李 煒 張丹參

1.河北北方學院藥學系，張家口，075000，中國

2.河北科技大學，石家莊，050018，中國

慢性支氣管炎（chronic bronchitis，CB）是指氣管、支氣管粘膜及其周圍組織的慢性非特異性炎癥。臨床上以長期咳痰或伴有喘息及反復(fù)發(fā)作為特征。慢性咳嗽、咳痰或伴有喘息，每年發(fā)作持續(xù)3 個月，連續(xù)2 年或以上，并能排除心、肺等其他疾患而反復(fù)發(fā)作，部分病例可發(fā)展成阻塞性肺氣腫、慢性肺原性心臟?。?］。此病為常見病，人群患病率4%，多發(fā)于中老年人，50 歲以上可高達13%。慢性支氣管炎發(fā)生的主要原因為病毒和細菌的重復(fù)感染形成了支氣管的慢性非特異性炎癥。當氣溫驟降、呼吸道小血管痙攣缺血、防御功能下降時易致??；煙霧粉塵、污染大氣等慢性刺激亦可發(fā)??；吸煙使支氣管痙攣、粘膜變異、纖毛運動降低、粘液分泌增多，易發(fā)感染。發(fā)病機制尚未完全闡明，炎癥反應(yīng)是其發(fā)生發(fā)展的核心機制，氧化應(yīng)激、多種炎癥因子和炎癥介質(zhì)的介導(dǎo)均起重要作用，粘液高分泌、氣道表面脫水、氣道重塑等則是炎癥的繼發(fā)表現(xiàn)［2］。目前，研究者已構(gòu)建了多種慢性支氣管炎的動物模型，較常見的是使用煙草煙霧、二氧化硫、內(nèi)毒素（脂多糖）、蛋白酶和促分泌物的模型，也有用鎳和硝酸引起的細支氣管炎的報道［3］。用到的動物主要有大鼠、小鼠、倉鼠、豚鼠和狗，使用頻率較低的還有綿羊、猴子、鱷魚等。這些方法在動物氣道粘液細胞的增生和轉(zhuǎn)化的程度或位置、氣道的充血程度、誘導(dǎo)時間和難易程度，以及可重復(fù)性等方面都存在差異。本文通過對這些慢性支氣管炎動物模型的綜述，為相關(guān)研究提供實驗方法和思路，也可為環(huán)境污染物在暴露條件下如何，以及在何種暴露條件下可能加劇呼吸道充血、粘液高分泌等的相關(guān)研究提供參考。

1 煙熏法

該方法是將動物放入制作好的煙室內(nèi)，通入煙霧，待一定時間后將動物取出，根據(jù)需要，重復(fù)不同次數(shù)和天數(shù)，以獲得所需的支氣管損傷模型。由于操作簡便，支氣管慢性炎癥病變確切，成為最常用的方法，也是本次所查閱文獻中提及最多的方法。該方法常用動物有大鼠［4］、小鼠［5］、地鼠［6］、豚鼠［7］等，還有學者用犬、猴、綿羊、雪貂［8］等進行研究的。例如：氣管插管的犬暴露于香煙煙霧（12 支/天）長達一年，導(dǎo)致腺體增生、腺體黏液細胞增多、支氣管上皮增生、支氣管上皮細胞核異型性；每天4 或8 支煙，連續(xù)5 周的綿羊身上發(fā)現(xiàn)了氣管腺肥大；每天12 支煙，每周5 天，最多6 個月的猴子，并沒有顯示出氣管上皮細胞的變化［3］。

所查閱文獻中，大家的方法不同之處主要是煙室的大小、制備煙霧的材料，以及煙熏的時間和頻率，以獲得支氣管不同程度的損傷。以大鼠為例，首先，煙室的大小主要與動物只數(shù)有關(guān)，有研究者每個煙室放入一只動物［9］；有的為了保證每組動物的干預(yù)條件一致，則將成組的10～12 只動物放入同一個煙室［10］。其次，制備煙霧的材料也有所不同，大部分為了模擬現(xiàn)實，多采用鋸末、煙葉，也有的為了制造強煙霧，加入干辣椒、硫磺等［11］，使煙霧更大更刺激。最重要的則是煙熏時間和頻率的選擇，通常每天暴露在煙霧中4 h，至少連續(xù)2～6 周，可誘發(fā)大鼠喉部及氣管近端黏膜下腺體增生，氣管黏液增多。增殖發(fā)生在近端和遠端氣道上皮，以及肺泡上皮。還可出現(xiàn)早期基底細胞的增殖，漿液性細胞表面發(fā)生黏液化生，黏液細胞和上皮細胞增生。在連續(xù)香煙煙熏6 周后，衛(wèi)智權(quán)等研究者還觀察到模型組大鼠其外周血單核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）的核因子-κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）（P65）表達水平顯著升高，表明其體內(nèi)PBMC 大量募集并激活，產(chǎn)生大量的超敏C 反應(yīng)蛋白（hypersensive C-reactive protein，hs-CRP）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等炎癥細胞因子，導(dǎo)致細支氣管慢性炎癥損傷；與此同時PBMC 的核因子-κB 抑制因子-α（nuclear factor kappa B inhibitor-α，IκB-α）表達水平未發(fā)生相應(yīng)幅度的有效上調(diào)，提示其體內(nèi)PBMC 的κB（P65）激活未受到恰當?shù)淖柚苟幱诔掷m(xù)的激活狀態(tài)，導(dǎo)致炎癥持續(xù)而慢性化［12］。超氧化物歧化酶1（superoxide dismutase 1，SOD1）、SOD2、SOD3蛋白及其基因表達均顯著降低（P＜0.01），白細胞介素1（interleukin-1，IL-1）、TNF-α、MDA 水平均顯著升高（P＜0.01）［13］。模型組大鼠外周血CD4+T 淋巴細胞比例明顯升高，IL-2、IL-4 基因表達水平及蛋白表達水平顯著上調(diào)（P＜0.01）［14］。也有研究表明，戒煙后，氣管內(nèi)分泌細胞數(shù)量在9 d 內(nèi)可恢復(fù)到正常水平，肺近端氣道在10～21 d 內(nèi)恢復(fù)到正常水平，肺遠端氣道在43～84 d 內(nèi)恢復(fù)到正常水平［3］。Zheng 等［15］觀察了大鼠20 d、50 d、70 d 持續(xù)接受煙熏，呼吸道和腸道菌群的同步動態(tài)變化。

經(jīng)上述煙霧刺激后，Wistar 大鼠可出現(xiàn)咳嗽、哮鳴、呼吸困難、呼吸道分泌物增多，以及體瘦、毛枯易脫、蜷臥少動等改變。光鏡下可見模型大鼠、小鼠的氣管及支氣管有不同程度的慢性炎細胞（淋巴細胞、漿細胞和單核細胞）浸潤，以及少量中性粒細胞浸潤。管壁大量纖維組織增生，明顯增厚，管腔狹窄，腔內(nèi)充滿分泌物及滲出物，粘膜上皮細胞嚴重受損，呈現(xiàn)纖毛倒伏、粘連，脫落。杯狀細胞增多，內(nèi)含豐富的粘蛋白顆粒。伴行于氣管的小血管周圍有明顯炎細胞浸潤，管腔內(nèi)有較多分泌物及巨噬細胞、多形核白細胞。肺泡隔增寬，有炎細胞浸潤及毛細血管擴張、充血，肺邊緣可見支氣管擴張，甚至出現(xiàn)肺氣腫。電鏡見纖毛結(jié)構(gòu)模糊，纖毛細胞內(nèi)電子密度降低，核膜及細胞膜結(jié)構(gòu)不清，有核固縮現(xiàn)象。線粒體腫脹空泡樣變，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，可見大量次級溶酶體，肺泡上皮受損。此方法比國內(nèi)類似報道需時短，能促使病變早日形成，所出現(xiàn)的病理改變與人類相似，可用于研究被動吸煙所致的支氣管炎癥性疾?。?-16］。

1.1 大鼠強煙霧吸入法

鋸末200 g，煙葉20 g，干辣椒6 g，硫磺1 g，混合后在27 m3（1 m×3 m×9 m）的煙室內(nèi)點燃，形成濃煙霧，濃度約為200 mg·m-3，每天吸入1 h，共44 d［11］。

1.2 小鼠香煙煙霧刺激法

小鼠于10 L 卡口瓶中，瓶蓋留有直徑1.5 cm 通氣孔，下口連接一個三通管，另兩端分別連接50 mL 注射器及點燃的香煙，用注射器通過三通管，連續(xù)通入香煙煙霧，每次400 mL（瓶中煙霧濃度約為4%）煙熏30 min。前10 d 上下午各煙熏一次，后10 d 每天下午煙熏一次，連續(xù)30 次，全程約20 d［5］。

1.3 地鼠香煙煙霧吸入法

采用2 月齡雄性敘利亞金黃地鼠（100～120 g）。吸煙組動物放入自制的吸煙箱中，每次燃燒10 支香煙（八達嶺牌，北京卷煙廠）共3 h，每天燃燒2 次，每周5 天，連續(xù)3 個月［6］。

1.4 豚鼠香煙煙霧吸入法

采用哈特利豚鼠（300～350 g），雌雄兼用，使用市面上出售的過濾嘴卷煙（Cocopalm 牌卷煙），根據(jù)產(chǎn)品規(guī)格，每支香煙含有1.2 mg 尼古丁和13 mg 焦油。動物被放置在一個不銹鋼煙室（80 cm×80 cm×100 cm），意識清醒且不受約束。豚鼠被反復(fù)暴露在每天10 支香煙的煙霧中，每天1 h，連續(xù)6 d 每周，持續(xù)8 周［7］。

2 吸入二氧化硫法

該方法常選用大鼠、小鼠、豚鼠、犬或猴，吸入刺激性氣體（如二氧化硫，氯氣、氨氣等）［3］，也可利用亞硫酸鈉與過量的硫酸反應(yīng)生成SO2［17］，或與細菌感染、復(fù)合性刺激（如細菌加煙霧、二氧化硫加顆粒），數(shù)日后即可出現(xiàn)慢性支氣管炎病變。

小鼠、大鼠及豚鼠吸入二氧化硫法造成慢性支氣管炎病變中，以杯狀細胞增多、柱狀上皮增生及慢性炎癥細胞浸潤最為常見。盡管這些病變程度可能不一致，但它們的綜合出現(xiàn)，特別是在支氣管及末梢細支氣管見到這些改變，就可以作為慢性支氣管炎的形態(tài)學診斷指標。SO2暴露對體外測定的氣管收縮反應(yīng)無影響，暴露于SO2的動物的氣管和肺的中性黏液糖蛋白分別增加了140%和535%，酸性糖蛋白分別增加了33%和37%，這種慢性支氣管炎的動物模型模擬了在人類支氣管炎中觀察到的粘液分泌過多、氣道阻塞和氣道反應(yīng)性增強［18］。上述造模方法，大多需要較長時間，在實驗過程中，應(yīng)考慮到動物支氣管管壁的淋巴組織可能有不同程度的增生，以免影響實驗結(jié)果的正確分析，選擇動物時，也應(yīng)充分考慮這一因素，選擇年齡稍輕、健康狀況良好的動物造模為佳［19］。

2.1 小鼠二氧化硫吸入法

有兩種造模方法：①吸入二氧化硫2%，每天10 s，60 d，第14～18 d 出現(xiàn)支氣管病變，27 d 后出現(xiàn)重型氣管炎病變［20］。②吸入二氧化硫1%，每天20 s，25 d，d 20 出現(xiàn)慢性支氣管炎病變［21］。

2.2 大鼠二氧化硫吸入法

二氧化硫2.3 mL·L-1空氣，每天30 min，d 56 出現(xiàn)慢性支氣管炎病變；吸入二氧化硫3 mL·L-1空氣，每日5 min，每周6 次，45～51 d，d 36～45 出現(xiàn)慢性支氣管痙攣。大鼠暴露于250 ppm SO2氣體中，每天5 h，每周5 d，持續(xù)4 周［22］。

2.3 猴二氧化硫吸入法

吸入SO20.5～0.8 mL·L-1空氣，每日2 h，每周5次，65 d，在50 d 時腺體顯著增生，出現(xiàn)慢性支氣管炎病變［23］。

3 內(nèi)毒素注入法

該方法常使用的動物有大鼠、小鼠，可采用氣管滴注內(nèi)毒素，即脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）的方法建立慢性支氣管炎模型，也可經(jīng)氣道吸入，如氣管內(nèi)注入LPS 200 μg·200 μL-1及每日LPS 溶液霧化吸入1 h，連續(xù)3 周，建立大鼠慢性支氣管炎動物模型［24］。

LPS 是革蘭氏陰性細菌細胞壁的最外層結(jié)構(gòu)，系類脂質(zhì)、多糖及蛋白質(zhì)的復(fù)合物。它可以刺激單核細胞、內(nèi)皮細胞及中性粒細胞合成釋放一系列炎性介質(zhì)，介導(dǎo)多種組織、細胞的損傷。對大鼠氣管滴注小劑量的LPS，可以刺激大鼠肺部中性粒細胞的游出，增加的中性粒細胞可通過釋放蛋白水解酶、氧自由基、一氧化氮（nitric oxide，NO）及其他細胞因子造成支氣管肺組織損傷，從而模擬慢性支氣管炎的病理特征。LPS 還可通過與肺泡巨噬細胞膜上的CD11c/CD18c 和CD14 兩種受體結(jié)合，導(dǎo)致胞漿游離鈣離子濃度升高，進而影響TNFα、IL-1、IL-10、TGF-β1 等細胞因子的合成和分泌，從而引起慢性支氣管局部的炎癥反應(yīng)。該方法操作簡練、污染少、易定量。

3.1 單獨使用LPS

曹強等［25］使用SPF 級雄性SD 大鼠，體重300～350 g，將LPS 200 μg 氣管滴注入氣管內(nèi)，飼養(yǎng)3 周。3 周后，可觀察到模型組的大鼠進食顯著減少，體重增長明顯緩慢，并出現(xiàn)了倦怠、豎毛、毛發(fā)失去光澤等現(xiàn)象。左肺做病理學顯微鏡檢查，病理切片上可見，氣管、支氣管纖毛柱狀上皮部分剝落，粘膜層和粘膜下層有炎性細胞浸潤，腺體增生，分泌旺盛，杯狀細胞顯著增生，以及肺氣腫的形成。同時可以觀察到氣管上皮細胞有鱗狀化生的現(xiàn)象。取大鼠右肺灌洗液，對細胞分類計數(shù)，每張涂片計數(shù)200 個細胞，分別計數(shù)肺巨噬細胞、中性粒細胞和淋巴細胞，模型組均有顯著性差異（P＜0.01），中性粒細胞的數(shù)量明顯增高，而巨噬細胞的數(shù)量顯著降低，導(dǎo)致大鼠的肺部防御功能降低。鄧青南等［26］改進實驗方法，將24 只Wistar 大鼠用2%戊巴比妥鈉（50 mg·kg-1）腹腔注射麻醉，仰臥位固定于操作臺，常規(guī)消毒，縱向切開頸部，分離皮下，暴露氣管，4 號針頭穿刺氣管，給予氣管內(nèi)一次性注入脂多糖200 μg，d 2 開始，連續(xù)4 d 經(jīng)鼻滴入脂多糖50 μg·200 μL-1·d-1。3 周后處死大鼠后觀察病理變化。改進后雙通道脂多糖造模，大鼠肺氣道上皮炎性細胞浸潤、纖毛粘連脫落、杯狀細胞增生、氣道黏液分泌等增加更加明顯，除杯狀細胞增生，其余指標的增加均具有統(tǒng)計學意義。改進后造模方法所致慢支模型在未出現(xiàn)急性肺損傷的情況下，氣道慢性炎癥程度更明顯，氣道黏液分泌更加明顯，這樣更有利于研究慢支痰量過多的實驗研究的開展。

3.2 注入LPS 聯(lián)合煙熏法

王瑛等［27］用雄性二級Wistar 大鼠18 只，鼠齡8 周，體質(zhì)量（180±20）g，分別于1、8、15、22 d，向大鼠氣管內(nèi)緩慢注入LPS 200 μL（脂多糖10 mg 每瓶，購自美國Sigma 公司，用無菌注射用水制成水溶液，1 mg·mL-1），以防窒息。完畢后迅速將大鼠直立旋轉(zhuǎn)10～20 s，使LPS均勻分布于肺部。3～8 d、10～15 d、17～22 d、23～28 d，每天在有機玻璃熏煙箱內(nèi)持續(xù)吸入新鮮的哈德門香煙霧30 min，15 支每次，2 次每天。

3.3 注入LPS 聯(lián)合注射卡介苗法［28-30］

給大鼠尾靜脈注射5 mg·kg-1的卡介苗，7 d 后向大鼠氣管內(nèi)注射1 mg·mL-1的脂多糖，每只注射200 μL，觀察3 周。結(jié)果模型組的大鼠出現(xiàn)倦怠、活力下降、毛發(fā)灰白等癥狀，體重的增加明顯低于正常組（P＜0.01），且在氣道內(nèi)粘液增多，喘息癥狀明顯。鏡下，氣道炎癥細胞增多，氣管、肺泡壁充血，纖毛柱狀上皮脫落，可見部分胼胝體細胞。支氣管平滑肌部分斷裂。采用Ridit 試驗分析炎癥細胞浸潤量，模型組炎癥細胞浸潤量最高。電鏡觀察，模型組大鼠支氣管纖毛數(shù)量減少，變短或倒伏，炎性細胞浸潤增多。Ⅱ型肺泡細胞腫脹和退化。肺泡細胞線粒體腫脹，肺泡壁斷裂。支氣管肺泡灌洗液中白細胞計數(shù)及中性粒細胞、肺泡巨噬細胞比例均顯著升高（P＜0.05），肺泡巨噬細胞中NO含量及誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）活性顯著升高（P＜0.05）。模型組的前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）和轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）活性比正常組明顯增強，環(huán)氧化酶2（cyclooxygenase 2，COX2）mRNA 表達明顯增加，COX-2 蛋白表達明顯高于正常組。

3.4 注入LPS 聯(lián)合被動吸煙及SO2吸入法

杜秀婷等［31］將小鼠于實驗d 1、d 14 分別經(jīng)氣管和經(jīng)鼻腔注入LPS，同時，于d 2～30（d 14 除外）進行被動吸煙及SO2吸入；SO2組小鼠每天熏SO22 min；煙熏組小鼠每天吸煙4 支每次，直至1 包煙燃燒完畢，共約1 h；脂多糖組小鼠在造模d 1 氣管注入LPS，d 14、d 30 進行LPS 滴鼻。各模型組均連續(xù)造模30 d。結(jié)果與煙熏組、二氧化硫組比較，慢支改良組肺泡灌洗液白細胞總數(shù)顯著增高（P＜0.01）；慢支改良組與其它3 組比較肺組織炎癥細胞浸潤程度顯著升高（P＜0.01）。

4 復(fù)合因素造模法

蔣明等［32］綜合上述方法，通過給予Wistar 大鼠煙熏（每次5 支，30 min 每次，連續(xù)6 周）、脂多糖（d 1、d 14 氣道內(nèi)注入LPS 200 μg）和18%低氧（從第5 周開始，艙內(nèi)煙熏同時疊加每天吸入18%低氧8 h，每周6 d）復(fù)制慢支、肺氣腫并肺動脈高壓動物模型，氣道、肺組織改變符合人類慢支、肺氣腫病理改變特點。該組動物肺血流動力學異常改變，mPAP、RVSP 和RV/LV+S 增高，肺血管分析提示肺動脈重構(gòu)，肌化型動脈比率增高、管壁增厚，模型體現(xiàn)了動脈高壓和相關(guān)肺血管重構(gòu)；氣道纖毛倒伏粘連，上皮細胞鱗狀化生、黏液杯狀細胞顯著增生，黏膜水腫；管腔內(nèi)中性粒細胞增多，氣道壁以淋巴細胞為主的炎癥細胞浸潤明顯，局部還可見明顯的淋巴濾泡形成；管壁平滑肌束增生，部分區(qū)域因炎癥細胞浸潤出現(xiàn)平滑肌束斷裂；肺氣腫明顯并可見肺大皰形成。

總之，由于動物和人類的氣道存在解剖學差異，上述常見的造模方法并不能完全模擬人類慢性支氣管炎的全部病理改變，比如嚙齒動物和兔子在肺內(nèi)氣道中缺乏粘膜下腺體，使用這些物種的模型不能期望顯示出支氣管腺肥大。小鼠的支氣管炎模型并沒有表現(xiàn)出慢性支氣管炎時慢性充血的單核細胞特征，以及T 細胞氣道壁浸潤和間充質(zhì)重塑。這些方面的特征靈長類動物、狗和雪貂或許更適合。另外，目前支氣管炎的動物模型中沒有一種含有病毒或細菌制劑來加重支氣管炎。由于感染因素在人類慢性支氣管炎加重中很重要，這也需要開發(fā)新的慢性支氣管炎氣道感染動物模型［3］。