王曉霞，邵增瑯，唐杏燕，裴少芬，黃鳴，黃葉飛

（南京融點(diǎn)食品科技有限公司速溶茶工程研究中心，江蘇南京 211300）

茶樹（Camellia sinensis）為多年生木本植物，在長(zhǎng)期的生長(zhǎng)過程中，已形成獨(dú)特的內(nèi)生菌群[1]。茶樹內(nèi)生菌種類繁多，資源豐富，以茶樹內(nèi)生菌及其代謝物作為農(nóng)用價(jià)值的菌株和化合物所開展的研究正在興起[2]。有機(jī)磷類農(nóng)藥在化學(xué)結(jié)構(gòu)上屬于有機(jī)磷酯，是目前用量最多、使用范圍最廣的農(nóng)藥，屬于神經(jīng)毒素，其殘留對(duì)人等非靶標(biāo)生物有一定毒性效應(yīng)[3]；引起中毒的作用機(jī)理是抑制體內(nèi)的膽堿酯酶，使其失去分解乙酰膽堿的能力，從而造成體內(nèi)乙酰膽堿的積累，刺激中樞神經(jīng)系統(tǒng)，使各項(xiàng)功能失調(diào)，引起生理紊亂[4]，因此去除有機(jī)磷類農(nóng)藥的殘留尤為重要。此外，農(nóng)藥殘留是影響我國(guó)速溶茶出口的主要問題，特別是近幾年，歐盟對(duì)茶葉農(nóng)殘項(xiàng)目的規(guī)定不斷增多，限值大幅降低，我國(guó)茶葉出口企業(yè)受到了很大沖擊，因此茶產(chǎn)品農(nóng)殘問題的解決迫在眉睫[5]。

近年來(lái)，對(duì)茶樹內(nèi)生真菌的研究主要集中在內(nèi)生菌的分離方法、分布規(guī)律、不同地區(qū)優(yōu)勢(shì)菌種的鑒定、生物學(xué)作用等方面[6]，但對(duì)功能性內(nèi)生真菌的研究，尤其是關(guān)于農(nóng)藥降解菌的篩選及應(yīng)用卻鮮有報(bào)道。研究就目前速溶茶生產(chǎn)中的農(nóng)藥殘留問題，通過從茶樹內(nèi)生真菌中篩選出能降解有機(jī)磷類農(nóng)藥殘留的功能性內(nèi)生真菌菌株，并將其應(yīng)用于速溶茶生產(chǎn)工藝，初步探討功能性內(nèi)生真菌在速溶茶生產(chǎn)中的應(yīng)用效果和產(chǎn)業(yè)化的可能性，為研究茶樹內(nèi)生菌尋找新的功能基因和活性物質(zhì)提供思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

提取用的綠碎茶原料購(gòu)自黃山一品有機(jī)茶葉有限公司；內(nèi)生真菌菌株篩選自江蘇省南京市紫金山中山陵的“龍井長(zhǎng)葉”茶樹。

甲胺磷、甲基毒死蜱、殺螟硫磷、水胺磷、殺撲磷、乙硫磷及三唑磷的標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所。

1.2 儀器設(shè)備

LRH-250生化培養(yǎng)箱（上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）；HZQ-F160型全溫振蕩培養(yǎng)箱 （太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠）；LDZM-80KCS立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）；DHG-9003BS電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 （上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）；TU-1810DS紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；SW-CJ-ID型雙人凈化工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；TDL-5-A型低速臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；MTN-2800D氮吹濃縮裝置 （天津奧特賽恩斯儀器有限公司）；安捷倫7890A氣相色譜儀（上海申安醫(yī)療器械廠）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 培養(yǎng)基的制備

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯20.0 g煮沸30 min，葡萄糖2.0 g，瓊脂1.7 g，蒸餾水100 mL；121℃滅菌20 min。

PDB培養(yǎng)基：馬鈴薯200.0 g煮沸30 min，葡萄糖 20.0 g，蒸餾水1000 mL；121℃滅菌20 min。

有機(jī)磷農(nóng)藥液體培養(yǎng)基：PDB培養(yǎng)基中用100 mg/L甲基毒死蜱、100 mg/L水胺磷、100 mg/L三唑磷代替葡萄糖作為唯一碳源，121℃滅菌20 min，待用。

有機(jī)磷農(nóng)藥固體培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基中用100 mg/L甲基毒死蜱、100 mg/L水胺磷、100 mg/L三唑磷代替葡萄糖作為唯一碳源，121℃滅菌20 min，待用。

茶水發(fā)酵培養(yǎng)基：綠碎茶100.0 g，水1300 mL，93℃浸提 30 min，紗布過濾去除茶渣；121℃滅菌20 min。

1.3.2 農(nóng)藥降解菌的富集馴化和篩選

參照徐剛明[7]的方法進(jìn)行農(nóng)藥降解菌的富集馴化和高效降解菌的篩選分離。采集噴施過農(nóng)藥的直徑為0.5 mm以上的健康枝條。將采回的樣本葉片摘下，用75%酒精浸泡30 s，再用無(wú)菌水漂洗，自然晾干后用于內(nèi)生真菌的分離、培養(yǎng)。從每張葉片中用無(wú)菌解剖刀在距葉柄約1/3處沿主脈切開，切取約0.5 cm×0.5 cm大小的組織塊，經(jīng)表面消毒后，用含甲基毒死蜱、水胺磷和三唑磷各5 mg/L的PDB培養(yǎng)基于30℃、200 r/min富集培養(yǎng)7 d后，取10%轉(zhuǎn)接至新鮮培養(yǎng)基中并將農(nóng)藥濃度提高一倍，如此連續(xù)轉(zhuǎn)接5次，直至農(nóng)藥濃度提高到160 mg/L。富集培養(yǎng)結(jié)束后，離心發(fā)酵液收集菌體，轉(zhuǎn)接到以甲基毒死蜱、水胺磷和三唑磷為唯一碳源的PDB培養(yǎng)基中連續(xù)繼代培養(yǎng)篩選，然后用稀釋平板法篩選直至分離獲得純化的菌株。菌種用甘油管低溫保藏。

1.3.3 農(nóng)藥降解菌在速溶茶生產(chǎn)中的應(yīng)用

將篩選出的菌株制成菌懸液接種到有機(jī)磷農(nóng)藥液體培養(yǎng)基中，測(cè)定菌株生長(zhǎng)情況；將生長(zhǎng)旺盛的菌接種于茶水發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，每隔1 d，取發(fā)酵液過濾、濃縮、滅菌、噴干后測(cè)定噴干茶粉的農(nóng)藥殘留。

1.3.4 測(cè)定方法

生長(zhǎng)曲線測(cè)定。菌體生長(zhǎng)量用分光光度法[8]測(cè)定。在波長(zhǎng)600 nm處測(cè)定吸光值，用OD600表示，圖表中OD600值均為菌體發(fā)酵液吸光值減去不接菌培養(yǎng)基吸光值。

有機(jī)磷農(nóng)藥殘留測(cè)定。采用氣相色譜法[9]：在活性炭固相萃取柱上端裝入1 cm高的無(wú)水硫酸鈉，用乙酸乙酯2 mL預(yù)淋洗小柱，棄去流出液，然后將離心凈化后的發(fā)酵液傾入柱中，再分別用4 mL乙酸乙酯，2 mL乙酸乙酯、正己烷混合液（體積比1∶1）洗脫，收集全部洗出液于氮吹管中，于40℃下氮?dú)饬鞔抵?.5 mL，供氣相色譜分析。色譜柱：DB-1701毛細(xì)管柱子 （30 m×0.3 mm×0.25 μm）；升溫程序：80 ℃→40℃（升溫）→150 ℃（8 ℃升溫）→250 ℃（8 min）；溫度條件：進(jìn)樣口溫度250℃，柱溫250℃，檢測(cè)器溫度230℃。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SAS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 有機(jī)磷類農(nóng)藥降解菌的篩選

試驗(yàn)前期通過公司生產(chǎn)的速溶茶粉進(jìn)行有機(jī)磷類農(nóng)藥殘留測(cè)定，發(fā)現(xiàn)主要的農(nóng)殘為甲基毒死蜱、水胺磷和三唑磷，因此有針對(duì)性地篩選能有效降解這三種農(nóng)殘的茶樹內(nèi)生真菌。通過PDA培養(yǎng)基初篩和有機(jī)磷農(nóng)藥固體培養(yǎng)基富集馴化，從龍井茶葉片上篩選分離得到了4株具有較強(qiáng)降解甲基毒死蜱、水胺磷和三唑磷的菌株，分別命名為ES-1、ES-2、ES-3 和 ES-4，如圖 1 所示。

從圖1可以看出，富集馴化的4株菌在含有100 mg/L甲基毒死蜱+100 mg/L水胺磷+100 mg/L三唑磷的固體培養(yǎng)基上形成了明顯的降解透明圈，其中ES-4透明圈的直徑明顯大于其他3株菌。

圖1 4株菌在有機(jī)磷農(nóng)藥固體培養(yǎng)基上的降解透明圈Fig.1 The degradation of transparent circle of the 4 fungi in the organic phosphorus pesticides solid medium

將這4株菌接種于有機(jī)磷農(nóng)藥液體培養(yǎng)基中，測(cè)定菌體生長(zhǎng)情況。從圖2可以看出，4株菌的生長(zhǎng)情況較好，其中ES-2延滯期較長(zhǎng)，穩(wěn)定期較短，其他3株菌延滯期均較短，而穩(wěn)定期較長(zhǎng)。在同樣的培養(yǎng)條件下，以ES-4生長(zhǎng)情況最好，便于擴(kuò)大培養(yǎng)。

圖2 4株菌在有機(jī)磷農(nóng)藥液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況Fig.2 The growth curve of 4 fungi in the organic phosphorus pesticides liquid medium

2.2 用ES-4農(nóng)藥降解菌降解速溶茶中的農(nóng)藥殘留

從“2.1”的培養(yǎng)結(jié)果和降解結(jié)果可知，ES-4的生長(zhǎng)和降解能力均強(qiáng)于其他3株菌，因此選用ES-4作為速溶茶中的農(nóng)藥降解菌。

用ES-4降解速溶茶中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的技術(shù)路線如圖3所示。

圖3 ES-4降解速溶茶中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的技術(shù)路線Fig.3 Technical roadmap of degradation of organophosphorus pesticide residues in instant tea by ES-4

將ES-4菌懸液按10%接種量接種于茶水發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃、200 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)2 d。將發(fā)酵液用8層紗布過濾，濃縮、滅菌、噴干后得速溶茶粉。

分別配制一系列濃度的有機(jī)磷農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照“1.3.4”農(nóng)藥殘留測(cè)定方法進(jìn)樣，測(cè)定速溶茶粉中的農(nóng)藥殘留。如圖4所示。

試驗(yàn)檢測(cè)了黃山一品綠碎茶浸提液噴干茶粉中的農(nóng)藥殘留，如圖4B所示，主要為甲基毒死蜱、水胺磷和三唑磷。將綠茶浸提液滅菌后，接種ES-4發(fā)酵，從圖4 C中可以看出，用ES-4發(fā)酵1 d后，發(fā)酵液噴干茶粉中未檢測(cè)甲基毒死蜱和水胺磷，說明ES-4能快速分解利用甲基毒死蜱和水胺磷。如圖4D所示，發(fā)酵2 d的噴干速溶茶粉中依然能夠檢測(cè)出三唑磷，但與發(fā)酵1 d和未發(fā)酵的速溶茶相比有所減少，這說明ES-4菌株對(duì)三唑磷的降解利用比較緩慢。

3 討論

文章通過在有機(jī)磷農(nóng)藥培養(yǎng)基中產(chǎn)生透明圈的方法[10]，得到了4株降解有機(jī)磷農(nóng)藥的菌株，以ES-4降解效果最好，能有效降解甲基毒死蜱和水胺磷類農(nóng)藥。菌株對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥的降解，多是因?yàn)榫晁a(chǎn)生的有機(jī)磷農(nóng)藥降解酶對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥的降解作用[11]。目前對(duì)于利用微生物降解有機(jī)磷農(nóng)藥已有大量的報(bào)道，能夠分離到的微生物種類繁多，但由于微生物代謝途徑的多樣性，其降解機(jī)理也不盡相同。通過研究者多年的研究認(rèn)為，微生物對(duì)化合物的降解作用簡(jiǎn)單來(lái)說分為三步，首先化合物在微生物細(xì)胞表面吸附，其次化合物進(jìn)入到微生物細(xì)胞內(nèi)，最后化合物在微生物細(xì)胞內(nèi)被降解[12]。

關(guān)于通過篩選茶樹內(nèi)生菌降解農(nóng)藥殘留方面的研究，目前的報(bào)道僅有洪永聰?shù)萚13]以不同茶樹品種的健葉和病葉為研究對(duì)象，分離、篩選和鑒定內(nèi)生細(xì)菌，分離得到了14株在氯氰菊酯平板上生長(zhǎng)良好的菌株，這14個(gè)目標(biāo)菌株對(duì)氯氰菊酯都有不同程度的降解作用，其中TL10、TL7和TL2對(duì)氯氰菊酯的降解效能較高，從時(shí)間上來(lái)看，6～48 h內(nèi)目標(biāo)菌株對(duì)氯氰菊酯的降解率呈直線增長(zhǎng)，而48 h后降解率就沒有太大變化，并經(jīng)鑒定，菌株TL2為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）；王兆守等[14]以福州某茶園經(jīng)農(nóng)藥處理過的茶葉為研究材料，通過以農(nóng)藥為唯一碳源的基礎(chǔ)培養(yǎng)基連續(xù)篩選。分離農(nóng)藥降解菌，獲得了一株標(biāo)號(hào)為c1f6的菌株，經(jīng)鑒定為假單胞菌屬的一個(gè)未知種，該菌株對(duì)擬除蟲菊酯類農(nóng)藥聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯和氯氰菊酯均有較明顯的降解作用，同時(shí)菌株c1f6對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥也有一定的降解，3 d對(duì)甲胺磷和毒死蜱的降解率分別為27.67%和12.35%。

內(nèi)生菌是植物的天然資源菌，對(duì)寄主植物有促生、防病、內(nèi)生固氮、殺蟲、降解重金屬、農(nóng)藥及有機(jī)污染物等多方面的生物學(xué)功能[13]，研究茶樹內(nèi)生菌的生物學(xué)功能，將為茶樹內(nèi)生菌資源庫(kù)的建立打下基礎(chǔ)，同時(shí)對(duì)茶生產(chǎn)過程中農(nóng)藥殘留的治理等也將起到積極的促進(jìn)作用，具有廣闊的理論研究?jī)r(jià)值和開發(fā)應(yīng)用前景，文章只是初步篩選出能有效降解有機(jī)磷（水胺磷和甲基毒死蜱）的茶樹內(nèi)生真菌ES-4，但ES-4的株菌類型、降解機(jī)理尚不明確，所以后續(xù)需要對(duì)ES-4做進(jìn)一步的分子鑒定，并對(duì)其降解機(jī)理做詳細(xì)研究；同時(shí)考慮到ES-4應(yīng)該是只能耐受三唑磷農(nóng)藥，但不能將其有效降解，因此，有必要再有針對(duì)性的篩選降解三唑磷的內(nèi)生菌，同時(shí)考慮將兩種或幾種能夠降解有機(jī)磷農(nóng)藥的菌株混合發(fā)酵培養(yǎng)[15]，以達(dá)到預(yù)期的效果。

圖4 有機(jī)磷農(nóng)藥色譜圖Fig.4 Chromatogram map of organic phosphorus pesticides