趙東曉 李公存 董亞茹 耿兵 陳傳杰 王照紅 婁齊年 孫景詩(shī)

摘要：為篩選適合食藥用雜交桑品種，測(cè)定了5個(gè)雜交桑品種的桑葉1-脫氧野尻霉素（1-deoxynojirimycin， DNJ）、總黃酮、多糖、總多酚和γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid， GABA）含量，并用隸屬函數(shù)法對(duì)桑葉的藥用品質(zhì)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，不同品種雜交桑桑葉DNJ、總黃酮、多糖、總多酚和GABA含量存在較大差異，5個(gè)雜交桑品種藥用品質(zhì)從高到低依次為豐馳、秦桑、浙桑3號(hào)、浙桑1號(hào)、魯桑1號(hào)。

關(guān)鍵詞：雜交桑;桑葉;活性物質(zhì);藥用品質(zhì);綜合評(píng)價(jià)

中圖分類(lèi)號(hào)：S548.01?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A?文章編號(hào)：1001-4942（2019）12-0100-06

Abstract?In order to select mulberry hybrids suitable for food and medicine， the contents of 1-deoxynojirimycin （DNJ）， total flavonoids， polysaccharides， total polyphenols and γ-aminobutyric acid （GABA） in leaves of five mulberry hybrids were determined， and the medicinal quality were comprehensively evaluated by membership function method. The results showed that there were significant differences in DNJ， total flavonoids， polysaccharides， total polyphenols and GABA contents between different hybrids. According to the comprehensive analysis by membership function method， the medicinal quality of the five mulberry hybrids from high to low was Fengchi， Qinsang， Zhesang 3， Zhesang 1 and Lusang 1， respectively.

Keywords?Mulberry hybrid;Mulberry leaves;Active substances;Medicinal quality;Comprehensive evaluation

桑樹(shù)是?？疲∕oraceae）桑屬（Morus L.）多年生木本植物。桑葉既是家蠶唯一天然食物，又是一種傳統(tǒng)中藥材。桑葉含有豐富的營(yíng)養(yǎng)生物活性物質(zhì)，如黃酮類(lèi)、多糖類(lèi)、生物堿類(lèi)、植物甾醇、多種維生素及礦物質(zhì)等[1]，具有抗氧化、降血糖、抗腫瘤、提高人體免疫力等功能[2-4]。此外，桑葉蛋白質(zhì)含量高，可用作飼料加工，具有消化率高、適口性好等特點(diǎn)[5]。桑葉有抗炎、抑菌的優(yōu)點(diǎn)，可作為新型飼料添加劑，為無(wú)抗飼料的加工提供新思路[6]。

目前業(yè)內(nèi)認(rèn)為雜交桑葉片薄、葉質(zhì)差，但雜交桑具有生長(zhǎng)快、產(chǎn)葉量大，適宜機(jī)械化收割、牲畜適口性好等優(yōu)點(diǎn)[7]，是飼料的理想材料。雜交桑作為飼料桑的開(kāi)發(fā)利用成為近年來(lái)蠶桑產(chǎn)業(yè)多元化發(fā)展的重要方向之一。篩選高藥用品質(zhì)的雜交桑品種對(duì)雜交桑無(wú)抗飼料開(kāi)發(fā)利用有重要意義。本研究對(duì)收集的5個(gè)雜交桑葉片中1-脫氧野尻霉素（1-deoxynojirimycin， DNJ）、總黃酮、多糖、總多酚和γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid， GABA）含量進(jìn)行檢測(cè)和綜合分析，旨在為雜交桑葉利用和高品質(zhì)飼料桑開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)和參考。

1?材料與方法

1.1?試驗(yàn)材料和主要試劑

供試材料為一年生雜交桑第5～8葉位的成熟葉片，品系分別為豐馳、秦桑、魯桑1號(hào)、浙桑1號(hào)、浙桑3號(hào)。桑葉于2019年7月中旬采摘于山東省蠶業(yè)研究所南院試驗(yàn)場(chǎng)桑園。采摘時(shí)間為上午9∶00，采摘后的桑葉用自來(lái)水清洗干凈后，用蒸餾水沖洗3遍，置于50℃烘干至恒重，粉碎后過(guò)60目篩，分裝于密封袋中，-40℃保存?zhèn)溆谩?/p>

DNJ 標(biāo)準(zhǔn)品、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品、γ-氨基丁酸（GABA）標(biāo)準(zhǔn)品、9-芴基氯甲酸甲酯（FMOC-Cl） 、乙腈（色譜純），均為 Sigma 公司產(chǎn)品。甘氨酸、濃鹽酸、氫氧化鈉、乙醇、3，5-二硝基水楊酸、酒石酸鉀鈉、苯酚、亞硫酸氫鈉、乙酸鋅、冰乙酸、亞鐵氰化鉀、碘、碘化鉀、濃硫酸、亞硝酸鈉、硝酸鋁、福林酚試劑、碳酸鈉、氯化鋁、氫氧化鉀、十水合四硼酸鈉、安替福民均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2?試驗(yàn)方法

1.2.1?桑葉DNJ的提取及含量檢測(cè)?按照文獻(xiàn)[8]的方法。

DNJ標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制作：精確稱(chēng)取DNJ標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，用去離子水配置的0.05 mol/L HCl溶液溶解并定容至10 mL，得到濃度為1 mg/mL的DNJ標(biāo)準(zhǔn)品溶液，-40℃保存?zhèn)溆?。精確吸取DNJ標(biāo)準(zhǔn)品溶液0、2、4、6、8、10、12、20 μL于5 mL離心管中，分別加入一定量的0.05 mol/L HCl溶液稀釋至100 μL。加入pH=8.5、0.4 mol/L硼酸鹽緩沖液100 μL，再加入濃度為5 mmol/L的FMOC-Cl/乙腈溶液200 μL，充分混勻，20℃反應(yīng)20 min，再加入1 mol/L甘氨酸溶液100 μL終止反應(yīng);加入0.1%的冰醋酸溶液100 μL穩(wěn)定生成的衍生物，混勻后加入去離子水500 μL。經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾，濾液采用高效液相色譜（HPLC）法檢測(cè)分析。檢測(cè)條件為：反向色譜柱C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）;流動(dòng)相為乙腈-0.1%冰醋酸（體積比45∶55），流速1 mL/min，柱溫28℃，熒光檢測(cè)器波長(zhǎng)254 nm，進(jìn)樣量20 μL，停止時(shí)間30 min。以DNJ標(biāo)準(zhǔn)品溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

準(zhǔn)確稱(chēng)取桑葉粉0.2 g，加入0.05 mol/L HCl溶液定容至10 mL，渦旋30 s后超聲提取30 min，12 000 r/min 離心15 min，上清液即為DNJ 提取液。取DNJ提取液100 μL，按照DNJ標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制作方法進(jìn)行衍生化處理和色譜檢測(cè)，參照標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算桑葉DNJ含量。

1.2.2?桑葉總黃酮的提取及含量檢測(cè)?按照文獻(xiàn)[9]的方法。

總黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制作：準(zhǔn)確稱(chēng)取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10 mg于50 mL容量瓶中，用70%乙醇定容，得到濃度為0.2 mg/mL蘆丁對(duì)照品溶液，-40℃保存?zhèn)溆?。精確吸取蘆丁對(duì)照品溶液0、0.05、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL于5 mL離心管中，再分別加入一定量的70%乙醇溶液稀釋至1.00 mL。加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的 NaNO2 60 μL，搖勻后靜置6 min，加入10%Al（NO3）3 60 μL，混勻后靜置6 min，再加入4%的NaOH溶液800 μL，用70%乙醇稀釋至2 mL，搖勻后靜置10 min。測(cè)定各管510 nm吸光值，以同樣處理的0 mL蘆丁對(duì)照品溶液進(jìn)行空白校正，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

準(zhǔn)確稱(chēng)取桑葉粉0.5 g，加入70%乙醇定容至50 mL，超聲提取20 min后，60℃水浴3 h，過(guò)濾并收集濾液。4℃靜置過(guò)夜，上層液即為待檢測(cè)液。取200 μL待測(cè)液，加入70%乙醇800 μL稀釋后，按照制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方法測(cè)定各樣品510 nm吸光值，參照標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算桑葉總黃酮的含量。

1.2.3?桑葉多糖的提取及含量檢測(cè)?按照文獻(xiàn)[10]的方法。

多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制作：精確配制1.056 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別吸取0、0.08、0.16、0.24、0.32、0.40、0.48、0.56、0.64 mL葡萄糖對(duì)照品溶液，加至10 mL具塞比色管中，以0 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液作為空白對(duì)照，加蒸餾水稀釋至0.80 mL。分別加入60 μL DNS試劑，搖勻，沸水浴5 min后立即置于冰水中冷卻，用蒸餾水定容至10 mL，測(cè)定各管540 nm吸光值。以葡萄糖質(zhì)量（mg）為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

提取5個(gè)雜交桑品種桑葉水溶性糖和總糖，按照制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的方法測(cè)定540 nm吸光值，分別計(jì)算各品種桑葉水溶性糖和總糖含量。多糖含量=（總糖含量-水溶性糖含量）×0.9×100%。

1.2.4?桑葉總多酚的提取及含量檢測(cè)?按照文獻(xiàn)[11]的方法。

總多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制作：準(zhǔn)確稱(chēng)取沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品20 mg于200 mL容量瓶中，用蒸餾水定容，得到濃度為0.1 mg/mL沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液，-40℃保存?zhèn)溆谩＞_吸取沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液0、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.16 mL于5 mL離心管中，再分別加入一定量的蒸餾水稀釋至1.00 mL。各管中加入1 mL 福林酚試劑，混勻后靜置10 min，然后加入10% Na2CO3 溶液2 mL，混勻后25℃遮光反應(yīng)1 h 顯色。測(cè)定各管765 nm吸光值，以同樣處理的0 mL沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液進(jìn)行空白校正，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

準(zhǔn)確稱(chēng)取桑葉粉0.5 g，加入pH=4.0 的70%乙醇并定容至50 mL，超聲提取30 min后，60℃水浴90 min，冷卻后12 000 r/min離心10 min，上清即為桑葉總多酚提取液。取25 μL提取液，加入pH =4.0 的70%乙醇950 μL稀釋?zhuān)凑湛偠喾訕?biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)測(cè)定方法檢測(cè)各樣品765 nm吸光值，參照標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算桑葉總多酚的含量。

1.2.5?桑葉GABA提取及含量檢測(cè)?按照文獻(xiàn)[12]的方法。

GABA標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制作：準(zhǔn)確稱(chēng)取GABA標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，用蒸餾水溶解并定容至10 mL，配制成1 mg/mL GABA對(duì)照品母液，-40℃保存?zhèn)溆?。精確吸取GABA對(duì)照品溶液0、0.125、0.250、0.375、0.500、0.625、0.750、0.875、1.000 mL，加蒸餾水稀釋至1.000 mL，加入2 mol/L AlCl3溶液50 μL，充分搖勻后振蕩10 min，12 000 r/min離心 5 min，取500 μL上清液，加入濃度為1 mol/L 的KOH溶液300 μL，振蕩5 min后12 000r/min離心5 min。取300 μL上清液，依次加入pH=10.0的0.1 mol/L四硼酸鈉緩沖液500 μL、6%苯酚400 μL、50 g/L NaClO 溶液600 μL，每一步均充分混勻。沸水浴中加熱10 min后置于冰水浴5 min，待溶液出現(xiàn)藍(lán)綠色后，加入60%乙醇2.0 mL，測(cè)定645 nm吸光值。以GABA質(zhì)量（mg）為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

準(zhǔn)確稱(chēng)取0.05 g桑葉粉于離心管中，加入100%甲醇2 mL，振蕩 15 min后5 000 r/min離心15 min，棄上清液。重復(fù)2次上述操作。將離心后收集的沉淀物烘干后加蒸餾水2 mL，超聲波提取20 min后，50℃水浴中提取2 h，5 000 r/min離心15 min，上清即為桑葉GABA提取液。吸取1 mL提取液，按照GABA標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制作方法，測(cè)定各樣品645 nm吸光值。參照標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算桑葉GABA的含量。

1.2.6?桑葉藥用品質(zhì)綜合評(píng)價(jià)?參照文獻(xiàn)[13]中的方法，借助隸屬函數(shù)，分別將桑葉DNJ、總黃酮、多糖、總多酚和GABA含量測(cè)定值標(biāo)準(zhǔn)化，計(jì)算各指標(biāo)的隸屬函數(shù)值，公式為：X（i）= （Xi-Ximax）/（Ximin-Ximax）。式中，X（i）表示桑葉藥用品質(zhì)綜合評(píng)價(jià)中第i類(lèi)成分的隸屬函數(shù)值，Xi表示桑葉第i類(lèi)藥用成分含量實(shí)際測(cè)定值，Ximin和 Ximax分別表示桑葉第i類(lèi)藥用成分含量中的最小測(cè)定值和最大測(cè)定值。對(duì)桑葉DNJ、總黃酮、總多酚、多糖和GABA隸屬函數(shù)值累加求和，將其作為雜交桑葉藥用品質(zhì)綜合評(píng)價(jià)得分。

1.3?數(shù)據(jù)處理與分析

用Microsoft Excel 2007和SPSS 20軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理與統(tǒng)計(jì)分析。

2?結(jié)果與分析

2.1?不同桑品種桑葉中的DNJ含量比較

如圖1所示，5個(gè)雜交桑品種桑葉中的DNJ含量在0.23～0.50 mg/g之間。其中，豐馳含量最高（0.50 mg/g），極顯著高于其它品種。其次為魯桑1號(hào)（0.34 mg/g）、浙桑3號(hào)（0.33 mg/g）、浙桑1號(hào)（0.29 mg/g）。秦桑含量最低（0.23 mg/g），是豐馳的46.00%。

2.2?不同桑品種桑葉中的總黃酮含量比較

如圖2所示，5個(gè)雜交桑品種桑葉中的總黃酮含量差異較大。其中豐馳含量最高，為4.74 mg/g，極顯著高于其它品種。其次為秦桑，含量為3.73 mg/g，比豐馳低21.32%。再次為魯桑1號(hào)，含量為3.21 mg/g，比豐馳低32.33%。浙桑1號(hào)含量為3.17 mg/g，比豐馳低33.24%。浙桑3號(hào)含量最低，僅為3.05 mg/g，比豐馳低35.76%。

2.3?不同桑品種桑葉中的多糖含量比較

如圖3所示，5個(gè)雜交桑品種桑葉中的多糖含量由高到低依次為豐馳、秦桑、浙桑1號(hào)、浙桑3號(hào)和魯桑1號(hào)，多糖含量依次為16.10、15.93、15.86、15.55 mg/g和14.31 mg/g。其中魯桑1號(hào)多糖含量極顯著低于豐馳、秦桑、浙桑1號(hào)和浙桑3號(hào)。

2.4?不同桑品種桑葉中的總多酚含量比較

如圖4所示，5個(gè)雜交桑品種桑葉中的總多酚含量在15.18～22.67 mg/g。由高到低依次為豐馳、秦桑、魯桑1號(hào)、浙桑1號(hào)和浙桑3號(hào)，其中豐馳總多酚含量為22.67 mg/g，極顯著高于其它品種。

2.5?不同桑品種桑葉中的GABA含量比較

如圖5所示，5個(gè)雜交桑品種桑葉中的GABA含量在3.67～4.16 mg/g。浙桑3號(hào)、秦桑、浙桑1號(hào)、魯桑1號(hào)和豐馳GABA含量依次為4.16、4.14、3.93、3.85 mg/g和3.67 mg/g。各品種間桑葉GABA含量差異不顯著。

2.6?桑葉藥用品質(zhì)綜合評(píng)價(jià)得分比較

將桑葉DNJ、總黃酮、多糖、總多酚和GABA 5種生物活性物質(zhì)作為雜交桑藥用品質(zhì)的評(píng)價(jià)指標(biāo)，用模糊數(shù)學(xué)的隸屬函數(shù)平均值大小表示其相對(duì)優(yōu)劣，計(jì)算隸屬函數(shù)平均值，并對(duì)其藥用品質(zhì)優(yōu)劣進(jìn)行綜合排序，隸屬平均值越大，表明該品種藥用品質(zhì)越高。由表1可見(jiàn)，5個(gè)雜交桑品種藥用品質(zhì)從高到低依次為豐馳、秦桑、浙桑3號(hào)、浙桑1號(hào)、魯桑1號(hào)。

3?討論與結(jié)論

DNJ是首次從桑樹(shù)中分離得到的一種生物堿，能有效抑制α-葡萄糖苷酶活性，從而有降血糖的作用，能有效預(yù)防和治療Ⅱ型糖尿病[14]。越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，DNJ存在于多種微生物[15，16]和植物[17，18]中，而桑樹(shù)是目前發(fā)現(xiàn)的DNJ含量最高的植物[1]。本研究檢測(cè)的5個(gè)雜交桑品種葉片DNJ含量存在極顯著差異，含量在0.23～0.50 mg/g之間，與張俊[1]、曾衛(wèi)湘[10]等的研究結(jié)果相比偏低。

黃酮是一類(lèi)植物次生代謝產(chǎn)物，目前研究認(rèn)為生物和非生物脅迫可刺激植物產(chǎn)生黃酮類(lèi)物質(zhì)[19]。桑葉黃酮具有清除自由基、抗菌、抗癌、抗病毒、降血糖、降血脂等功效[20]。本研究檢測(cè)的5個(gè)雜交品種桑葉總黃酮含量在3.05～4.74 mg/g之間，存在極顯著差異，與敬成俊等[12]的研究結(jié)果相符。

多糖是桑葉中的主要活性物質(zhì)之一，具有顯著的降血糖血脂、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫力等功能[10]。目前研究認(rèn)為桑葉多糖含量與品種、產(chǎn)地、氣候、處理方式有顯著的相關(guān)性[21]。本研究檢測(cè)的5個(gè)雜交桑品種葉片多糖含量在14.31～16.10 mg/g之間，存在極顯著差異，與曾衛(wèi)湘等[10]的研究結(jié)果相比偏低，與敬成俊等[12]的研究結(jié)果相符。

多酚是一種植物酚類(lèi)次生代謝產(chǎn)物，廣泛存在于植物的葉片、根、皮、果實(shí)等部位。桑葉總多酚具有抗輻射、抗衰老、抗氧化、防治腫瘤、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、治療脂肪肝等功能[22]。本研究檢測(cè)的5個(gè)雜交品種桑葉總多酚含量在15.18～22.67 mg/g之間，存在極顯著差異，與敬成俊等[12]的研究結(jié)果相比偏高，與沈維治等[22]的研究結(jié)果相符。

GABA是廣泛存在于植物體中的一種非蛋白質(zhì)氨基酸類(lèi)天然活性成分，對(duì)人體的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育具有重要調(diào)節(jié)作用，有抗焦慮、降血壓等作用[23]，對(duì)植物有增強(qiáng)逆境脅迫的功能[24]。桑樹(shù)是一種GABA含量較高的植物。本研究檢測(cè)的5個(gè)雜交桑品種葉片GABA含量在3.67～4.16 mg/g之間，差異不顯著，與冀憲領(lǐng)等[23]研究結(jié)果相比偏高、與王瑞嫻等[25]的研究結(jié)果相符。

本研究中雜交桑葉生物活性成分含量與以往研究有所不同，一方面可能與供試雜交桑品種本身遺傳背景和生理特性有關(guān);另一方面，不同氣候因素和栽培條件，如光照、溫度、濕度、降雨量和土壤類(lèi)型等對(duì)植物次生代謝產(chǎn)物含量也會(huì)產(chǎn)生一定的影響[19，26]。

本研究供試的5個(gè)雜交桑品種中，豐馳是桑葉DNJ、總黃酮、多糖、總多酚含量最高的優(yōu)勢(shì)品種，浙桑3號(hào)是GABA含量最高的優(yōu)勢(shì)品種。通過(guò)隸屬函數(shù)法將5個(gè)品種桑葉DNJ、總黃酮、多糖、總多酚和GABA含量標(biāo)準(zhǔn)化，以5種藥用成分隸屬函數(shù)平均值對(duì)各品種桑葉藥用品質(zhì)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，結(jié)果表明5個(gè)雜交桑品種藥用品質(zhì)最高的為豐馳，可作為食藥專(zhuān)用雜交桑品種的候選。本研究為藥食專(zhuān)用雜交桑品種的選育提供了科學(xué)依據(jù)。

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