程寅勝 楊立 陳健秋 張紹鈴 伍濤 張虎平

摘要：為篩選梨糖轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白PbTMT4互作因子，基于已經(jīng)建立好的碭山酥梨果實(shí)發(fā)育時(shí)期的cDNA文庫，利用MatchmakerTM Gold酵母雙雜交系統(tǒng)，以構(gòu)建的重組質(zhì)粒pDHB1-PbTMT4為誘餌質(zhì)粒，采用PEG/LiAc法轉(zhuǎn)化酵母菌株NMY51。利用表型篩選法檢測PbTMT4的自激活作用和毒害作用，利用氨基酸缺陷型培養(yǎng)基篩選PbTMT4互作因子。結(jié)果表明，誘餌蛋白PbTMT4在酵母雙雜交系統(tǒng)中無毒性和自激活作用。通過酵母雙雜交篩選以及測序和序列比對分析，共獲得13個(gè)與PbTMT4蛋白相互作用的宿主蛋白。

關(guān)鍵詞：PbTMT4;酵母雙雜交系統(tǒng);cDNA文庫;互作因子

中圖分類號：S661.2 ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：0439-8114（2019）24-0240-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.24.058 ? ? ? ? ? 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Screening PbTMT4 interaction factor by yeast two-hybrid system in pear

CHENG Yin-sheng1，YANG Li1，CHEN Jian-qiu2，ZHANG Shao-ling2，WU Tao1，ZHANG Hu-ping2

（1.Institute of Fruit Tree Tea，Hubei Academy of Agricultural Sciences，Wuhan 430064，China;

2.College of Horticulture，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China）

Abstract： To screen for the interaction factor of PbTMT4， a pear sugar transport related gene， based on the established cDNA library of Dangshan Suli pear fruit development period， using MatchmakerTM Gold yeast two-hybrid system， the constructed recombinant plasmid pDHB1-PbTMT4 was used as a bait plasmid to transform yeast strain NMY51 by PEG/LiAc method. The phenotypic screening method was used to detect the self-activation and toxic effects of PbTMT4. The PbTMT4 gene interaction factor was screened using an amino acid-deficient medium. The results showed that the bait protein PbTMT4 was non-toxic and self-activating in the yeast two-hybrid system. Through yeast two-hybrid screening and sequencing and sequence alignment analysis， a total of 13 host proteins interacting with PbTMT4 protein were obtained.

Key words： PbTMT4; yeast two-hybrid system; cDNA library; interaction factor

液泡膜單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Tonoplast monosaccharide transporter，TMT）是定位于液泡膜的單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，負(fù)責(zé)糖在胞質(zhì)和液泡之間的轉(zhuǎn)運(yùn)[1]，屬于協(xié)助擴(kuò)散超家族（Major facilitator superfamily，MFS），也稱為共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族，在所有的生物中都有發(fā)現(xiàn)[2]。在分子和功能水平上的研究表明，它是具有葡萄糖和果糖轉(zhuǎn)運(yùn)能力的液泡載體蛋白[2，3]。擬南芥液泡膜單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AtTMT參與液泡內(nèi)單糖的累積，低溫、干旱、鹽脅迫可以誘導(dǎo)該蛋白的表達(dá)，說明該蛋白參與擬南芥對滲透脅迫的應(yīng)答[4]。植物中關(guān)于糖轉(zhuǎn)運(yùn)互作機(jī)理的研究極其少見，在蘋果中通過酵母雙雜交試驗(yàn)表明，液泡膜葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因MdVGT1與MdTMT1在體外能相互作用，其可能與MdTMT1互作共同轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖進(jìn)入液泡膜[5]。梨中被鑒定出6個(gè)TMT家族成員（PbTMT1-PbTMT6），并且認(rèn)為PbTMT4基因與果實(shí)發(fā)育和成熟過程中糖的積累密切相關(guān)，是影響果實(shí)品質(zhì)的重要候選基因[6-8]。隨后研究表明，PbTMT4定位于液泡膜上，能夠顯著提高轉(zhuǎn)基因植物糖含量，同時(shí)對植株的生長發(fā)育具有促進(jìn)作用[9，10]。逆境處理發(fā)現(xiàn)，PbTMT4轉(zhuǎn)基因株系較野生型植株受到的傷害小，表明該基因可能在抗非生物脅迫中起重要的調(diào)控作用[10]。本研究希望通過酵母雙雜交技術(shù)，利用梨果實(shí)cDNA文庫，初步篩選PbTMT4的互作因子，為進(jìn)一步深入研究該基因在糖轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制和植株生長發(fā)育中的分子調(diào)控機(jī)制提供基礎(chǔ)。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

供試樣品碭山酥梨（Pyrus bretschneideri，Dangshan Suli）果實(shí)采自南京農(nóng)業(yè)大學(xué)江浦農(nóng)場園藝試驗(yàn)站。碭山酥梨果實(shí)發(fā)育時(shí)期cDNA文庫、表達(dá)載體pDHB1和用于轉(zhuǎn)化的NMY51酵母菌株由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)國家梨產(chǎn)業(yè)技術(shù)研發(fā)中心保存。大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α和農(nóng)桿菌GV3101購自南京百思禾生物科技有限公司。pDHB1載體由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)國家梨產(chǎn)業(yè)技術(shù)研發(fā)中心實(shí)驗(yàn)室保存。膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒購自南京偉沃生物科技有限公司。酵母提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司。碭山酥梨果實(shí)發(fā)育時(shí)期cDNA文庫為南京農(nóng)業(yè)大學(xué)國家梨產(chǎn)業(yè)技術(shù)研發(fā)中心實(shí)驗(yàn)室保存，MatchmakerTM Gold酵母雙雜交系統(tǒng)試劑盒及各種酵母缺陷型培養(yǎng)基均購自Clontech公司。

1.2 ?RNA提取和cDNA合成

使用成都福際生物技術(shù)有限公司多糖多酚植物RNA提取試劑盒提取。反轉(zhuǎn)錄試劑盒TransScript？誖One-Step RT-PCR SuperMix購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.3 ?基因克隆引物設(shè)計(jì)

從梨基因組數(shù)據(jù)庫中下載目的基因PbTMT4的CDs參考序列，利用軟件SnapGene設(shè)計(jì)基因克隆引物，上游引物均包含5′端起始密碼子（ATG），下游引物保留3′端終止密碼子（TAA）。同時(shí)根據(jù)PbTMT4基因酶切位點(diǎn)、pDHB1酶切位點(diǎn)圖譜，在基因克隆上游引物序列5′端和下游引物序列3′端分別加入合適的酶切位點(diǎn)。選取的酶切位點(diǎn)5′端和3′端均為SfiI（表1）。

1.4 ?基因克隆及誘餌表達(dá)載體構(gòu)建

利用參考序列引物，以碭山酥梨果實(shí)cDNA為模板，經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到產(chǎn)物連接到pEASY-T1載體上，經(jīng)PCR驗(yàn)證后由北京擎科生物技術(shù)有限公司測序。利用DNAMAN軟件分析測序結(jié)果和參考序列的一致性，將測序正確的轉(zhuǎn)化子經(jīng)酶切后和表達(dá)載體pDHB1利用T4DNA連接酶連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pDHB1-PbTMT4。經(jīng)過酶切和測序（測序引物）檢測正確的重組質(zhì)粒，利用凍融法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101。再反轉(zhuǎn)大腸桿菌DH5α，提取其質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定。

1.5 ?誘餌蛋白毒性及自激活活性檢測

將PbTMT4-pDHB1和空載pDHB1分別單轉(zhuǎn)入酵母菌株NMY51，涂布SD/-leu培養(yǎng)板，PCR驗(yàn)證正確后，分別用去離子水重懸，稀釋不同濃度，分別吸取20 μL垂直滴于SD/-leu培養(yǎng)板，比較各組菌液的生長狀況，如果沒有區(qū)別，即說明該融合蛋白對酵母無毒性，可以用于文庫篩選。

將PbTMT4-pDHB1和pPR3空載質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)入NMY51酵母細(xì)胞，同時(shí)將空載對照PDHB1+pPR3、陽性對照NubI+pDHB1以及陰性對照NubI+pPR3同時(shí)轉(zhuǎn)化，涂于SD/-trp/-leu培養(yǎng)板，培養(yǎng)3～4 d后，用去離子水分別重懸4組轉(zhuǎn)化后的菌體，分別吸取20 μL滴到SD/-trp/-leu培養(yǎng)板和SD/-trp/-leu/-His/-Ade培養(yǎng)板，30 ℃培養(yǎng)3～5 d觀察結(jié)果。

1.6 ?PbTMT4互作因子初步篩選及分析

誘餌載體PbTMT4-PDHB1與文庫質(zhì)粒共轉(zhuǎn)入感受態(tài)酵母菌株NMY51，涂布于三缺SD/-trp/-leu/-His平板，長點(diǎn)后提取其菌液質(zhì)粒進(jìn)行PCR檢測（引物pPR3-F/pPR3-R），吸取2 μL進(jìn)行凝膠電泳檢測，長度大于200 bp PCR產(chǎn)物送公司測序。對上一步篩選出的陽性克隆在測序后，利用BLAST對結(jié)果進(jìn)行同源性分析、比對（http：//202.195.250.6/wp/），并利用TAIR（https：//www.arabidopsis.org/index.jsp）在線工具分析陽性克隆所代表基因的來源與蛋白功能等相關(guān)信息。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?PbTMT4基因克隆及融合載體構(gòu)建

以碭山酥梨果實(shí)cDNA為模板，PCR擴(kuò)增得到該基因（圖1A）CDS序列，測序結(jié)果表明該基因大小為2 211 bp（圖2）。

測序正確的轉(zhuǎn)化子和酵母表達(dá)載體pDHB1同時(shí)利用Sfi I進(jìn)行酶切，回收產(chǎn)物利用T4-DNA連接酶連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒PbTMT4-pDHB1。經(jīng)過酶切和測序（測序引物，表1）檢測正確的重組質(zhì)粒利用凍融法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101。再反轉(zhuǎn)大腸桿菌DH5α，提取其質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定（圖1B）。

2.2 ?酵母轉(zhuǎn)化

采用PEG/LiAc法將構(gòu)建好的載體PbTMT4-pDHB1轉(zhuǎn)化酵母菌株NMY51，轉(zhuǎn)化成功后進(jìn)行PCR驗(yàn)證（圖3），進(jìn)一步測序正確的菌株進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.3 ?自激活和毒性試驗(yàn)

將TMT4-pDHB1重組質(zhì)粒和空載pPR3質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)入NMY51酵母菌株，分別吸取20 μL菌液垂直滴在SD/-trp/-leu和SD/-trp/-leu/-His/-Ade平板，結(jié)果如圖4所示，在二缺SD平板所有的酵母菌株都有生長，而在四缺SD平板，只有陽性對照生長。結(jié)果表明，PbTMT4基因本身沒有自激活現(xiàn)象，可以進(jìn)行酵母互作試驗(yàn)。

將轉(zhuǎn)化有重組質(zhì)粒PbTMT4-pDHB1的酵母和轉(zhuǎn)空載pDHB1酵母重懸，并分別稀釋10倍、100倍、1 000倍，垂直滴在SD/-Leu平板，發(fā)現(xiàn)兩類菌落生長狀況沒有明顯差異（圖5），說明PbTMT4基因?qū)MY51酵母菌株無毒害作用。

2.4 ?酵母雙雜交篩選及陽性菌落分析

以PbTMT4為誘餌蛋白，從最早長出來的菌落中挑出100個(gè)生長良好的進(jìn)行質(zhì)粒抽提，然后對文庫質(zhì)粒擴(kuò)增并進(jìn)行測序分析。利用BLAST對測序結(jié)果進(jìn)行同源性分析和比對（http：//202.195.250.6/wp/），并利用NCBT（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）在線工具分析陽性克隆所代表基因的來源與蛋白功能等信息（表2）。

分析表明，Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是一類廣泛存在于酵母、藻類和高等植物的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，定位于細(xì)胞質(zhì)膜和液泡膜上，將Na+從細(xì)胞質(zhì)中排出和將Na+區(qū)隔化于液泡中都需要借助于Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[11-13]，這類基因過量表達(dá)可提高轉(zhuǎn)基因植物的抗鹽性[14，15]。

過氧化物酶（Peroxidase）是植物酶促防御系統(tǒng)的關(guān)鍵酶之一，對有機(jī)過氧化物和過氧化氫各種無機(jī)和有機(jī)氧化物具有催化作用[16]。與過氧化氫酶、超氧化歧化酶協(xié)同清除植物體內(nèi)過剩自由基，以提高植物抗逆性。

磷脂酶和脂激酶是磷脂產(chǎn)生磷脂酸、溶血磷脂酸、鞘氨醇-1-磷酸、六磷酸肌醇和三磷酸肌醇的重要酶，產(chǎn)物參與細(xì)胞間的信號傳遞過程[17-19]。

NAD（P）結(jié)合的Rossmann折疊超家族蛋白具有氧化還原活性，結(jié)合、催化活性，參與植物體內(nèi)的多種氧化還原和代謝過程，定位于雄配子體，花期表達(dá)（NCBI BLink）。

堿性亮氨酸拉鏈（Basic region/leucine zipper motif，bZIP）是由1個(gè)亮氨酸拉鏈二聚體和1個(gè)DNA結(jié)合域構(gòu)成，是較大的轉(zhuǎn)錄因子基因家族之一，普遍存在于所有真核生物[20]。

組蛋白是真核生物體內(nèi)細(xì)胞染色質(zhì)中堿性蛋白，研究表明，組蛋白在轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程中是不可或缺的，會發(fā)生很多共價(jià)化學(xué)修飾，包括乙?；?、甲基化、磷酸化、泛素化、SUMO化以及ADP-核糖基化等，從而影響基因的表達(dá)[21]。組蛋白修飾在與植物生長過程如開花和抗逆之間的關(guān)系還在進(jìn)一步研究中。

富含半胱氨酸蛋白（Cystein-rich protions，CRPs）廣泛存在于植物體內(nèi)，是一類分泌蛋白，具有防御、蛋白酶抑制、重金屬解毒等生物學(xué)功能[22]，同時(shí)，CRPs還參與調(diào)節(jié)植物的生長、發(fā)育和生殖等[23]。植物CRPs的數(shù)量和種類很多，快速堿化因子（Rapid alkalinization factors，RALF）能迅速激活有絲分裂蛋白激酶，可逆性的調(diào)控番茄與擬南芥種子萌發(fā)時(shí)根生長和根毛形成[24]，抑制花粉管的伸長[25]。柱頭/花柱富含半胱氨酸黏附素（Stigma/Style cysteine-rich adhesin，SCA）特異性地在百合柱頭和花柱表達(dá)[26]，SCA的生物活性可以促使Chemocyanin與花粉管的結(jié)合，誘導(dǎo)花粉管定向生長[27]，RALF和SCA都屬于該超家族。

3 ?討論

酵母雙雜交系統(tǒng)（Yeast two-hybrid system）是一種建立于酵母體內(nèi)的用于研究蛋白質(zhì)之間相互作用的基因系統(tǒng)[28]。研究蛋白質(zhì)之間的相互作用，一方面可以從分子水平揭示蛋白質(zhì)功能，另一方面，對于研究植物生長、發(fā)育、分化和凋亡等生命規(guī)律至關(guān)重要，對研究植物調(diào)控機(jī)理、發(fā)現(xiàn)新蛋白功能及建立蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)等提供了重要的理論基礎(chǔ)。酵母雙雜交技術(shù)作為研究蛋白互作的一種新的技術(shù)手段，在近代研究中已經(jīng)取得了重大進(jìn)展。其靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，能夠?qū)⒌鞍踪|(zhì)之間微弱的、瞬間的作用描述下來。

本研究初步篩選出的13個(gè)PbTMT4基因互作因子中，其中有3個(gè)參與植物的生長發(fā)育，包括可逆調(diào)節(jié)植物根生長和根毛形成的富含半胱氨酸蛋白[24]、參與很多氧化還原和代謝過程的Rossmann折疊超家族蛋白和參與組織細(xì)胞分化生長的堿性亮氨酸拉鏈蛋白;有5個(gè)具有防御生物或非生物脅迫的蛋白，包括具有重金屬解毒功能的富含半胱氨酸蛋白、可提高轉(zhuǎn)基因植物的抗鹽性的Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、清除植物體內(nèi)過剩自由基的過氧化物酶、轉(zhuǎn)錄因子堿性亮氨酸拉鏈以及具有修飾作用的組蛋白[21];有3個(gè)參與了植物的生殖生長，CRPs超家族中抑制花粉管伸長的快速堿化因子[24]和誘導(dǎo)花粉管定向生長的柱頭/花柱富含半胱氨酸黏附素[26]、控制植物開花的組蛋白、定位于雄配子體花期表達(dá)的Rossmann折疊超家族蛋白;還有影響細(xì)胞間信號傳導(dǎo)的磷脂酶[29]。這些結(jié)果初步表明，PbTMT4在植物體內(nèi)參與了復(fù)雜的生命代謝過程，包括植物的營養(yǎng)生長、生殖生長、逆境脅迫以及信號傳導(dǎo)等多種生命過程。本研究為探究PbTMT4基因功能提供了更多更新的思路，更細(xì)致的機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

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