黨福軍 王繼棟 覃重軍 夏海洋,*

(1 中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院植物生理生態(tài)研究所合成生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200032；2 浙江省抗真菌藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江海正藥業(yè)股份有限公司，臺(tái)州 317000)

刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)發(fā)酵產(chǎn)生多殺菌素(spinosyn)家族的具有殺蟲活性的化合物(圖1)，其中以多殺菌素A和D活性最高，多殺菌素A和D的混合物開發(fā)成spinosad殺蟲劑，因其獨(dú)特的殺蟲機(jī)理、對(duì)人畜及天敵安全及環(huán)境友好等特性，獲1999年美國總統(tǒng)綠色化學(xué)品挑戰(zhàn)獎(jiǎng)[1]。由刺糖多孢菌突變株發(fā)酵產(chǎn)生的多殺菌素J和L，經(jīng)過化學(xué)修飾變成新型殺蟲劑乙基多殺菌素(spinetoram, 圖1)，對(duì)多殺菌素不能防治的仁果類食心蟲蘋果小卷葉蛾(Cydia pomonella)有特效，其殺蟲譜比多殺菌素更廣，具有對(duì)主要有益昆蟲影響更小，單位面積用量更低，在環(huán)境中殘留期短等優(yōu)點(diǎn)，也被稱為第二代多殺菌素，獲得了2008美國總統(tǒng)綠色化學(xué)品挑戰(zhàn)獎(jiǎng)[2-4]。

多殺菌素J和L與多殺菌素A和D結(jié)構(gòu)上的差異為鼠李糖殘基上3'-O位點(diǎn)上甲基(圖1)。2001年，多殺菌素生物合成基因簇被報(bào)道(Genbank索取號(hào)：AY007564)[5-6]，2011年刺糖多孢菌基因組測(cè)序后(Genbank索取號(hào)：NZ_AEYC00000000.1)[7]，本文在原報(bào)道的多殺菌素生物合成基因簇基礎(chǔ)上拼接出圖2基因簇結(jié)構(gòu)，基因簇的兩側(cè)分別有可能的lacI和tetR家族的調(diào)控基因。前人研究證實(shí)其生物合成基因簇中spnI編碼鼠李糖2'-O-甲基轉(zhuǎn)移酶，spnK編碼鼠李糖3'-O-甲基轉(zhuǎn)移酶，spnH編碼鼠李糖4'-O-甲基轉(zhuǎn)移酶，分別參與多殺菌素鼠李糖殘基上不同位點(diǎn)的甲基化修飾，spnK突變株可產(chǎn)生多殺菌素J和L[8-9]。

由于刺糖多孢菌遺傳操作困難，本實(shí)驗(yàn)室前期通過發(fā)掘糖多孢菌遺傳因子建立了刺糖多孢菌的位點(diǎn)特異性整合體系[10]，積累了大量的刺糖多孢菌遺傳操作經(jīng)驗(yàn)。本文在構(gòu)建刺糖多孢菌黏粒文庫基礎(chǔ)上，結(jié)合λ-Red和FLP位點(diǎn)特異性重組酶介導(dǎo)的體內(nèi)重組，建立了刺糖多孢菌的基因敲除技術(shù)。通過去除spnK編碼保守區(qū)域序列，在工業(yè)菌株中構(gòu)建了spnK失活的突變株，突變菌株可以大量產(chǎn)生多殺菌素J和L。

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

本試驗(yàn)使用的菌株和質(zhì)粒見表1。刺糖多孢菌(S.spinosa)工業(yè)菌株SN1303由浙江海正藥業(yè)股份有限公司提供。

1.2 DNA基本操作和常規(guī)試劑

圖1 多殺菌素系列化合物結(jié)構(gòu)Fig.1 The chemical structures of spinosyn and its derivative

圖2 刺糖多孢菌中多殺菌素生物合成基因簇及側(cè)翼基因Fig.2 Spore biosynthetic gene clusters and flanking genes in Saccharopolyspora spinosa

基因組DNA提取和PCR等操作技術(shù)見文獻(xiàn)[13]。大腸埃希菌培養(yǎng)、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化和刺糖多孢菌基因組文庫構(gòu)建等基本操作技術(shù)參考文獻(xiàn)說明進(jìn)行[14]。大腸埃希菌和刺糖多孢菌接合轉(zhuǎn)移的方法參見文獻(xiàn)[10]。λ-Red介導(dǎo)的體內(nèi)重組、FLP介導(dǎo)的位點(diǎn)特異性重組切除抗性表達(dá)盒等操作按照文獻(xiàn)描述進(jìn)行[11,15]。所用抗生素如氯霉素、壯觀霉素、潮霉素和阿泊拉霉素等，購于Sigma-Aldrich公司；其他生化和化學(xué)試劑購于上海生物工程公司。本研究中所用酶購于賽默飛世爾科技(中國)有限公司。PCR擴(kuò)增所用引物序列及其用途見表2。

表1 本研究所用菌株和質(zhì)粒Tab. 1 Strains and plasmids used in this study

1.3 spnK基因失活載體的構(gòu)建和突變株的獲得

將spnK基因編碼的氨基酸序列與其他O-甲基轉(zhuǎn)移酶序列比對(duì)，選取覆蓋活性中心的保守的41aa對(duì)應(yīng)的123bp序列作為替換失活靶點(diǎn)，以此來構(gòu)建spnK失活載體(圖3)。以pHY778中的FRT-aadA-FRT為模板，利用引物PSN23/PSN24擴(kuò)增出抗性盒，借助λ-Red置換柯斯黏粒pXSC10[插入部分覆蓋了多殺菌素合成基因簇(Genbank索取號(hào)：AY007564)中<1～29972bp區(qū)域的黏粒]中spnK基因內(nèi)部123bp目標(biāo)區(qū)域，獲得中間載體pXS2324；將pXS2324轉(zhuǎn)化入BT340菌株，借助FLP誘導(dǎo)重組，去除aadA抗性表達(dá)盒，從而獲得由FRT重組后81bp的SCAR序列替換spnK基因內(nèi)123bp保守區(qū)域的失活載體pXS2324M。通過接合轉(zhuǎn)移將pXS2324M導(dǎo)入刺糖多孢菌SN1303中，獲得陽性接合子；陽性接合子非抗性選擇培養(yǎng)一代后，挑選抗性丟失菌株，PCR擴(kuò)增篩選出spnK失活突變株，并通過測(cè)序證實(shí)靶標(biāo)區(qū)域的改變。

表2 本研究所用PCR引物Tab. 2 Primers used in this study

1.4 刺糖多孢菌發(fā)酵及產(chǎn)物分離分析

刺糖多孢菌斜面培養(yǎng)使用牛奶培養(yǎng)基(全脂奶粉20g/L，酵母抽提物3g/L，葡萄糖5g/L，瓊脂20g/L)，30℃培養(yǎng)7d；適量孢子接入種子培養(yǎng)基(全脂奶粉1%，葡萄糖1%，酵母抽提粉0.5%，蛋白胨0.5%)，置搖床中250r/min，28℃培養(yǎng)72h；按接種量10%將種子培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基(全脂奶粉1%，葡萄糖10%，酵母抽提粉0.5%，蛋白胨1%，豆油1%，K2HPO40.1%，CaCO30.5%)，置搖床中250r/min，28℃培養(yǎng)8d，取樣分析。

圖3 SpnK保守結(jié)構(gòu)域失活示意圖Fig.3 The schematic graph of inactivation the conserved domain of SpnK

圖4 基于黏粒文庫的基因敲除Fig.4 Gene replacement on the basis of cosmid library

取2mL發(fā)酵液加入4mL無水甲醇，超聲波處理0.5～1h，12000r/min離心10min，取上清液直接用于HPLC分析。HPLC分析條件：Agilent Zorbax Eclipse XDB-C8(4.6mm×150mm, 5μm；貨號(hào)：993967-906)色譜柱，檢測(cè)波長(zhǎng)246nm；流動(dòng)相甲醇:乙腈:水(含0.05%乙酸銨)=45:45:10；流速1.0mL/min。目標(biāo)產(chǎn)物L(fēng)C-MS分析，產(chǎn)物純化后NMR結(jié)構(gòu)確認(rèn)均由海正藥業(yè)中央研究院分析測(cè)試中心完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 刺糖多孢菌基因敲除體系建立

利用圖4A所示的黏粒載體pHX31，構(gòu)建刺糖多孢菌的基因組文庫，通過PCR篩選，獲得了覆蓋多殺菌素生物合成基因簇的黏粒，其中黏粒pXSC10覆蓋了基因簇(Genbank索取號(hào)：AY007564)中<1～29972bp區(qū)域，覆蓋了我們拼接出的多殺菌素生物合成基因簇(圖2)附近的tetR基因(sspn_RS0122895，位于Genbank索取號(hào)：NZ_GL877879，S. spinosaNRRL 18395基因組Scaffold000002序列中851038..851640 nt)，因此我們選擇該tetR基因測(cè)試敲除效率。通過利用來自質(zhì)粒pSN09的FRT-hyg-FRT抗性表達(dá)盒替換黏粒pXSC10上的tetR，獲得質(zhì)粒pCM232。進(jìn)一步通過接合轉(zhuǎn)移將pCM232導(dǎo)入刺糖多孢菌SN1303中，篩選潮霉素抗性接合子。

隨機(jī)挑選6個(gè)純化后的潮霉素抗性接合子(命名CM232-1～6)，分別涂布含潮霉素和阿泊拉霉素平板，檢測(cè)菌株的生長(zhǎng)，并通過PCR檢測(cè)目標(biāo)基因的替換情況，結(jié)果顯示(圖4B)，接合子1、3、4、6僅能擴(kuò)增出替換后的條帶，2和5還能擴(kuò)增出未替換的條帶，并且1、3、4、6僅能在含潮霉素平板生長(zhǎng)，2和5可以在兩種平板生長(zhǎng)，因此計(jì)算tetR敲除效率可以達(dá)到66%。

2.2 spnK基因失活突變株的獲得

將spnK基因失活載體pXS2324M通過接合轉(zhuǎn)移方法導(dǎo)入刺糖多孢菌SN1303，非選擇條件培養(yǎng)一輪后選擇抗性丟失菌株，利用引物PSN26和P81F-1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，圖5的凝膠電泳結(jié)果顯示，在可能的雙交換突變株中，擴(kuò)增出預(yù)期的1039bp條帶。進(jìn)一步用引物PSN25和PSN26擴(kuò)增突變株染色體上的?spnK完整片段，測(cè)序證實(shí)在突變株中spnK基因目的序列已按照預(yù)期被替換，陽性突變株命名為SN1306。將pXSC10通過結(jié)合轉(zhuǎn)移導(dǎo)入突變株SN1306中，獲得單交換的回補(bǔ)菌株SN1310。

圖5 PCR擴(kuò)增和電泳驗(yàn)證spnK基因敲除的突變株Fig.5 Agarose gel electrophoresis of PCR products from spnK null mutants

2.3 HPLC和LC-MS檢測(cè)突變株的發(fā)酵產(chǎn)物

將出發(fā)菌株SN1303、突變株SN1306和回補(bǔ)菌株SN1310進(jìn)行液體發(fā)酵，發(fā)酵液處理后利用高壓液相色譜(HPLC)檢測(cè)產(chǎn)多殺菌素情況(圖6)。

HPLC結(jié)果顯示，突變株SN1306產(chǎn)生了不同于多殺菌素A和D的發(fā)酵產(chǎn)物，且出峰時(shí)間提前?；匮a(bǔ)菌株SN1310雖然產(chǎn)量低于SN1303，但發(fā)酵產(chǎn)物組分相同，由此推測(cè)SN1306發(fā)酵產(chǎn)物的變化是由spnK基因的失活導(dǎo)致的。進(jìn)一步利用HPLC-MS分析突變株SN1306發(fā)酵產(chǎn)生的兩個(gè)主要產(chǎn)物compound I和II分子量分別為717和731(圖6)，比多殺菌素A(MW:731)和D(MW:745)的分子量分別相應(yīng)的減少了14，剛好是一個(gè)甲基取代的分子量差異，與出發(fā)菌株相比，突變株發(fā)酵產(chǎn)物結(jié)構(gòu)上可能是少了-CH3，結(jié)合文獻(xiàn)比對(duì)，推測(cè)新生產(chǎn)的compound I和II分別為多殺菌素J和L。

2.4 NMR證實(shí)突變株發(fā)酵產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)

利用突變株SN1306發(fā)酵產(chǎn)物大量提取，通過柱層析、制備色譜等技術(shù)獲得約8mg的compound I, 用HPLC-MS檢測(cè)樣品純度可用于核磁共振(NMR)分析，13C NMR和1H NMR光譜分析數(shù)據(jù)如下表(表3)。

圖6 HPLC檢測(cè)菌株發(fā)酵產(chǎn)物Fig.6 HPLC chromatogram of fermentation products from different strains

比較Compound I與多殺菌素 A和D的13C NMR和1H NMR數(shù)據(jù)，顯示compound I在鼠李糖3'-O位點(diǎn)上失去一個(gè)甲基，因此確定新合成的產(chǎn)物為多殺菌素J。結(jié)合HPLC-MS分析結(jié)果(圖7)，確認(rèn)SN1306發(fā)酵的主要產(chǎn)物為多殺菌素J(compound I)和L(compound II)。

3 討論

刺糖多孢菌基因操作困難，并且缺乏有效的基因敲除體系[16]。目前刺糖多孢菌中多通過插入失活方法獲得突變株[6,8,16]。本文結(jié)合黏粒文庫和λ-Red，建立了刺糖多孢菌的高效的基因敲除系統(tǒng)，測(cè)試對(duì)目標(biāo)基因tetR的敲除效率可達(dá)66%，結(jié)合文獻(xiàn)分析[11,15-16]，認(rèn)為敲除效率高的主要原因是黏粒上攜帶的長(zhǎng)同兩側(cè)源臂，其可以大幅增加重組效率。本實(shí)驗(yàn)室后續(xù)的測(cè)試表明，3kb以上的同源臂可以實(shí)現(xiàn)在刺糖多孢菌中目標(biāo)基因敲除(數(shù)據(jù)未顯示)。

多殺菌素生物合成基因簇中spnJKL在同一個(gè)操縱子內(nèi)，spnK的插入失活導(dǎo)致菌株檢測(cè)不到產(chǎn)生多殺菌素類似物，可能由于插入產(chǎn)生的極性效應(yīng)[5]，因此要獲得spnK失活不影響下游基因轉(zhuǎn)錄，需要采用閱讀框內(nèi)敲除策略。本文通過比較分析spnK基因編碼氨基酸序列，選取保守活性結(jié)構(gòu)域的編碼序列(123bp)作為靶標(biāo)，借助λ-Red和FLP重組構(gòu)建了讀框內(nèi)失活spnk載體，獲得的spnK突變株可產(chǎn)生乙基多殺菌素前體多殺菌素J和L，其發(fā)酵產(chǎn)量同出發(fā)菌株相近。因此利用該策略可以定向改造任何多殺菌素高產(chǎn)菌株，獲得高產(chǎn)多殺菌素J和L的工程菌株。

表3 SN1306產(chǎn)生的compound I的13C-NMR和1H-NMR數(shù)據(jù)Tab. 3 The 13C-NMR和1H-NMR data of compound I produced by strain SN1306

圖7 菌株SN1306發(fā)酵代謝產(chǎn)物HPLC-MS圖Fig.7 HPLC-MS chromatogram of metabolites from strain SN1306