胡晨駿，何 菊，謝佳東，房裴裴，丁有偉，胡孔法，冒宇清

（南京中醫(yī)藥大學(xué)信息技術(shù)學(xué)院 南京 210023）

半枝蓮（Scutellaria babarta D.Don），別名，狹葉韓信草，牙刷草等，其名最早見(jiàn)于《外科正宗》，為唇形科植物半枝蓮的全草，其味辛、苦，性寒，歸肺、肝腎經(jīng)，有清熱解毒、散瘀止血、利尿消腫的功能，是一種常用中藥[1]。利用高效液相色譜法分析不同產(chǎn)地半枝蓮天然化合物成分，共鑒別出100多種天然化合物，主要是黃酮類、二萜類天然化合物成分（表1），其中野黃芩苷含量最高[2，3]。

中醫(yī)臨床上半枝蓮是中醫(yī)組方重要成分，用于各類癌癥治療，如肝癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、乳腺癌和肺癌[4]?，F(xiàn)代藥理學(xué)發(fā)現(xiàn)半枝蓮天然化合物有抗腫瘤、增強(qiáng)免疫、抗病原微生物、平喘祛痰、利尿、解熱等藥理活性[5]。研究發(fā)現(xiàn)半枝蓮天然化合物成分能調(diào)節(jié)某些基因表達(dá)，如 AHSA1、BCL2L1、CASP3[6]、PRKCG[7]和 TYR[8]。但是目前對(duì)半枝蓮研究仍然停留在比較基礎(chǔ)的層面，臨床上仍然以半枝蓮復(fù)方制劑為主，為了更好發(fā)揮半枝蓮藥用價(jià)值，有必要對(duì)其進(jìn)行更深入的研究，闡明半枝蓮抗腫瘤活性部位，并且從分子水平研究半枝蓮藥理活性[9]。

本文采用Herb-Prince復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)算法，基于半枝蓮天然化合物和系統(tǒng)生物學(xué)數(shù)據(jù)，通過(guò)算法推導(dǎo)與半枝蓮潛在相關(guān)的人類基因、基因族以及KEGG信號(hào)通路，從系統(tǒng)生物學(xué)特別是基因組學(xué)角度挖掘其作用機(jī)制，為中醫(yī)藥研究人員從分子水平研究半枝蓮藥理活性提供決策支持。首先，從HIT數(shù)據(jù)庫(kù)[10]中抽取中藥、天然化合物、靶點(diǎn)基因的信息，準(zhǔn)備半枝蓮和靶點(diǎn)基因先驗(yàn)數(shù)據(jù)；然后，基于StringDB數(shù)據(jù)庫(kù)[11]中的人類（Homo Sapiens）蛋白質(zhì)交互網(wǎng)絡(luò)（PPIs）信息，通過(guò) Herb-Prince算法計(jì)算半枝蓮與各個(gè)蛋白質(zhì)節(jié)點(diǎn)關(guān)聯(lián)系數(shù)；最后，選取Top 100基因進(jìn)行富集分析，挖掘半枝蓮與潛在關(guān)聯(lián)的基因族以及Top 10 KEGG信號(hào)通路。檢索半枝蓮臨床與藥理學(xué)研究文獻(xiàn)，驗(yàn)證挖掘得到的基因族和KEGG信號(hào)通路信息的有效性，如果半枝蓮是組方成分或半枝蓮提取物能作用于信號(hào)通路或相關(guān)生物學(xué)過(guò)程，則認(rèn)定該挖掘結(jié)果準(zhǔn)確。

1 研究方法

1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源

半枝蓮中天然化合物以及系統(tǒng)生物學(xué)數(shù)據(jù)主要來(lái)源于HIT、StringDB、DrugBank。其中天然化合物成分和靶點(diǎn)基因的信息從HIT中抽取，因?yàn)镠IT數(shù)據(jù)是經(jīng)過(guò)人工核驗(yàn)的PubMed文獻(xiàn)信息，其靶點(diǎn)基因信息源于DrugBank[12]，并人工核驗(yàn)確保數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性。因?yàn)閺?fù)雜網(wǎng)絡(luò)算法準(zhǔn)確性直接依賴基礎(chǔ)數(shù)據(jù)的質(zhì)量，而StringDB整合了多個(gè)系統(tǒng)生物學(xué)數(shù)據(jù)源和文獻(xiàn)信息，數(shù)據(jù)全面并且質(zhì)量高，所以本文PPIs蛋白質(zhì)交互網(wǎng)絡(luò)信息從StringDB中抽取，選擇物種為人類。本文抽取人類PPIs蛋白質(zhì)交互網(wǎng)絡(luò)中有17390個(gè)蛋白質(zhì)節(jié)點(diǎn)，并且每個(gè)蛋白質(zhì)節(jié)點(diǎn)有相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)基因名?；诟嗟牡鞍踪|(zhì)節(jié)點(diǎn)數(shù)，可以更全面地挖掘與半枝蓮相關(guān)的系統(tǒng)生物學(xué)信息，以下為數(shù)據(jù)來(lái)源信息（表2）。

1.2 復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)算法

Prince是以色列科學(xué)家Oron Vanunu設(shè)計(jì)的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)關(guān)聯(lián)分析算法，最初用于分析基因和疾病表型的關(guān)系[13]。通過(guò)整合中藥、天然化合物以及靶點(diǎn)基因信息，也可以將該算法用于中藥和基因的關(guān)系分析，本文基于Prince算法實(shí)現(xiàn)了Herb-Prince復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)算法，計(jì)算中藥和基因關(guān)聯(lián)系數(shù)。算法輸入?yún)?shù)為半枝蓮、靶點(diǎn)基因以及人類PPIs蛋白質(zhì)交互網(wǎng)絡(luò)，算法在人類PPIs蛋白質(zhì)交互網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行迭代計(jì)算，通過(guò)蛋白質(zhì)節(jié)點(diǎn)間關(guān)系權(quán)重，計(jì)算半枝蓮與蛋白質(zhì)節(jié)點(diǎn)關(guān)聯(lián)系數(shù)，從而在網(wǎng)絡(luò)全局評(píng)估半枝蓮和每個(gè)節(jié)點(diǎn)的關(guān)聯(lián)強(qiáng)度。半枝蓮與每個(gè)節(jié)點(diǎn)的關(guān)聯(lián)系數(shù)用向量F表示，F(xiàn)的計(jì)算公式如下：

表1 半枝蓮主要天然化合物成分

表2 數(shù)據(jù)來(lái)源信息

1.3 基因族和KEGG信號(hào)通路分析

為了更加深入的理解半枝蓮藥理作用，本文通過(guò)基因族和KEGG信號(hào)通路進(jìn)行富集分析。Prince算法選擇關(guān)聯(lián)系數(shù)最高的Top 100基因進(jìn)行分析和驗(yàn)證，本文采用相同的策略。首先，通過(guò)HGNC人類基因組數(shù)據(jù)庫(kù)平臺(tái)進(jìn)行基因族分類[14]，HGNC平臺(tái)采用樹(shù)結(jié)構(gòu)來(lái)劃分基因族，為每個(gè)基因族定義“根”符號(hào)，采用分級(jí)編號(hào)來(lái)區(qū)分子成員，如Caspases基因族，CASP是根符號(hào)，CASP1、CASP2、CASP3等成員為葉子節(jié)點(diǎn)。因?yàn)榫哂邢嗨坪塑账峄虻鞍踪|(zhì)序列的基因被歸為同一基因族，所以基因族成員一般在生化功能上具有相似性，分析關(guān)聯(lián)基因族能預(yù)測(cè)半枝蓮潛在作用的生物學(xué)過(guò)程。然后，通過(guò)KEGG信號(hào)通路分析平臺(tái)，獲得半枝蓮關(guān)聯(lián)信號(hào)通路信息，KEGG是日本京都大學(xué)建立了生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)[15]，將基因與細(xì)胞、物種和系統(tǒng)生物學(xué)功能關(guān)聯(lián)起來(lái)，其中Pathway數(shù)據(jù)庫(kù)整合了各種分子互動(dòng)網(wǎng)絡(luò)信息，如細(xì)胞過(guò)程、新陳代謝、人類疾病、生物體系統(tǒng)等分子互動(dòng)網(wǎng)絡(luò)，能全面地展示細(xì)胞和生物所包含的系統(tǒng)生物學(xué)信息，基于KEGG Pathway數(shù)據(jù)庫(kù)，可以挖掘半枝蓮潛在作用的人類分子互動(dòng)網(wǎng)絡(luò)，為從分子水平分析半枝蓮的藥理活性提供線索。

2 研究結(jié)果

2.1 Herb-Prince算法結(jié)果

圖1 關(guān)聯(lián)系數(shù)百分位數(shù)分布情況

半枝蓮先驗(yàn)靶點(diǎn)基因是AHSA1、BCL2L1、CASP3、PRKCG和TYR，基于這些先驗(yàn)信息設(shè)置初始向量F，通過(guò)Herb-Prince算法進(jìn)行計(jì)算，對(duì)計(jì)算結(jié)果進(jìn)行分析，半枝蓮與各蛋白質(zhì)節(jié)點(diǎn)的關(guān)聯(lián)系數(shù)取值范圍在[3.00E-06，4.07E-03]之間，均值為3.68E-04，篩選Top 100基因的閾值為1.655E-03（圖1）。

對(duì)蛋白質(zhì)節(jié)點(diǎn)關(guān)聯(lián)系數(shù)降序排序，并將其轉(zhuǎn)換為標(biāo)準(zhǔn)基因名，得到Top 100基因（表3）。

2.2 基因族分析結(jié)果

通過(guò)HGNC分析有四個(gè)基因族被識(shí)別，每個(gè)基因族包含至少四個(gè)Top 100基因。四個(gè)基因族分別是Caspases、BIRC（Baculoviral IAP repeat containing）、TTC（Tetratricopeptide repeatdomain containing） 、PPI（Cyclophilin peptidylprolyl isomerases）（表4）。

由這四個(gè)基因族成員與6個(gè)先驗(yàn)靶點(diǎn)基因在StringDB人類蛋白質(zhì)交互網(wǎng)絡(luò)中的相關(guān)性可知（圖2），Caspases和BIRC基因族主要和BCL2L1和CASP3基因相關(guān)，基因AHSA1主要與TTC和PPI基因族相關(guān)。

Caspases基因族是一種半胱氨酸蛋白酶家族，在細(xì)胞凋亡、壞死和炎癥中起著至關(guān)重要的作用[16]。BIRC基因族在細(xì)胞凋亡、細(xì)胞因子生成和染色體隔離中都有作用。TTC基因族所表達(dá)的TPRs的蛋白質(zhì)涉及到多種的生物過(guò)程，如細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)錄控制、線粒體和過(guò)氧化物酶蛋白傳輸、神經(jīng)發(fā)生和蛋白質(zhì)折疊。PPI基因族蛋白能與免疫抑制藥物環(huán)孢霉素綁定。如PPID蛋白能與環(huán)孢霉素結(jié)合，形成環(huán)孢霉素與蛋白復(fù)合體，以鈣調(diào)磷酸酶為靶點(diǎn)抑制T細(xì)胞信號(hào)通路。研究表明半枝蓮?fù)ㄟ^(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡達(dá)到抗腫瘤的作用[17，18]，而 Caspases和 BIRC 基因族都在細(xì)胞凋亡中起到了重要作用；同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)半枝蓮總黃酮能影響兩種腫瘤細(xì)胞線粒體[18，19]，TTC基因族成員基因和線粒體生物過(guò)程相關(guān)。未見(jiàn)直接文獻(xiàn)證實(shí)半枝蓮能調(diào)節(jié)PPI基因族成員，但有研究發(fā)現(xiàn)PPID基因是BCL2基因的協(xié)作者，可協(xié)同發(fā)揮凋亡作用[20]，已有研究表明半枝蓮能調(diào)節(jié)BCL2基因表達(dá)[17]，提示可以研究半枝蓮對(duì)PPID基因族的調(diào)節(jié)作用。

在以改善生存條件和促進(jìn)轉(zhuǎn)型發(fā)展為特征的一系列試點(diǎn)示范基礎(chǔ)上,隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)社會(huì)發(fā)展和社會(huì)福利改進(jìn)需求的調(diào)整,我國(guó)可持續(xù)城市建設(shè)逐漸從關(guān)注生存環(huán)境、經(jīng)濟(jì)轉(zhuǎn)型發(fā)展等議題向關(guān)注社會(huì)的公平、人的發(fā)展公平以及社會(huì)與環(huán)境的協(xié)同發(fā)展方向轉(zhuǎn)型,可持續(xù)城市關(guān)注的議題更加綜合，更注重人與社會(huì)、人與自然、社會(huì)與自然的協(xié)調(diào)發(fā)展。

表3 半枝蓮關(guān)聯(lián)Top 100基因

2.3 信號(hào)通路分析結(jié)果

通過(guò)KEGG平臺(tái)，挖掘先驗(yàn)靶點(diǎn)基因信息和Top 100基因可能調(diào)節(jié)的信號(hào)通路，依據(jù)信號(hào)通路中關(guān)聯(lián)的基因數(shù)目篩選出半枝蓮Top 10信號(hào)通路（表5）。

2.3.1 Apoptosis信號(hào)通路

細(xì)胞凋亡是指為維持細(xì)胞的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主的有序的死亡。研究發(fā)現(xiàn)從半枝蓮中提取的野黃芩素，可以誘導(dǎo)人類結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116凋亡，野黃芩素可以提高細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)出，提升HCT116細(xì)胞的CASP3基因活性，同時(shí)下調(diào)BCL2基因表達(dá)，并提高BAX基因表達(dá)水平[17]，CASP3基因是Apoptosis信號(hào)通路中的關(guān)鍵基因。研究者發(fā)現(xiàn)半枝蓮醇提物通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體、Caspases和MAPK相關(guān)信號(hào)通路誘導(dǎo)人類胃腺癌細(xì)胞凋亡[18]。

表4 基因族信息

圖2 StringDB中先驗(yàn)靶點(diǎn)基因與基因族成員之間的相關(guān)性

表5 Top 10 KEGG信號(hào)通路

2.3.2 Pathways in cancer信號(hào)通路

該信號(hào)通路整合了與癌癥有關(guān)的信號(hào)通路，如粘附、凋亡、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、線粒體等信號(hào)通路，并包括信號(hào)通路之間交互作用。而半枝蓮能抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制血管生成、增加機(jī)體免疫力、抗氧化、逆轉(zhuǎn)耐藥細(xì)胞株耐藥性、抑制端粒酶活性[4]。中醫(yī)臨床半枝蓮是一味治療各類癌癥重要藥材，常用于治療肝癌、肺癌、乳腺癌等多種癌癥。本課題組在研究國(guó)醫(yī)大師周仲英肺癌治療臨床醫(yī)案數(shù)據(jù)時(shí)，發(fā)現(xiàn)在2267例病案中半枝蓮出現(xiàn)1203次，占比45.1%；在所有病案中包含病機(jī)描述的有1090例，第一位病機(jī)為痰瘀郁肺的病案共有199例，半枝蓮出現(xiàn)161次，占比80-90%。還有研究者分析半枝蓮對(duì)不同腫瘤細(xì)胞的作用機(jī)制和抑制效果，如HCT-116[17]、MDAMB-231[21]、A549[22]、H460[22]、CL1-5[23]等腫瘤細(xì)胞。

2.3.3 Hepatitis B信號(hào)通路

半枝蓮歸肝經(jīng)，半枝蓮可用于治療乙肝以及由慢性乙肝引發(fā)的肝癌[24]。半枝蓮在治療慢性乙肝中醫(yī)處方中出現(xiàn)的頻次很高，因?yàn)槠溆星鍩峤舛镜墓π?。夏先福在臨床上用復(fù)方半蓮飲治療乙型肝炎50例，總有效率96%[25]。解長(zhǎng)發(fā)運(yùn)用中西醫(yī)結(jié)合治療乙肝105例，在中醫(yī)辨證時(shí)將病人分為濕熱型、脾虛型、脾虛肝郁型、脾腎虧虛型、肝腎陰虛型五種，其中前四種病人類型，在用藥方案中都有半枝蓮，因?yàn)榘胫ι徦幱霉πВ?duì)乙肝病毒有抑制作用[26]。藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)半枝蓮醇提液對(duì)Hep G 2.2.15細(xì)胞HBsAg、HBeAg表達(dá)有抑制作用，具有一定的抗乙肝病毒作用[27]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)九種半枝蓮天然化合物野黃芩苷、黃芩苷、檞皮素、黃芩黃素和漢黃芩素具有明顯的抗乙肝病毒作用[28]。并且半枝蓮總黃酮可誘導(dǎo)人類肝癌細(xì)胞MHCC97-H凋亡[19]。

2.3.4 PI3K-AKT信號(hào)通路

該信號(hào)通路在癌癥發(fā)展過(guò)程中起著非常重要，研究人員一直希望通過(guò)該信號(hào)通路尋求癌癥藥物治療新靶點(diǎn)。有研究發(fā)現(xiàn)半枝蓮可以抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT-8的遷移和入侵，作用信號(hào)通路有PI3K-AKT信號(hào)通路[29]。半枝蓮總黃酮具有抑制小鼠體內(nèi)黑色素瘤生長(zhǎng)的作用，抑制PI3K-AKT和mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬及凋亡[30]。

2.3.5 P53信號(hào)通路

P53信號(hào)通路在細(xì)胞DNA受到損傷時(shí)，P53信號(hào)通路能觸發(fā)細(xì)胞凋亡或修復(fù)。從半枝蓮中提取的野黃芩苷能通過(guò)P53信號(hào)通路抑制人類結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡[31]。半枝蓮醇提取物通過(guò)調(diào)節(jié)P53和AKT信號(hào)通路，抑制人類結(jié)腸癌細(xì)胞株增殖[32]。半枝蓮對(duì)表皮生長(zhǎng)因子受體和P53信號(hào)通路的定向調(diào)控抑制非小細(xì)胞肺癌的生長(zhǎng)[33]。半枝蓮多糖上調(diào)抑癌基因P53（TP53）以抑制胃癌細(xì)胞SGC-7901的生長(zhǎng)活性[34]。

2.3.6 Focal adhesion信號(hào)通路

粘著斑激酶信號(hào)通路能影響細(xì)胞外基質(zhì)粘附[35]。研究者發(fā)現(xiàn)半枝蓮對(duì)人肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞黏附產(chǎn)生影響，通過(guò)MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞黏附情況，結(jié)果顯示半枝蓮組與空白組相比，半枝蓮組HepG2細(xì)胞黏附受到顯著抑制[36]。半枝蓮總黃酮可能通過(guò)改善細(xì)胞膜流動(dòng)性，維持細(xì)胞膜的正常功能來(lái)發(fā)揮抗病毒感染作用[37]。在《中國(guó)藥典》中收錄的中醫(yī)名方養(yǎng)正消積方[38]，半枝蓮是組方中16味中藥之一，研究發(fā)現(xiàn)該方提取物DEM25能抑制FAK基因相關(guān)信號(hào)通路的磷酸化，影響腫瘤細(xì)胞和間皮細(xì)胞之間的粘連以及腫瘤細(xì)胞遷移，對(duì)腹膜轉(zhuǎn)移有抑制作用[39]。

2.3.7 InfluenzaA信號(hào)通路

Influenza A信號(hào)通路是與甲型H1N1流感相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)半枝蓮總黃酮對(duì)甲型H1N1流感病毒所致的小鼠感染及其導(dǎo)致的死亡表現(xiàn)了一定的治療或拮抗作用，并且其藥效表現(xiàn)了劑量相關(guān)特征[40]。相關(guān)研究提示半枝蓮總黃酮抗甲型H1N1流感病毒作用，可能與半枝蓮黃酮類成分抑制病毒對(duì)宿主細(xì)胞的吸附、抑制病毒復(fù)制早期階段病毒顆粒與細(xì)胞內(nèi)涵體/溶酶體的融合，促進(jìn)吸附病毒宿主細(xì)胞膜流動(dòng)性恢復(fù)，維持細(xì)胞膜正常功能有關(guān)[40]。有專利申明半枝蓮總黃酮成分芹菜素，經(jīng)體外細(xì)胞模型和體內(nèi)動(dòng)物模型試驗(yàn)，具有很強(qiáng)抗流感病毒活性[41]。更早期研究發(fā)現(xiàn)芹菜素能抑制受感染細(xì)胞中流感病毒A/PR/8/34[42]。

2.3.8 其它信號(hào)通路

Amyotrophic lateral sclerosis信號(hào)通路，沒(méi)有直接臨床和藥理研究表明半枝蓮能調(diào)節(jié)該信號(hào)通路或相關(guān)疾病，但半枝蓮總黃酮對(duì)其它神經(jīng)退行性疾病有一定的作用，如阿爾茨海默病（Alzheimer's Disease，AD），利用腦室注射Aβ25-35聯(lián)合三氯化鋁和RHTGF-β1建立擬AD大鼠模型，引起大鼠神經(jīng)細(xì)胞線粒體凋亡通路中BCL2、BAX和CASP3基因異常表達(dá)，而半枝蓮總黃酮三個(gè)劑量能不同程度地逆轉(zhuǎn)復(fù)合Aβ25-35所致大鼠神經(jīng)細(xì)胞異常改變，抑制細(xì)胞外β-淀粉樣蛋白（betaamyloids protein）沉積形成的老年斑（senile plaque）、抑制細(xì)胞內(nèi)蛋白過(guò)度磷酸化形成的大量神經(jīng)纖維纏結(jié)[43]。

Tuberculosis信號(hào)通路，有研究分析天然化合物對(duì)結(jié)核桿菌的抑制作用，發(fā)現(xiàn)12種天然化合物對(duì)結(jié)核桿菌的蛋白酶活性抑制率超過(guò)65%，其中有10種天然化合物屬黃酮類，包括半枝蓮中含有的黃芩黃素（抑制率84.03%）、黃芩苷（抑制率78.47%）[44]。

Toxoplasmosis信號(hào)通路，研究者分析了近30年天然化合物的抗弓形蟲(chóng)能力，期望發(fā)現(xiàn)新的天然化合物用于治療弓形蟲(chóng)感染，發(fā)現(xiàn)從黃芩中提取的黃芩黃素有很好的抗弓形蟲(chóng)的特點(diǎn)，基于植物學(xué)分類方法半枝蓮歸于黃芩屬，同樣包含這種天然化合物[45]。有研究發(fā)現(xiàn)在體外實(shí)驗(yàn)中純黃芩黃素能抑制弓形蟲(chóng)的生長(zhǎng)繁殖效果最好，中藥黃芩乙醇提取物效果次之[46]。

Small cell lung cancer信號(hào)通路，未發(fā)現(xiàn)有研究文獻(xiàn)提示半枝蓮調(diào)節(jié)該信號(hào)通路。中醫(yī)對(duì)疾病診斷有獨(dú)特的理論體系，并未采用西醫(yī)的方法對(duì)肺癌進(jìn)行分類，半枝蓮是中醫(yī)肺癌治療的重要藥物，除周老在肺癌臨床組方中使用半枝蓮?fù)?，以廣東省中醫(yī)院劉偉勝教授在一年內(nèi)門(mén)診接診的肺癌病例為研究對(duì)象，納入患者290例，并錄入290件病案處方，共有中藥148味，發(fā)現(xiàn)使用頻次最高的為半枝蓮（267次）[47]。有研究者通過(guò)藥理學(xué)方法分析半枝蓮對(duì)人肺巨細(xì)胞癌細(xì)胞株P(guān)G細(xì)胞BCL2基因表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)經(jīng)半枝蓮含藥血清處理后PG細(xì)胞BCL2基因表達(dá)明顯降低[48]。

3 討論

依據(jù)本文的文獻(xiàn)驗(yàn)證方法，采用復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)方法篩選出的KEGG信號(hào)通路，通過(guò)已有的臨床或藥理學(xué)研究進(jìn)行驗(yàn)證，10個(gè)KEGG信號(hào)通路有7個(gè)信號(hào)通路，有文獻(xiàn)證實(shí)半枝蓮或半枝蓮提取物能作用于信號(hào)通路或相應(yīng)的生物學(xué)過(guò)程。其它信號(hào)通路雖然沒(méi)有直接文獻(xiàn)證實(shí)，但是也有文獻(xiàn)說(shuō)明半枝蓮或天然化合物成分與這些信號(hào)通路或生物學(xué)過(guò)程有一定的相關(guān)性，提示半枝蓮潛在的藥理作用，對(duì)基因族的分析也獲得了相近的結(jié)論，篩選出的系統(tǒng)生物學(xué)信息能為中醫(yī)藥科研人員研究半枝蓮的作用機(jī)制提示潛在的方向。

在Top 100基因中，經(jīng)過(guò)現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，這些基因或相關(guān)蛋白的表達(dá)可以被半枝蓮或提取物所調(diào)節(jié)，如TP53、BID、BAX、BCL2[49]、CASP9[18]、XIAP[50]。但是很多基因沒(méi)有直接的研究文獻(xiàn)提示半枝蓮或其提取物可能調(diào)節(jié)基因或相關(guān)蛋白的表達(dá)，如SPATA25基因是Top 1基因，SPATA25是精子形成相關(guān)基因，該基因在阻塞性無(wú)精子癥患者表達(dá)低于正常人群。中醫(yī)臨床用清毒消炎益腎湯對(duì)治療男性生殖道炎癥性不育癥300例取得了良好的效果，其基本方中包含半枝蓮[51]。用含半枝蓮的清精湯治療精漿AsAb陽(yáng)性的免疫性不育患者，消除病因時(shí)能迅速改善精子發(fā)生的微環(huán)境，消除AsAb，消除精子凝集，較好地改善精子的各項(xiàng)參數(shù)，提高妊娠率[52]。雖然半枝蓮被用于治療炎癥性不育和免疫性不育，但是其機(jī)理未被進(jìn)一步的闡釋。通過(guò)本文挖掘的系統(tǒng)生物學(xué)信息，提示研究人員從相關(guān)基因、基因族和信號(hào)通路分析半枝蓮對(duì)應(yīng)的藥理活性機(jī)制。

在Top 100基因中有10個(gè)基因與Focal adhesion信號(hào)通路相關(guān)，其中PRKCB基因是鈣激活的，依賴于磷脂和二酰基甘油的絲氨酸/蘇氨酸蛋白質(zhì)激酶，能對(duì)多種生物過(guò)程磷酸化水平有影響[53]。現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)半枝蓮能抑制人肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞黏附性，并且含半枝蓮中醫(yī)名方能對(duì)FAK基因相關(guān)信號(hào)通路的磷酸化產(chǎn)生影響，結(jié)合已有研究和本文挖掘的信息可以推測(cè)半枝蓮能調(diào)節(jié)Focal adhesion信號(hào)通路中的PKC、SRC等節(jié)點(diǎn)（圖3）。

4 結(jié)論

本文利用復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)方法，預(yù)測(cè)了與半枝蓮潛在關(guān)聯(lián)的基因，對(duì)相關(guān)基因家族和KEGG信號(hào)通路進(jìn)行了富集分析，從系統(tǒng)生物學(xué)角度挖掘半枝蓮潛在作用機(jī)制，并通過(guò)文獻(xiàn)研究驗(yàn)證分析結(jié)果?；谳^少的先驗(yàn)信息，本文所預(yù)測(cè)相關(guān)系統(tǒng)生物學(xué)信息與半枝蓮在中醫(yī)臨床運(yùn)用和現(xiàn)代藥理研究高度一致，為進(jìn)一步研究半枝蓮的作用機(jī)制提供幫助。

圖3 Focal adhesion信號(hào)通路