兩側(cè)肺葉。病灶區(qū)肺泡腔內(nèi)充滿大量中性粒細(xì)胞及少許嗜酸性粒細(xì)胞。病灶中央或周邊可見發(fā)炎的細(xì)支氣管，管壁充血，有少量中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞浸潤。部分粘膜上皮細(xì)胞壞死、脫落［21］。

3.2 肺炎克雷伯桿菌致肺炎動(dòng)物模型

陳業(yè)民等［18］將肺炎克雷伯桿菌菌種、增毒、鑒定、培養(yǎng)后稀釋成1×107CFU·mL-1的混懸液，用于感染動(dòng)物。Wistat 大鼠，180～240 g，乙醚麻醉，垂直固定，顯露聲門，用12 號(hào)鈍頭針頭插入氣管內(nèi)，注入細(xì)菌混懸液0.1 mL（含細(xì)菌量1×106CFU），保持垂直體位5 min。動(dòng)物在感染后約5～12 h 后出現(xiàn)不活潑、納差、對外界反應(yīng)遲鈍、背部微弓，繼而四肢癱瘓，肺部病變嚴(yán)重者出現(xiàn)呼吸表淺而急促，最后呼吸微弱而死亡。免疫學(xué)檢查顯示細(xì)胞免疫功能低下，CD3+、CD4+細(xì)胞減少，巨噬細(xì)胞吞噬功能明顯降低。肺組織病理學(xué)檢查可分為三度，輕度表現(xiàn)為支氣管和細(xì)支氣管周圍及肺泡內(nèi)有滲出和中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤，間質(zhì)毛細(xì)血管充血。中度表現(xiàn)為多個(gè)細(xì)支氣管及肺泡灶性炎細(xì)胞浸潤、充血、出血。重度表現(xiàn)為片狀炎細(xì)胞浸潤、充血、出血。部分動(dòng)物肺門淋巴結(jié)反應(yīng)性增生，個(gè)別肺內(nèi)出現(xiàn)小膿腫。肺水腫表現(xiàn)不明顯。

3.3 肺炎支原體致肺炎動(dòng)物模型

3.3.1 肺炎支原體致小鼠肺炎動(dòng)物模型

劉曉紅等［22］BALB/c 小鼠按體重隨機(jī)分組，在0、1、2 d 滴鼻感染肺炎支原體菌液，在0～21 d 分批宰殺，并分批設(shè)立滴注培養(yǎng)基的對照組，以0～26 分的組織病理學(xué)評分來確定肺部的炎癥反應(yīng)程度，所有實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物的病原學(xué)診斷均作了肺勻漿支原體培養(yǎng)或肺勻漿的支原體PCR 鑒定，于感染1、3、4、6、8、14 d 以 ELISA方法檢測了血清干擾素-γ的含量。

3.3.2 肺炎支原體致大鼠肺炎動(dòng)物模型

李繼昌等［23］利用Wistar 大鼠，180～200 g，經(jīng)1周飼養(yǎng)觀察后，挑取健康者40只，雌雄各半，按體重和性別隨機(jī)分成2組，正常對照組15只，肺炎支原體感染組25只。置于3 級(jí)清潔動(dòng)物室，在標(biāo)準(zhǔn)條件下分籠飼養(yǎng)。將106CFU·mL-1的肺炎支原體培養(yǎng)液緩慢地滴入鼻孔內(nèi)，利用其自然吸氣式動(dòng)作，將菌液吸入氣道至肺部。每日1次，每次0.2 mL。接種后每日觀察其活動(dòng)、進(jìn)食等情況。

3.3.3 肺炎支原體致金黃地鼠肺炎動(dòng)物模型

金黃地鼠，體重85～100 g，苯巴比妥鈉10 mg 腹腔注射麻醉［24］。取對數(shù)生長期肺炎支原體液0.2 mL 鼻腔內(nèi)滴入。肺組織病理學(xué)檢查可見，間質(zhì)水腫、毛細(xì)血管擴(kuò)張、淋巴細(xì)胞浸潤等間質(zhì)性肺炎的典型改變。超微病理學(xué)檢查可發(fā)現(xiàn)支原體，在透射電鏡下其形態(tài)多樣化，有球形、橢圓形、長絲狀及不規(guī)則狀，表面為單位膜所包繞，膜內(nèi)可見3 mm 大小電子密度高的絲狀結(jié)構(gòu)，與電子密度高、大小約14 mm 的顆粒相連，它們和核糖體組成支原體的主要成分。

3.4 白色念珠菌致肺炎模型

李軍等［25］研究結(jié)果，家兔，體重2～2.5 kg，于實(shí)驗(yàn)第1～5 d，每天耳緣靜脈注射阿糖胞苷440 mg·m-2，6 天后隔日1次維持低免疫狀態(tài)。第4 日起，給予萬古霉素15 mg·kg-1、頭孢他定150 mg·kg-1靜脈注射，每日1次；慶大霉素5 mg·kg-1靜脈注射，隔日1次，預(yù)防細(xì)菌感染。

采用分區(qū)劃線法將復(fù)活后的白色念珠菌接種于科瑪嘉顯色培養(yǎng)基上，放入37℃溫箱，孵育24 h，平皿上可見密度不等、表面光滑、圓形翠綠色菌落。將分離培養(yǎng)的白念菌接種于50 mL 沙保羅液體培養(yǎng)基中，置于37℃振蕩培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)18 h。以3 000 r·min-1離心5 min，棄上清，反復(fù)加入無菌生理鹽水10 mL 沖洗2次。將離心后的沉淀物加入生理鹽水5 mL 混勻，制成菌液，顯微鏡下，用計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)菌液的濃度。調(diào)整原菌液濃度為每毫升5×108個(gè)，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆?。于? 日采用經(jīng)皮氣管穿刺法接種：將麻醉后的動(dòng)物固定于手術(shù)操作臺(tái)上，以左手拇指示指固定氣管，向氣管內(nèi)注入白色念珠菌菌液0.2 mL（含白色念珠菌1×108個(gè)），立即將家兔取頭高腳低位，使菌液易進(jìn)入氣管下部。

肺組織病理變化可見，d1 鏡下氣道內(nèi)可見真菌孢子。d3 肺組織表面可見大小不一的灰白色病灶，柔軟、無硬節(jié)；支氣管內(nèi)見少許分泌物，氣道周有淋巴、單核細(xì)胞浸潤，肺組織充血、瘀血，部分肺泡內(nèi)有蛋白樣物及炎細(xì)胞滲出，部分肺泡代償性擴(kuò)張，肺泡間質(zhì)有少許陳舊性出血（含鐵血黃素）；肺組織內(nèi)有片狀壞死灶，界限較清晰，肺組織呈干酪樣壞死，肺泡結(jié)構(gòu)尚存，腔內(nèi)為壞死物及少量孢子。d5 肺組織表面可見大小不一的圓形、灰黑色病灶，觸之呈結(jié)節(jié)狀，質(zhì)硬；部分支氣管內(nèi)為脫落的上皮細(xì)胞，粘膜下見淋巴細(xì)胞聚集，部分小支氣管內(nèi)含孢子及菌絲的壞死物，部分氣管粘膜及氣道壁軟組織破壞，小氣管周圍大量淋巴細(xì)胞增生、包繞，巨噬細(xì)胞增生，肺組織內(nèi)有大量灰白結(jié)節(jié)病灶，鏡下病灶界限清晰，中心為干酪樣壞死，內(nèi)含大量孢子、菌絲，肺泡結(jié)構(gòu)消失，周圍大量淋巴細(xì)胞包繞，周圍組織之間多個(gè)小灶狀病灶，肺泡上皮部分脫落，肺泡腔內(nèi)見多數(shù)巨噬細(xì)胞，部分肺泡代償性擴(kuò)張，部分肺泡破裂融合成肺大泡。

3.5 呼吸道合胞病毒（RSV）致肺炎模型

田曼等［26］建立呼吸道合胞病毒模型。雌性豚鼠，月齡1個(gè)月左右，體重225～300 g，適應(yīng)環(huán)境3 d。①病毒懸液制備：RSV 毒株接種于Hep-2 細(xì)胞上，按常規(guī)培養(yǎng)，在細(xì)胞融合病變最明顯時(shí)，用力振蕩細(xì)胞瓶，使細(xì)胞從瓶壁脫落，反復(fù)凍融3次，4℃離心（800×g，10 min），去除細(xì)胞散片。收集病毒懸液，進(jìn)行病毒滴定，用于動(dòng)物接種。②動(dòng)物接種：動(dòng)物麻醉完全后，鼻腔內(nèi)緩慢滴入100TCID50病毒懸液0.5 mL，每天1次，連滴3 d。③肺組織標(biāo)本處理：采用急性失血法處死豚鼠，無菌條件下取出部分肺組織置于滅菌Hank’s 液中，做病毒分離用，其余肺組織做光鏡與電鏡檢查。④肺組織病毒分離：無菌條件下，剪碎新鮮的肺組織標(biāo)本，研磨后接種到Hep-2 細(xì)胞瓶中，觀察細(xì)胞病變，待細(xì)胞融合病變時(shí)，收取標(biāo)本，用免疫熒光法鑒定RSV。⑤免疫熒光法：含有病毒抗原的Hep-2 細(xì)胞制成抗原片，冷丙酮固定20 min，取出晾干。每孔加入1 滴RSF/FITC 抗體試劑，37℃溫盒孵育30 min，晾干后用基質(zhì)液封片，移至熒光顯微鏡下觀察。

結(jié)果表明，病毒接種后6 d 的肺組織標(biāo)本，病毒培養(yǎng)后均在第一、二代內(nèi)出現(xiàn)細(xì)胞融合病變，病毒接種后14 d，部分動(dòng)物肺組織分離出RSV。病毒分離陽性的標(biāo)本，熒光顯微鏡下可以觀察到細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)發(fā)熒光的結(jié)構(gòu)物，顆粒狀或彌散狀分布，呈蘋果綠色。

光鏡下可見，RSV 接種后d 6，豚鼠均患間質(zhì)性肺炎。小氣道、血管周間質(zhì)及實(shí)變區(qū)中有大量淋巴細(xì)胞浸潤；細(xì)支氣管的微血管內(nèi)出現(xiàn)大量淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性及嗜酸性粒細(xì)胞，上皮細(xì)胞增生肥大或壞死、脫落；肺泡隔增寬，肺泡隔中有淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞及嗜酸性粒細(xì)胞浸潤，肺泡上皮腫脹、間質(zhì)水腫。RSV 接種后d14，以上病理改變基本消失。

電鏡下可見，RSV 接種后d 6，肺泡Ⅰ型上皮細(xì)胞腫脹，核周胞質(zhì)中線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)減少，線粒體基質(zhì)變淡，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴(kuò)張。肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞顯著增生、融合，板層小體結(jié)構(gòu)松散、空泡化，多數(shù)板層小體被排出，堆積于肺泡表面或散落于肺泡腔內(nèi)。釋放于肺泡腔內(nèi)完整的病毒顆粒，直徑約150～200 nm，呈不規(guī)則的表面粗糙的球形或絲狀體，表面有脂蛋白包膜，包膜內(nèi)有等螺距盤繞的核衣殼。

3.6 卡氏肺孢子蟲致肺炎大鼠模型

3.6.1 卡氏肺孢子蟲致大鼠肺炎模型

陳勝霞等［27］建立了卡氏肺孢子蟲肺炎大鼠模型，Wistar 大鼠或SD 大鼠，清潔級(jí)，雄性，體質(zhì)量為200～250 g，于腹股溝皮下注射醋酸可的松注射液每只25 mg，每周2次，共8周，同時(shí)飲用含四環(huán)素1 g·mL-1的冷開水以預(yù)防細(xì)菌感染，給予通常含蛋白質(zhì)23%顆粒飼料喂養(yǎng)，飲水量不加限制。誘導(dǎo)8周后，腹腔注射40 mg·kg-1苯巴比妥鈉麻醉大鼠，消毒頸部及腹部，剖開腹腔，經(jīng)腹主動(dòng)脈采血致死；切開頸部，部分剪開氣管，用連有10 mL 注射器的引流管插入氣管下端并固定，注入5 mL 生理鹽水，反復(fù)抽吸收集支氣管肺泡灌洗液（broncho-alveolar lavage fluid，BALF）；解剖分離取出整肺，將氣管、支氣管近端不同肺葉的肺組織切開，作印片3 張；BALF 于2 000 r·min-1離心15 min，留取沉淀物作涂片3 張。BALF 涂片及肺印片作Giemsa 染色，油鏡下觀察100個(gè)視野檢查Pc 包囊與滋養(yǎng)體。

顏蘋蘋等［28］將大鼠經(jīng)醋酸可的松誘導(dǎo)后，從第3周開始出現(xiàn)消瘦、被毛蓬松、精神萎靡、呼吸急促，開始出現(xiàn)死亡。在肺印片和BALF 涂片中查見含有2～8個(gè)囊內(nèi)小體的Pc 包囊以及成簇出現(xiàn)的滋養(yǎng)體，但肺印片中的蟲體數(shù)量多于BALF 涂片，故易于檢獲。死亡鼠前5周以查見包囊為主，5周后（包括第5周）滋養(yǎng)體的數(shù)量明顯多于包囊，且滋養(yǎng)體、包囊的數(shù)量明顯多于5周前，死亡鼠以滋養(yǎng)體更為多見。

倪小毅等［29］建立了一種改良卡氏肺孢子蟲肺炎動(dòng)物模型。為了縮短誘發(fā)大鼠卡氏肺孢子蟲肺炎的時(shí)間，減少二重感染，采用地塞米松2.5 mg 皮下注射Wistar大鼠，每周2次，共4周。第2周時(shí)，氣管內(nèi)注入凍存的卡氏肺孢子蟲，4周后剖殺大鼠。結(jié)果表明，在抑制大鼠免疫功能的同時(shí)氣管內(nèi)注入凍存的卡氏肺孢子蟲，可縮短大鼠發(fā)生卡氏肺孢子蟲肺炎的時(shí)間，并明顯減少二重感染。液氮凍存的卡氏肺孢子蟲種，可凍存三個(gè)月以上，隨時(shí)解凍取用。李自慧［30］等人綜述了卡氏肺抱子蟲肺炎動(dòng)物模型及蟲體體外培養(yǎng)研究，一般采用免疫抑制劑誘導(dǎo)的傳統(tǒng)方法，同時(shí)給予抗生素預(yù)防感染。糖皮質(zhì)類激素是最常用的免疫抑制劑。其給藥途徑，既可經(jīng)口（將激素加在動(dòng)物的飲水中，讓其自行飲用），也可經(jīng)皮下注射。經(jīng)口給予的藥物有醋酸地塞米松、強(qiáng)的松龍等，其誘導(dǎo)成功率較低；而皮下注射的成功率較高，其藥物有地塞米松、醋酸可的松和氫化可的松等，誘導(dǎo)劑量每次 25 mg（大鼠），2次/周，共6～12周。無論口服或注射給藥，在給予激素的同時(shí)，飲水中需加四環(huán)素（0.5～1 mg·mL-1）或其他抗生素，以防止細(xì)菌感染。

3.6.2 卡氏肺孢子蟲致小鼠肺炎模型

陳錫慰等［31］用口服腎上腺皮質(zhì)激素的方法在國產(chǎn)昆明小鼠體內(nèi)成功誘導(dǎo)卡氏肺孢子蟲感染，體質(zhì)量10 g左右，雄性小鼠 30只，雌性24只 。免疫抑制劑采用醋酸氫化潑尼松，每支含125 mg·5 mL-1。對實(shí)驗(yàn)中途死亡的小鼠予以剖胸取肺制作涂片；對出現(xiàn)消瘦、蓬毛、運(yùn)動(dòng)遲緩和呼吸困難的小鼠，則予處死后取肺制備涂片。

3.7 仙臺(tái)病毒致肺炎模型

仙臺(tái)病毒雞胚傳代，保存于-30℃，1個(gè)月內(nèi)使用。ICR 小鼠，18～20 g，乙醚麻醉，從鼻腔內(nèi)滴入仙臺(tái)病毒液50～100 μL。

第2 天起小鼠出現(xiàn)聳毛、蜷縮、少食、少動(dòng)、呼吸急促、飲水增加、大便干燥、體重減輕。10 d 左右慢慢恢復(fù)。d4～7，肺表面顏色不均，有明顯充血和大塊凝血，肺重量和肺指數(shù)增加，在水中半沉浮，切開有紅色液體流出，鏡檢符合以出血和壞死性變化為主的病毒性肺炎急性早期改變。第2周時(shí)肺部充血明顯減輕，肺表面仍可見點(diǎn)狀瘀血。肺重量和肺指數(shù)逐漸降低，切開無紅色液體流出，鏡檢符合病毒性肺炎的中晚期病理改變。d24，肺外觀和肺重、肺指數(shù)基本恢復(fù)正常，鏡檢仍可見終末細(xì)支氣管周圍有淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞、吞噬細(xì)胞浸潤。肺泡間隔增寬，血管擴(kuò)張，散在的淋巴細(xì)胞浸潤，肺泡內(nèi)有吞噬細(xì)胞、巨細(xì)胞和含鐵血黃素沉著，為病毒性肺炎晚期修復(fù)性改變［32］。

4 誘發(fā)肺炎動(dòng)物模型的注意事項(xiàng)

注入菌液過程中應(yīng)緩慢，過快易致菌液咳出。接種劑量和濃度太小，易致接種不成功，接種劑量太大，易致動(dòng)物過早死亡。因此，應(yīng)經(jīng)過反復(fù)預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定接種的最適濃度和劑量，成功建立重癥肺炎動(dòng)物模型，更符合生理要求。經(jīng)鼻滴入時(shí)，動(dòng)物易打噴嚏，經(jīng)氣管感染易使皮膚感染，氣管穿刺法難以準(zhǔn)確定位穿刺部位，需要嫻熟的手術(shù)技巧和嚴(yán)格的無菌操作，以免導(dǎo)致模型動(dòng)物局部或全身感染而死亡。

總之，建立合適的誘導(dǎo)肺炎動(dòng)物模型對肺炎發(fā)病相關(guān)機(jī)制研究，以及肺炎治療藥物的研發(fā)具有重要意義。