張燁 賀立龍 魏清崗 王紅霞 李景娟 王鳳德 徐少君 荊世新 孫令強(qiáng) 李洪雷 鄧永林 高建偉

摘要：加快純系選育速度、縮短育種進(jìn)程，是大白菜新品種選育的重要目標(biāo)。本試驗(yàn)利用大白菜桔紅色、無(wú)表皮毛、亮綠稈三個(gè)隱性性狀及其分子標(biāo)記輔助大白菜優(yōu)良純系選擇，開(kāi)展加快大白菜育種效率的研究。結(jié)果表明：該分子標(biāo)記屬于基因本身外顯子區(qū)段的InDel或SNP標(biāo)記，選擇效率高（100%），可使大白菜優(yōu)良純系培育時(shí)間縮短3年，與常規(guī)育種相結(jié)合形成的育種技術(shù)體系，可實(shí)現(xiàn)桔紅心、無(wú)表皮毛、亮綠稈優(yōu)質(zhì)大白菜新品種選育的精準(zhǔn)分子設(shè)計(jì)。本研究結(jié)果直接來(lái)源于大白菜育種實(shí)踐，具有重要的理論和實(shí)踐價(jià)值。

關(guān)鍵詞：大白菜;隱性性狀;分子標(biāo)記;分離純化;育種效率

中圖分類號(hào)：S634.103.7?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A?文章編號(hào)：1001-4942（2019）12-0007-08

Abstract?Improving the speed of breeding pure lines and shortening the breeding process were the goals of breeding new Chinese cabbage varieties. Here， we used three recessive traits， including orange color， non-trichome and bright green stem， and their molecular markers to assist the selection of fine pure lines in Chinese cabbage in order to accelerate the breeding efficiency. The results showed that the molecular markers with higher selection efficiency as 100% belonged to InDel or SNP markers of the gene exon segment， which could shorten breeding time of excellent pure lines in Chinese cabbage by three years. They could realize precise molecular designation about orange color， non-trichome and bright green stem in Chinese cabbage compared with conventional breeding. The results were directly derived from the breeding practice of Chinese cabbage， so they had important theoretical significance and practice value.

Keywords?Chinese cabbage（Brassica rapa L.ssp. pekinensis）;Recessive traits; Molecular marker; Separation and purification; Breeding efficiency

大白菜（Brassica rapa L. ssp. pekinensis）起源于中國(guó)，是我國(guó)分布最廣、種植面積最大的蔬菜作物，素有“國(guó)菜”之稱，其豐欠對(duì)能否滿足人們生活需求有一定影響[1，2]。長(zhǎng)期以來(lái)，研究者對(duì)大白菜新品種選育及良種良法配套技術(shù)研究較多。因其是典型的異花授粉作物，育種方式以雜種優(yōu)勢(shì)育種為主，生產(chǎn)用種主要是一代雜交種。F1代雜交種制種方式有兩種：一是利用自交不親和性生產(chǎn)，二是利用雄性不育系生產(chǎn)，目前市場(chǎng)以第一種制種方式為主。大白菜具有自交不親和性，即使高自交結(jié)實(shí)的親本純系，也具有系內(nèi)自交遲配的特性，這是目前利用優(yōu)良的純合親本生產(chǎn)F1代雜種的理論基礎(chǔ)，也是利用自交不親和性生產(chǎn)F1代雜種占據(jù)多數(shù)市場(chǎng)的主要原因[1]。上述雜種優(yōu)勢(shì)育種的關(guān)鍵是快速選育優(yōu)良親本純系，篩選出優(yōu)良組合。而加快純系選育速度、縮短育種進(jìn)程，是大白菜新品種選育的重要目標(biāo)。

為提高選擇效率、加快育種進(jìn)程，人們使用的方法主要有細(xì)胞工程技術(shù)和分子育種技術(shù)。單倍體培養(yǎng)（包括小孢子培養(yǎng)、未受粉子房或胚珠培養(yǎng)等）屬于細(xì)胞工程技術(shù)，主要用于快速獲得純系植株。1989年，Sato等[3]首次報(bào)道用早熟大白菜品種的小孢子成功誘導(dǎo)再生植株。我國(guó)大白菜小孢子培養(yǎng)研究雖然起步晚于日本，但育種實(shí)踐應(yīng)用最早，已成功育成豫新5號(hào)、豫白菜7號(hào)、豫白菜12號(hào)、京秋1號(hào)等品種[1，4-6]。因受供試材料基因型等多種不確定因素的影響，該方法的利用受到限制。隨著大白菜基因組測(cè)序的完成、重要性狀基因及其分子標(biāo)記的挖掘、遺傳轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化和CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的不斷完善，分子育種技術(shù)正成為大白菜育種的重要方法。因此，重要性狀功能基因及其分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)，也逐步成為提高大白菜育種效率的重要工具[1]。

桔紅色、無(wú)表皮毛及亮綠稈（葉）是大白菜的3個(gè)重要農(nóng)藝性狀，均屬單基因控制的隱性質(zhì)量性狀。控制大白菜桔紅心性狀形成的關(guān)鍵基因是BrCRISO（[STBX]Bra031539[STBZ]），位于A09染色體[7]，與該性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記有SNP（C952-T952）和InDel標(biāo)記（Bror-intron1），SNP（C952-T952）標(biāo)記可造成BrCRISO氨基酸的突變（L318-F318），InDel標(biāo)記（Bror-intron1）則在桔紅心BrCRISO基因的第1個(gè)內(nèi)含子上，與白心相比存在25個(gè)堿基的插入[8]，因此，可以用來(lái)鑒定桔紅心與白心大白菜。控制大白菜無(wú)表皮毛性狀的遺傳位點(diǎn)位于A06染色體，該性狀形成的主要原因是[STBX]BraGL1[STBZ]基因的第3個(gè)外顯子區(qū)域存在5個(gè)堿基的插入，造成蛋白翻譯的提前終止，據(jù)此本課題組開(kāi)發(fā)了無(wú)表皮毛分子標(biāo)記GL1-CDS-MK[9]。2012—2013年間，我們?cè)噲D驗(yàn)證[STBX]Bra013809[STBZ]基因突變是導(dǎo)致大白菜亮綠稈產(chǎn)生的原因，但是Zhang等[10]已研究出控制大白菜亮綠稈（葉）形成的關(guān)鍵基因是[STBX]BrWax1[STBZ]（[STBX]Bra013809[STBZ]），位于A01染色體上，與該性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記是BRNW標(biāo)記，它在[STBX]BrWax1[STBZ]基因的第一個(gè)外顯子中有130 bp的插入[11]。常規(guī)育種中，利用隱性性狀可以快速純化分離個(gè)體，提高選育效率，而分子標(biāo)記輔助選擇可以快速聚合多個(gè)優(yōu)良性狀。本研究擬利用大白菜桔紅色、亮綠稈和無(wú)表皮毛三個(gè)隱性性狀及其分子標(biāo)記輔助大白菜優(yōu)良純系選擇，以期大幅度提高大白菜育種效率，并為育種實(shí)踐提供參考。

1?材料與方法

1.1?材料

大白菜種質(zhì)資源材料100份（表1）。利用分子標(biāo)記進(jìn)行鑒定，結(jié)合綜合農(nóng)藝性狀，選配組合;5個(gè)雜交組合分別為：玉青×津綠75、黃娃1×金貝貝、石特×Am198、疊錐抗×Am199、黃娃1×黃娃2的F1，以及F1自交分離后代至F10。

1.2?總DNA提取

大白菜葉片經(jīng)液氮冷凍后快速研磨，采用CTAB法進(jìn)行DNA提取[10]，利用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行DNA質(zhì)量檢測(cè)。

1.3?PCR擴(kuò)增

PCR反應(yīng)體系（20 μL）：cDNA模板2 μL，5×FastPfu DNA Polymerase buffer 4 μL，2.5 mmol/L dNTP 2 μL，10 μmol/L 5′引物、3′引物各1 μL，F(xiàn)astPfu DNA Polymerase 0.5 μL，ddH2O 9.5 μL。擴(kuò)增所用引物見(jiàn)表2。PCR反應(yīng)程序根據(jù)引物的退火溫度和目的片段的長(zhǎng)度設(shè)定。PCR反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。

1.4?SDS-PAGE電泳檢測(cè)

將PCR產(chǎn)物與上樣緩沖液混勻，95℃預(yù)變性10 min，取4 μL點(diǎn)樣，利用8%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，在Sequi-GenGT核酸電泳系統(tǒng)（Bio-Rad，USA）中進(jìn)行電泳分離，25℃、55 W恒功率下電泳1 h，電極緩沖液為1×TBE，銀染法顯影，拍照并記錄結(jié)果。

1.5?生物信息學(xué)分析

將克隆的基因序列在GenBank中進(jìn)行BLAST檢索，查找大白菜目標(biāo)基因在其它物種中的同源序列。利用DNAMAN 6.0軟件對(duì)來(lái)自不同物種的基因編碼氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

2?結(jié)果與分析

2.1?大白菜BRNW分子標(biāo)記

擬南芥（Arabidopsis thaliana）ECERFERUMP （[STBX]cer2[STBZ]） 基因突變可產(chǎn)生亮綠色的莖稈與果莢，若生物之間親緣關(guān)系相近，它們的基因組就會(huì)表現(xiàn)出共線性，即基因序列部分或全部保守。因此，我們利用擬南芥[STBX]AT4G24510[STBZ]基因序列及其編碼的氨基酸序列在BRAD（http：//brassicadb.org/brad/）中搜尋，獲得了對(duì)應(yīng)的大白菜[STBX]Bra013809[STBZ]基因及其序列。分別對(duì)亮綠稈、灰稈大白菜純系進(jìn)行[STBX]Bra013809[STBZ]基因擴(kuò)增，結(jié)果如圖1所示，亮綠稈純系在靠近5′端的外顯子中有一個(gè)130 bp的插入片段（圖2）。

2.2?大白菜無(wú)表皮毛GL1-CDS-MK分子標(biāo)記

王紅霞等[9]利用母本冠291（P1）與父本早黃白（P2）的雜交F2代群體進(jìn)行無(wú)表皮毛GL1-CDS-MK分子標(biāo)記，擴(kuò)增帶型及序列如圖3、圖4所示。

2.3?大白菜桔紅心InDel標(biāo)記

大白菜桔紅心InDel標(biāo)記Bror-intron1如圖5所示，與白心相比存在25個(gè)堿基的插入（圖6）。

2.4?大白菜亮綠稈、桔紅心及無(wú)表皮毛分子標(biāo)記在優(yōu)良種質(zhì)資源篩選中的應(yīng)用

利用三個(gè)分子標(biāo)記對(duì)100份種質(zhì)資源進(jìn)行鑒定（圖7），并結(jié)合綜合農(nóng)藝性狀，共篩選獲得28個(gè)優(yōu)良種質(zhì)資源（表3）。

2.5?大白菜亮綠稈、桔紅心及無(wú)表皮毛分子標(biāo)記在優(yōu)良親本創(chuàng)制中的應(yīng)用

利用亮綠色BRNW標(biāo)記、桔紅心InDel標(biāo)記以及無(wú)表皮毛GL1-CDS-MK標(biāo)記，結(jié)合自交分離純化，我們僅用2年時(shí)間就選育出大白菜純系貝迷你1（自交不親和系）、娃短1（自交不親和系）、高娃黃（自交不親和系）、綠12-430（自交不親和系）、綠12-1466（自交不親和系）。貝迷你1：葉球內(nèi)葉黃色，直筒形，亮綠稈（葉）。娃短1：耐抽薹性好，黃心，外觀形狀好，抗多種病害。高娃黃：葉球比貝迷你1和娃短1大，屬中型，直筒形，黃心，剖面對(duì)稱。綠12-430：筒形合抱，葉深綠、無(wú)毛，黃心，抗霜霉病、黑斑病、病毒病。綠12-1466：田間表現(xiàn)高抗病毒病，葉深綠、無(wú)毛，葉球合抱、柱形，配合力好。

2.6?優(yōu)良組合及新品種培育

2.6.1?高春黃1號(hào)?母本為貝迷你1，父本為娃短1。2013年進(jìn)行第一次測(cè)配，2014年確定品系高春黃1號(hào)（圖8）。生長(zhǎng)期55～60 d。近中棵，株高35 cm，開(kāi)展度40 cm，球高25 cm，球粗16 cm，球形指數(shù)1.8。粗纖維少，口感好，質(zhì)地脆嫩，熟食易爛。外葉綠色，葉柄白色，心葉黃色，葉面微皺、有毛。球葉扣抱，球頂尖，葉球小炮彈形。單球重1.0 kg，凈菜率72%以上。耐抽薹性強(qiáng)。2015、2016年品種比較試驗(yàn)分別比對(duì)照京春娃3號(hào)增產(chǎn)7.35%、7.13%。對(duì)三種病害（霜霉病、病毒病和軟腐病）的抗性均為抗，霜霉病、病毒病、黑腐病的病情指數(shù)分別為21.16、27.57、24.35。

該品種春、秋均可種植，由于生長(zhǎng)期短，可根據(jù)上市時(shí)間分期播種。因耐抽薹性強(qiáng)，又可早春種植，但需要保護(hù)設(shè)施。平畦種植和起壟種植均可。起壟種植：株行距35 cm×（50～60）cm，定植密度每666.7m2 ?3 500株左右。畦栽：株行距35 cm×40 cm。冬季、早春和秋季晚播種植因溫度低，生長(zhǎng)期延長(zhǎng)，葉球小，種植密度適當(dāng)加大。施肥應(yīng)注意重施基肥和早追肥，加大有機(jī)基肥用量，注意氮磷鉀肥配合使用，及時(shí)澆水，及時(shí)防治菜青蟲(chóng)、小菜蛾等各種害蟲(chóng)。收獲前一周停止?jié)菜?，成熟后及時(shí)收獲。

2.6.2?高春黃2號(hào)?母本為高娃黃，父本為貝迷你1。2014年進(jìn)行第一次測(cè)配，2015年確定品系高春黃2號(hào)（圖9）。生長(zhǎng)期55 d。近中棵，株高37 cm，開(kāi)展度50 cm，球高27 cm，球粗16 cm，球形指數(shù)1.8。粗纖維少，口感好，質(zhì)地脆嫩，熟食易爛。外葉綠色，葉柄白色，葉球心葉黃色，葉面微皺、有毛。球葉扣抱，球頂尖。單球重1.5 kg，凈菜率70%以上。耐抽薹性強(qiáng)。抗病毒病、霜霉病、軟腐病。2016、2017年品種比較試驗(yàn)比對(duì)照京春娃3號(hào)增產(chǎn)8.15%、9.12%。

該品種春、秋均可種植，由于生長(zhǎng)期短，可根據(jù)上市時(shí)間分期播種。因耐抽薹性強(qiáng)，又可早春種植，但需要保護(hù)設(shè)施。平畦種植和起壟種植均可，種植方式與高春黃1號(hào)相似。施肥應(yīng)重施基肥和早追肥，加大有機(jī)基肥的用量，注意氮磷鉀肥配合使用，及時(shí)澆水，及時(shí)防治菜青蟲(chóng)、小菜蛾等各種害蟲(chóng)。收獲前一周停止?jié)菜?，成熟后及時(shí)收獲。

2.6.3?高綠1號(hào)?母本為綠12-430，父本為綠12-1466。2012年進(jìn)行第一次測(cè)配，2013年確定品系高綠1號(hào)（圖10）。該品種適合包裝運(yùn)輸，抗病，中晚熟，生長(zhǎng)期72 d左右，株高55 cm，高樁直筒青麻葉類型，凈菜率為78%，單球重3.0 kg。株型直立緊湊，外葉少，葉色深綠、無(wú)毛，中肋淺綠色球頂呈花心，葉紋適中，品質(zhì)優(yōu)良。室內(nèi)苗期人工接種高抗病毒病、霜霉病和軟腐病。2014、2015年品比試驗(yàn)比對(duì)照津綠75增產(chǎn)5.1%、5.7%。

該品種屬中熟偏早熟類型，在山東8月中旬可播種。高壟栽培，每666.7m2 種植2 500株左右。

施肥應(yīng)重施基肥和早追肥，注意氮磷鉀肥配合使用。苗期防水淹、干旱，結(jié)球初期重施氮肥和鉀肥，及時(shí)澆水，生長(zhǎng)期間及時(shí)治蟲(chóng)防病。收獲前一周停止?jié)菜?，成熟后及時(shí)收獲。

2.6.4?高綠2號(hào)?母本為貝迷你1，父本為綠12-430。該品種（圖11）早熟，生長(zhǎng)期55～60 d，株高26 cm，開(kāi)展度45 cm，直筒，凈菜率為79%，單球重1.5～2.0 kg。株型直立緊湊，葉色深綠，中肋淺綠色球頂呈合抱，葉紋適中，品質(zhì)優(yōu)良。室內(nèi)苗期人工接種高抗病毒病、霜霉病和軟腐病。2015、2016年品種比較試驗(yàn)比對(duì)照京春娃3號(hào)增產(chǎn)6.6%、7.2%。

該品種在山東早春、秋季8月中旬均可播種。高壟栽培，每666.7m2 種植5 000株左右;可畦播，每666.7m2 種植6 500株左右。春播要地膜覆蓋。施肥應(yīng)重施基肥和早追肥，加大有機(jī)基肥用量，注意氮磷鉀肥配合使用，及時(shí)澆水，及時(shí)防治菜青蟲(chóng)、小菜蛾等各種害蟲(chóng)。收獲前一周停止?jié)菜?，成熟后及時(shí)收獲。

3?討論與結(jié)論

雜種優(yōu)勢(shì)育種是作物改良的一個(gè)有效手段。現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于玉米、水稻等糧食作物，棉花、油菜等油料作物，以及大白菜、青梗菜、甘藍(lán)、菜花、番茄、黃瓜、西瓜、西葫蘆等蔬菜作物的育種實(shí)踐中[12，13]。雜種優(yōu)勢(shì)育種的關(guān)鍵是如何快速獲得自交純系。傳統(tǒng)育種對(duì)目標(biāo)性狀的改良，需要將供體親本（含相對(duì)應(yīng)的優(yōu)良性狀）的花粉授給受體親本（需改良性狀的親本），再經(jīng)過(guò)5～10代的回交和背景選擇，最后篩選出目標(biāo)性狀改良、其它性狀完全像受體親本的純系個(gè)體，用于下一步育種。上述過(guò)程費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，成本昂貴，特別是因表型觀察準(zhǔn)確性和遺傳累贅效應(yīng)等因素的影響，選擇效果并不總能與預(yù)期育種目標(biāo)相符[14，15]。因此，提高選擇效率、加快育種進(jìn)程、建立快速精準(zhǔn)的育種技術(shù)顯得越來(lái)越重要。本研究將位于3個(gè)不同染色體上的單基因隱性性狀及其分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)應(yīng)用于大白菜育種實(shí)踐中，大大提高了育種效率，使育種年限縮短3年左右。

本研究發(fā)現(xiàn)，將三隱性性狀及其分子標(biāo)記應(yīng)用于輔助選擇育種時(shí)，親本材料需要具備優(yōu)良的綜合農(nóng)藝性狀，其A01、A06和A09染色體上的重要農(nóng)藝性狀要符合育種目標(biāo)要求，不能有嚴(yán)重缺陷，否則會(huì)延長(zhǎng)育種進(jìn)程;若能結(jié)合使用遺傳位點(diǎn)位于其它七個(gè)染色體上的獨(dú)立隱性分子標(biāo)記輔助選擇，選擇速率會(huì)更高。

Wang等報(bào)道了一種稱為IMGE （haploid inducer-mediated genome editing）的育種策略，巧妙地將單倍體誘導(dǎo)與CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)結(jié)合起來(lái)，成功地在兩代內(nèi)創(chuàng)造出經(jīng)基因編輯改良的雙單倍體（DH）純系[16]。該研究結(jié)果與Kelliher等[17]較先提出的HI-Edit育種策略不謀而合。兩篇完全獨(dú)立的報(bào)道為該策略的可靠性提供了進(jìn)一步的佐證。Kelliher等（2019）還發(fā)現(xiàn)HI-Edit技術(shù)可以和CENH3系統(tǒng)結(jié)合用于雙子葉作物的改良;利用攜帶有Cas9-TaGT1s 載體的玉米轉(zhuǎn)基因植株的花粉授給已去雄的小麥品種AC Nanda或者胞質(zhì)雄性不育系（CMS）植株的柱頭上，通過(guò)胚拯救的方式成功獲得經(jīng)基因編輯改良的小麥單倍體植株[17]。IMGE和HI-Edit為農(nóng)作物遺傳改良提供了一種快捷、精準(zhǔn)的方法，但其高效使用的前提是必須有單倍體誘導(dǎo)系[18]。對(duì)于絕大多數(shù)農(nóng)作物來(lái)說(shuō)，高效的單倍體誘導(dǎo)系尚未被發(fā)現(xiàn)或創(chuàng)制。在這種情況下，應(yīng)當(dāng)開(kāi)發(fā)尋找其它高效育種方法，把多個(gè)優(yōu)良隱性性狀及其分子標(biāo)記應(yīng)用于輔助選擇不失為一種明智的策略。

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