王立群

1 免疫細胞腫瘤治療的歷史

在癌癥發(fā)生率和死亡率不斷上升的當今社會，人類對有效抗腫瘤治療手段的研發(fā)和臨床應(yīng)用顯得至關(guān)重要和迫切。從早期的手術(shù)、放療和化療到近代的靶向藥物的問世，已明顯地延長了癌癥患者的生存期，人類的抗癌戰(zhàn)爭有望轉(zhuǎn)入慢性病管理模式。但顯而易見，我們更期望的是腫瘤能夠被治愈。

為什么我們大多數(shù)人不得癌癥？其中一個重要原因是我們有健全的免疫系統(tǒng)，它時刻監(jiān)測著腫瘤細胞的發(fā)生并及時予以清除。一旦免疫功能出了問題，就無法及時識別并消除腫瘤細胞。如果能重新喚醒癌癥患者的免疫系統(tǒng)，那么能否使治愈腫瘤變得可能？我們知道，免疫防御功能依賴于人體固有免疫（innate immunity，或稱為非特異性免疫）和獲得性免疫（adaptive immunity，或稱為特異性免疫）。固有免疫作用范圍廣，不針對性地識別特定抗原，免疫反應(yīng)起效快，參與的免疫細胞種類較多，有吞噬細胞（包括巨噬細胞和中性粒細胞）及自然殺傷NK細胞等。而獲得性免疫主要通過各種淋巴細胞起到效果，其中B淋巴細胞行使體液免疫作用，T淋巴細胞行使細胞免疫作用。獲得性免疫能夠識別特異的抗原，且對相應(yīng)抗原形成免疫記憶效果，起到免疫監(jiān)測作用。在獲得性免疫過程中，對腫瘤細胞的免疫監(jiān)測和清除工作主要由 T淋巴細胞承擔。

在對腫瘤免疫細胞治療的探索中，人們自然把目光集中到了T淋巴細胞上。早期臨床觀察和動物實驗顯示，腫瘤由于其表達特異性抗原會激發(fā)獲得性免疫反應(yīng)。起始于1950，在之后的20年有許多實驗證明，從荷瘤小鼠獲取的T淋巴細胞，再將其輸注到同系的小鼠體內(nèi)可有效地清除移植瘤。這就啟發(fā)了過繼細胞（adoptive cell transfer，ACT）治療腫瘤的思路，即從癌癥患者的外周血中獲取免疫細胞，借助于細胞因子的刺激作用，經(jīng)體外培養(yǎng)擴增后回輸給原患者。這種方法在1984年開始用于臨床探索性研究中，當時這種技術(shù)手段被命名為淋巴因子激活的殺傷細胞（lymphokine-activated killer cells，LAK）療法。隨后，又有細胞因子誘導的殺傷細胞（cytokineinduced killer，CIK）方法以及加強型的樹突狀細胞和淋巴細胞混合培養(yǎng)和回輸（DC-CIK）問世，進而有腫瘤浸潤淋巴細胞（tumor infiltrating lymphocytes，TIL）應(yīng)用于臨床進行嘗試。這些手段統(tǒng)稱為非特異性過繼細胞治療，由于這樣制備的細胞產(chǎn)品對腫瘤細胞的特異識別能力和殺傷能力不足，又沒有嚴謹?shù)呐R床試驗數(shù)據(jù)支持，其臨床應(yīng)用效果難以獲得準確評價，其前景有限。

在20世紀 80年代，科學界開始努力尋找更特異有效的腫瘤過繼性細胞治療方法。通過對T細胞功能的研究發(fā)現(xiàn)，T細胞需要同時識別目標細胞表面上兩個關(guān)鍵的分子才能發(fā)揮殺傷作用。第一是 T細胞表面的 T細胞受體結(jié)合腫瘤細胞表面的主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC）分子和特異性抗原形成的復合物；第二是T細胞表面的共刺激因子受體結(jié)合腫瘤細胞上的共刺激性配體。如果T細胞要實現(xiàn)對腫瘤細胞的殺傷作用，這兩個環(huán)節(jié)缺一不可。因此，腫瘤細胞有兩種方法可以避免被T細胞識別并殺傷，一是減少自身MHC的表達水平，二是表達能抑制T細胞功能的抑制性分子。由此可見，若對T細胞進行改造，使其可以識別腫瘤細胞表面的特定分子，而無需通過 T細胞受體（T cellreceptor，TCR）識別腫瘤細胞再通過MHC遞呈特異性抗原，T細胞不再必須通過天然的兩個步驟識別并殺傷腫瘤細胞，而能直接對腫瘤細胞發(fā)起攻擊?；诖讼敕?，科學家發(fā)明了一條全新的技術(shù)路線，即通過分子生物學手段，從基因水平來改造T細胞，一次性解決T細胞識別腫瘤細胞并激活其自身功能的問題。其方法是通過人工設(shè)計的全新的基因工程分子，即嵌合性抗原受體（chimeric antigen receptor，CAR），將編碼CAR分子的基因通過載體轉(zhuǎn)入T細胞，使T細胞表達CAR分子。CAR分子上類似于單克隆抗體的部分在T細胞外作為受體，用于識別腫瘤細胞的特異抗原；另一部分在T細胞之內(nèi)，可以在CAR分子的胞外段結(jié)合腫瘤細胞之后產(chǎn)生足夠的分子信號，刺激T細胞擴增并增強其殺傷能力，由此，CAR-T細胞技術(shù)便誕生了。

2 CAR-T技術(shù)的全球研發(fā)

CAR分子是一個融合蛋白，它的胞外片段是根據(jù)抗原篩選出的抗體序列所衍生的單鏈可變區(qū)（single chain variable fragment，scFv），而胞內(nèi)信號區(qū)能啟動T細胞激活信號和其他下游效應(yīng)。用scFv作為T細胞的人為受體來識別抗原的早期技術(shù)研發(fā)，是由以色列科學家Zelig Eshhar團隊在20世紀80年代末開啟的，進而在分子生物學和動物實驗中獲得了驗證。第一代CAR分子的結(jié)構(gòu)除了抗原識別區(qū)scFv外，只引入了CD3ζ鏈作為T細胞激活信號區(qū)（scFv-CD3ζ）。然而，這樣設(shè)計的CAR分子在臨床上僅表現(xiàn)出了有限的治療作用。第二代CAR分子的設(shè)計在第一代的基礎(chǔ)上又加入了T細胞受體的共刺激結(jié)構(gòu)域，其典型代表是CD28或4-1BB分子的細胞內(nèi)信號傳導區(qū)，形成 scFv-CD28-CD3ζ或 scFv-4-1BB-CD3ζ樣的第二代 CAR分子，可以極大地提高CAR-T細胞在人體內(nèi)的存活、增殖以及腫瘤殺傷能力。

具體應(yīng)該選擇什么樣的抗原來做CAR-T的概念驗證呢？B系急性淋巴細胞白血病和淋巴系統(tǒng)腫瘤是由 B細胞惡性增殖造成的，表面都帶有B細胞的特異性蛋白CD19，該蛋白不在其他任何非B系的細胞中表達。這使得CD19成為了比較理想的驗證靶點。

美國國立癌癥研究所的羅森伯格（Steven Rosenberg）教授是一位對CAR-T技術(shù)或者說對整個免疫細胞腫瘤治療領(lǐng)域作出巨大貢獻的臨床科學家，目前已是近80歲高齡。他的科研生涯就是一部腫瘤免疫的發(fā)展史，從最早的白介素-2（interleukin-2，IL-2）刺激患者自身的免疫細胞、腫瘤浸潤淋巴細胞法（tumor infiltrating lymphocytes，TIL）到最新的癌癥疫苗都有所涉及。前面提到過的以色列科學家ZeligEshhar設(shè)計了最早版本的CAR分子，因此受到羅森伯格教授的邀請，于1989年前往他的實驗室進行訪問研究，而羅森伯格教授也由此得以與CAR-T技術(shù)結(jié)緣。 2010年，羅森伯格教授首先在《Blood》雜志報道了1例接受CAR-T治療的病例。該患者雖然沒能最終獲得痊愈，但在接受了CAR-T細胞治療后他的淋巴瘤確實縮小了，并得到了緩解效果。

真正的突破來自于 1年后美國賓夕法尼亞大學的朱恩（Carl June）教授發(fā)表在《新英格蘭醫(yī)學》和《Sci Transl Med》雜志上的臨床試驗結(jié)果。他先后報道了3例接受CAR-T治療的病例，其中2例獲得了完全緩解。這極大地鼓舞了從事癌癥研究的科學家，因為獲得完全緩解進而治愈患者是無數(shù)癌癥研究人員和患者的終極夢想。朱恩教授涉足CAR-T領(lǐng)域起源于2003年，他與位于孟菲斯的St. Jude兒童醫(yī)院的坎帕納（Campana）教授在一次會議上相識并建立了聯(lián)系。經(jīng)協(xié)商，朱恩教授和坎帕納教授所在的學院間簽署了樣品轉(zhuǎn)移協(xié)議（MTA），由坎帕納教授提供能編碼 anti-CD19 CAR的質(zhì)粒載體（antiCD19scFv-4-1BBCD3ζ）給賓大。朱恩教授和萊文教授（BruceLevine）首先在小鼠身上測試了這種第二代CAR-T技術(shù)的可行性，在得到肯定的結(jié)果后，于2010年初，他們挑選了3名經(jīng)過其他療法治療無效的晚期慢性淋巴細胞白血病（chronic lymphocytic leukemia，CLL）患者進行臨床試驗，獲得了前面所提到的令人振奮的結(jié)果。

第一個接受試驗的是William Ludwig，有近10年的CLL病史，2010年8月接受了CAR-T細胞的治療。在CAR-T細胞注射10天后，出現(xiàn)了一系列劇烈的不良反應(yīng)，包括發(fā)燒、低血壓、呼吸困難。后來研究者意識到這種不良作用是由改造后的 T細胞在體內(nèi)殺傷靶細胞后產(chǎn)生了過多的細胞因子引起的。幸運的是，William Ludwig最終還是戰(zhàn)勝了這些不良反應(yīng)，1個月后，他的身體里已經(jīng)檢測不到白血病細胞，并且在其后的6年間沒有復發(fā)，其他2名受試者身上也觀察到了令人欣喜的類似結(jié)果。

更有名的案例發(fā)生在2012年，1位名叫艾米莉·懷特海德（Emily Whitehead）的兒童急性淋巴細胞白血病（B-cell lymphoblastic leukemia，B-ALL）患者，在之前經(jīng)歷了多次標準治療而反復復發(fā)后，參加了當時在賓大進行的臨床試驗。使用了抗CD19的CAR-T治療后，艾米莉獲得了完全緩解狀態(tài)，迄今已6年多了，仍然保持了檢測不到白血病細胞的完全緩解，身體狀態(tài)很健康，可以被稱為臨床治愈，也成為CAR-T成功治療的代言人。

經(jīng)過這樣改造的CAR-T細胞具有良好的體內(nèi)持續(xù)擴增和殺傷能力。轉(zhuǎn)化研究顯示，改造的 T細胞可以在患者的血液和骨髓中增殖，然后衰竭。據(jù)估計，每個CAR-T細胞可以殺死1000至93000個腫瘤細胞。在初次注射 1個月之后，將后代細胞從患者體內(nèi)取出，發(fā)現(xiàn)這時候的T細胞依然可以在體外繼續(xù)殺傷靶細胞。一般情況下，CAR-T細胞在患者外周血內(nèi)可以持續(xù)存在3～6個月，足以殺死所有腫瘤細胞。藥代動力學研究證實，藥效與CAR-T細胞總量和持續(xù)性成正比，可以作為預后的一個初步判斷。

科學原理一旦被驗證，便可以被廣泛地重復和應(yīng)用。一時間，美國多個頂尖科研臨床機構(gòu)用抗CD19的CAR-T同時在B細胞白血病和淋巴瘤適應(yīng)癥上都得到了很好的臨床結(jié)果。至此，CAR-T細胞的早期臨床數(shù)據(jù)便已確立了它在治療血液瘤中的重要地位，也成了各家醫(yī)藥企業(yè)爭相開發(fā)和追逐的對象。

除靶向CD19分子外，近期靶向BCMA的CAR-T細胞用于臨床治療多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）也有很多成功的案例被報道。越來越多的針對新靶點的CAR分子也開始進入臨床試驗，包括CD22、CD20、ROR1、CD30、CD123、CD33、LeY、CD138等。

3 CAR-T的產(chǎn)業(yè)化道路和中國現(xiàn)狀

當CAR-T技術(shù)在探索性的臨床研究中展示出了在廣泛的臨床應(yīng)用中的美好前景時，制藥企業(yè)諾華（Novartis）公司便和朱恩教授于2015—2016年展開了合作，進行代號為CTL-019的針對復發(fā)或難治性兒童急性淋巴細胞白血病患者采用CAR-T細胞（靶向 CD19）進行治療的注冊臨床試驗。在諾華公司向FDA提交的63名受試者中進行的臨床試驗數(shù)據(jù)表明，共有52位（82.5%）患者獲得緩解，其中 40位（63%）患者達到了完全緩解（即檢測不到腫瘤細胞）。對于復發(fā)或難治性B-ALL患者來說，這是極高的緩解率和治療效果。因此，2017年8月30日，F(xiàn)DA批準了CTL019（商品名Kymriah）上市，成為全球首款CAR-T治療產(chǎn)品。

無獨有偶，美國 Kite公司也于2014年從美國國立癌癥研究中心羅森伯格教授處獲得了靶向 CD19的CAR-T（KTE-C19）技術(shù)的轉(zhuǎn)移和授權(quán)，開展了代號為Zuma-1的針對復發(fā)/難治性的彌漫性大B淋巴瘤（diffuse large B cell lymphoma，DLBCL）適應(yīng)癥的注冊臨床試驗。在 II期臨床入組并接受治療的 101位受試者中達到6個月的隨訪時，發(fā)現(xiàn)有82%的患者獲得客觀緩解，其中占總數(shù)52%的患者獲得了完全緩解。2018年Kite發(fā)布的Zuma-1試驗2年期隨訪數(shù)據(jù)顯示，仍有占總數(shù)39% 的患者保持緩解，其中37%的患者維持了完全緩解狀態(tài)。這意味著多數(shù)對CAR-T產(chǎn)生了有效反應(yīng)患者自接受治療 6個月獲得緩解后可以持續(xù)2年或更長的時間，這使人們再一次看到了通過CAR-T治愈淋巴瘤的曙光。這里需要強調(diào)的是這些參與Zuma-1試驗的受試者都是先前經(jīng)歷了所有標準治療而無效的患者。根據(jù)一項發(fā)表的權(quán)威回顧性研究（Scholar-1）顯示，復發(fā)/難治性的彌漫性大 B淋巴瘤患者末線治療的完全緩解率只有7%，中位生存期僅為6.3個月。緊隨Kymriah之后，KTE-C19（商品名Yescarta）于2017年10月27日毫無懸念地獲得 FDA批準用于治療復發(fā)/難治性的彌漫性大B淋巴瘤的上市許可。隨后，這二款世界上僅有的 CAR-T產(chǎn)品又同時于2018年8月23日獲歐盟藥監(jiān)機構(gòu)批準上市，可以進入歐盟各國市場。

在 2018年美國血液學會（American Society of Hematology，ASH）年會上，美國3家醫(yī)院的醫(yī)生報道了 Yescarta自 2017年10月18號被FDA批準上市后對超過400多位患者進行治療后的真實世界隨訪的數(shù)據(jù)，并與先前注冊臨床試驗（Zuma-1）數(shù)據(jù)進行了比較。雖然在真實的 Yescarta臨床應(yīng)用中，其患者接受標準比臨床試驗的受試者入組標準要寬泛得多，但 Yescarta的有效性、安全性以及細胞因子釋放針對綜合征的發(fā)生情況而言，其真實世界數(shù)據(jù)與臨床注冊試驗（Zuma-1）中的數(shù)據(jù)高度近似，有力地支持Yescarta在真實世界的更廣泛應(yīng)用。

當然，CAR-T療法也面臨著不少安全性挑戰(zhàn)，主要是因細胞因子釋放引起的一系列不良反應(yīng)。眾所周知，美國另一個曾經(jīng)領(lǐng)先全球的CAR-T公司——朱諾醫(yī)療（Juno）與紀念斯隆癌癥中心合作開發(fā)的JCAR-015（靶向CD19），由于在其II期臨床階段發(fā)生了 5位患者因腦水腫而死亡，朱諾醫(yī)療主動叫停了JCAR015的臨床研究；而轉(zhuǎn)向開發(fā)另一款針對同一靶點（CD19）但神經(jīng)毒性較小的產(chǎn)品（JCAR017）。遺憾的是，人們至今對CAR-T產(chǎn)生的細胞因子風暴和神經(jīng)毒性，進而導致患者死亡的確切機制仍然不清楚。但在臨床應(yīng)用中，研究者們已經(jīng)有了豐富的應(yīng)用糖皮質(zhì)激素和白介素-6受體（IL-6R）抑制劑—托珠單抗進行干預的經(jīng)驗，制定了可以有效地控制CAR-T因細胞因子釋放引起的安全風險的方案。

另一個阻礙CAR-T技術(shù)更廣泛進行臨床應(yīng)用的挑戰(zhàn)是按照相關(guān)的藥物監(jiān)管法規(guī)要求開發(fā)CAR-T細胞及相關(guān)重要原材料（如病毒載體）生產(chǎn)工藝，并完成嚴格的工藝驗證，以及開發(fā)并驗證相應(yīng)的質(zhì)控檢驗方案。由于CAR-T細胞是自體活細胞藥物，典型的制備過程包括采集患者的血細胞（主要是白細胞）；將血樣經(jīng)冷鏈運輸?shù)椒蠂栏竦臐崈粢蟮纳a(chǎn)設(shè)施進行 T細胞分離和活化；再使用病毒載體將CAR基因轉(zhuǎn)入 T細胞，并培養(yǎng)擴增以獲得足夠的CAR-T細胞。整個制備過程需要歷時 1至 2周，這個過程必須按GMP規(guī)范在超潔凈環(huán)境里進行連續(xù)操作；并且在生產(chǎn)過程中和終產(chǎn)品制備完成后還需要進行很多的質(zhì)控檢測。作為被從靜脈回輸?shù)交颊唧w內(nèi)的藥物，CAR-T制劑除了部分可以被現(xiàn)有藥典要求覆蓋的標準檢測外，還有大量的檢測方法都必須根據(jù)CAR-T產(chǎn)品和其工藝特點，通過質(zhì)量研究進行從頭開始的方法學開發(fā)和驗證。CAR-T細胞是自體細胞產(chǎn)品，也意味著每一個病人樣品都是一個獨立的生產(chǎn)批次，必須經(jīng)過全套質(zhì)檢流程。其中，無菌檢測需從終產(chǎn)品中取樣并培養(yǎng)7～14 d才可獲得數(shù)據(jù)，這使得終產(chǎn)品制劑完成后必須經(jīng)低溫冷凍后暫存，等待檢驗合格后才可以被放行，用于治療。這樣的活細胞生物制品對冷鏈運輸也提出了很高的要求，并需要高效即時的樣品鑒別和追溯系統(tǒng)。況且，由于產(chǎn)品生產(chǎn)周期較長，而且每個批次都會單獨占用生產(chǎn)車間或艙位，這樣CAR-T產(chǎn)品的生產(chǎn)效率和產(chǎn)能相對傳統(tǒng)藥物存在不足。

基于上述種種原因，諾華和凱特兩個獲批的自體CAR-T產(chǎn)品在獲批上市后商業(yè)化運營過程中都采取了與定點醫(yī)院合作的模式。只有經(jīng)過嚴格篩選及培訓的醫(yī)院才能被納入其CAR-T產(chǎn)品的臨床應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)。Yescarta和Kymriah關(guān)鍵的生產(chǎn)質(zhì)控工作都在諾華和凱特的中心化GMP基地完成。不可否認，這樣的自體CAR-T產(chǎn)品的生產(chǎn)和運營模式必然需要比較高的成本，也就導致Kymriah和Yescarta的價格相對比較貴（分別為47.5萬美元和37.3萬美元）。當然，在美國因為有發(fā)達的商業(yè)醫(yī)療保險可以來支付這些費用，而病人自付的比例有限，所以目前尚未發(fā)現(xiàn)明顯的經(jīng)濟負擔性問題。

CAR-T技術(shù)在臨床中展現(xiàn)的優(yōu)異療效，自然引起了中國的醫(yī)生、科研人員和企業(yè)極大的研究熱忱和興趣。一時間涌現(xiàn)了近百家 CAR-T企業(yè)和上百項在美國ClinicalTrial網(wǎng)站登記了的臨床研究項目，數(shù)量幾乎超過美國的類似項目。但必須清醒地看到，我國的CAR-T項目扎堆和模仿的現(xiàn)象比較嚴重，大多數(shù)都是針對CD19靶點，用于治療淋巴細胞白細胞和淋巴瘤的產(chǎn)品，而且這些項目是否具有自主的知識產(chǎn)權(quán)以及能否得到專利保護，尚有疑問。更何況，截止到2018年10月前，所有在中國開展的 CAR-T臨床項目，都是研究者發(fā)起的臨床研究，僅經(jīng)過了研究實施醫(yī)院的倫理委員會的審批，并沒有根據(jù)藥物監(jiān)管審批的路線嚴格地按照國際通行的GCP規(guī)范進行臨床數(shù)據(jù)的整理和審核，因此很難確認這類臨床研究對GMP/GCP規(guī)范的依從性和數(shù)據(jù)的真實性。

事實上，我國對免疫細胞治療技術(shù)的研發(fā)熱情并不落后于美國，早期以CIK、DC-CIK為主的免疫細胞治療技術(shù)在臨床上已有不少應(yīng)用。2016年發(fā)生的魏則西事件讓免疫細胞治療技術(shù)在國內(nèi)的發(fā)展受到了沉重的打擊。由于當時該行業(yè)中各企業(yè)技術(shù)和管理水平良莠不齊，而當時按照第三類醫(yī)療技術(shù)在各醫(yī)院僅進行備案的管理方式，在監(jiān)管層面有一定缺失，最終導致了免疫細胞治療行業(yè)發(fā)展不進則退，一度處于真空狀態(tài)。從這兩年全球免疫細胞治療行業(yè)的發(fā)展來看，行業(yè)健康、快速、規(guī)范的發(fā)展，需要政府的監(jiān)管和引導。而CAR-T產(chǎn)品作為新一代的免疫治療技術(shù)，在原理和臨床效果上與DC-CIK等早期的過繼細胞治療技術(shù)相比具有革命性的優(yōu)勢。因需要經(jīng)過體外基因工程改造，所以對CAR-T產(chǎn)品的質(zhì)量管控和臨床應(yīng)用提出了更高的要求。這奠定了CAR-T細胞產(chǎn)品必須按照藥品進行監(jiān)管和審批的要求，是CAR-T技術(shù)產(chǎn)業(yè)化的必經(jīng)之路。

中國食品藥品監(jiān)督管理總局于2017年12月發(fā)布了《細胞制品研究與評價技術(shù)指導原則》明確了CAR-T細胞治療產(chǎn)品的藥物屬性和監(jiān)管途徑，這與FDA和EMA將CAR-T列為按藥物進行審批上市的做法接軌。自該指導原則發(fā)布之日起，中國陸續(xù)有多家CAR-T細胞治療公司的產(chǎn)品按照生物藥品的路徑向國家食品藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心提出注冊臨床試驗（IND）申請。目前已有20多家公司申報了超過31個IND項目，先后有南京傳奇生物科技有限公司、上海明聚生物科技有限公司、上海恒潤達生生物科技有限公司、復星凱特和南京銀河生物醫(yī)藥有限公司等多家企業(yè)共12項IND項目獲準進行臨床試驗。其中，復星凱特申報的是Yescarta在中國進行本土化生產(chǎn)的產(chǎn)品，明聚生物申報的項目為朱諾JCAR017在中國的二次工藝開發(fā)的新產(chǎn)品，而其他十幾家公司的申請仍處在審評過程中。這一歷程說明，國家藥品審評中心通過與行業(yè)內(nèi)各企業(yè)的溝通與交流，已經(jīng)建立了對CAR-T產(chǎn)品嚴格有效的審評標準，規(guī)范了對CAR-T產(chǎn)品的研發(fā)進行評價的機制，能保障該類產(chǎn)品進入臨床試驗時對受試者的安全性和有效性。同時，由于不少企業(yè)的申報在規(guī)定期限內(nèi)并沒有獲得批準進入臨床試驗，這說明，此類項目的審報材料尚未達到國家相關(guān)機構(gòu)的監(jiān)管要求。此外，近期諾華公司已選取了上海的西比曼生物作為其在中國的Kymriah代工生產(chǎn)合作方，并會在國內(nèi)按照藥物監(jiān)管路線進行申報。至此，針對CD19的經(jīng)典二代CAR-T產(chǎn)品在中國的布局已經(jīng)基本完成。

4 免疫細胞治療技術(shù)進一步發(fā)展的前景和挑戰(zhàn)

4.1 免疫細胞治療技術(shù)發(fā)展的前景

CAR-T細胞產(chǎn)品的橫空出世，正逢整個腫瘤免疫治療領(lǐng)域突飛猛進之時。這幾年先后獲批的免疫檢查點單抗抑制劑能阻斷腫瘤對內(nèi)源T細胞的抑制，激發(fā)了患者免疫系統(tǒng)對腫瘤的清除。2011年上市的百時美施貴寶的CTLA-4單抗抑制劑Yervoy， 2015年上市的PD-1單抗抑制劑有百時美施貴寶的Opdivo和默克的 Keytruda，以及后續(xù)羅氏的PD-L1單抗藥物Tecentriq等。2017年5月23日，美國FDA又批準了增加Keytruda藥物廣泛的適應(yīng)癥，用于所有具有高度微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI-H）或者錯配修復缺陷（dMMR）實體瘤患者的治療。這是美國FDA批準的首款不依照腫瘤來源或組織病理分類，而是依照生物標志物進行區(qū)分的抗腫瘤療法的藥物，具有里程碑式的意義。這一類免疫抑制檢查點抑制性單抗藥物能夠在一定程度上讓患者的免疫系統(tǒng)重新獲得正常化，但療效還遠遠不如CAR-T產(chǎn)品，在血液系統(tǒng)惡性癌變患者中的平均應(yīng)答率僅有20%～30%。CAR-T產(chǎn)品注重于對T細胞的進行特異激活，產(chǎn)生強大的殺傷效果，機制上可與免疫檢查點抑制劑互補。如能將二者結(jié)合進行聯(lián)合治療，原理上會降低或解除腫瘤微環(huán)境對CAR-T的抑制作用，相信一定會為腫瘤治療帶來更進一步的突破。

我們更應(yīng)該看到，CAR-T產(chǎn)品迄今被批準的適應(yīng)癥群體都是末線治療后難治或復發(fā)的病人。從原理上看，CAR-T產(chǎn)品沒有理由不能成為二線或一線的標準治療方案。當然，這需要通過嚴謹?shù)碾S機對照臨床試驗來進行循證及驗證，并獲得監(jiān)管部門的審批和許可。一旦CAR-T產(chǎn)品的臨床應(yīng)用可以前移，將有更多的患者能盡早獲益。CAR-T產(chǎn)品的成功，只是整個腫瘤免疫治療的冰山一角。實際上，腫瘤免疫治療領(lǐng)域非常年輕，還有很多的未知數(shù)和很大的潛力。全球的研究者和從業(yè)者都在同一起跑線上，如果我們想做出有所創(chuàng)新的偉大成果、解決更多醫(yī)學上未滿足的需求、給腫瘤患者帶去治愈的希望，那么在免疫細胞治療領(lǐng)域進行耕耘將是最有可能實現(xiàn)這些愿望的方向之一。

4.2 CAR-T技術(shù)的進一步發(fā)展和應(yīng)用面臨以下幾個主要的挑戰(zhàn)

4.2.1 如何篩選敏感患者？ 如何對患者的愈后，副作用進行預測以及如何預測易復發(fā)的患者？CAR-T臨床試驗和驚人療效來得如此快，以至于很多轉(zhuǎn)化醫(yī)學研究的問題還沒有得到充分的研究。譬如說，在靶向CD19陽性的CAR-T的治療中，由于所有患者都有廣泛的CD19表達，因此我們還沒有明確的生物標志物來篩選或預測對CAR-T產(chǎn)品敏感的患者，以提高患者反應(yīng)率和緩解率。同樣，我們也在積累患者治療過程中各種細胞因子的檢測數(shù)據(jù)并進行分析，但迄今還無法確切預測什么樣的患者在治療中會有嚴重的細胞因子釋放癥或神經(jīng)毒性，從而進行預防性干預以降低風險。當然，最復雜的是部分CD19陽性的患者在CAR-T細胞治療后獲得緩解，但一段時間后會復發(fā)。在部分復發(fā)的患者中，發(fā)現(xiàn)有CD19抗原丟失或變異的現(xiàn)象。為了防止單抗原丟失或突變導致的復發(fā)，現(xiàn)在已經(jīng)有不少雙抗CAR-T項目在臨床中做同時或序貫治療的嘗試，包括了對 B細胞相關(guān)的靶點（如CD19和CD22）、對漿細胞的靶點（如BCMA和TARC）等。同時，對CAR-T技術(shù)進行改進以增強CAR-T細胞在患者體內(nèi)的持續(xù)性和活力也是解決這一類復發(fā)現(xiàn)象的努力方向之一。

4.2.2 如何開拓新的靶點以及適應(yīng)癥？目前CAR-T產(chǎn)品的臨床有效性僅在很少的靶點 （CD19和BCMA）上得到了驗證，且都是針對B細胞血液腫瘤的。這并不奇怪，從CAR-T分子設(shè)計的原理上看，需要作為靶細胞的腫瘤細胞都攜帶同一個抗原，才能被專一的scFv去識別，并被CAR-T細胞殺傷，獲得完全緩解的效果。而在實際情況下，這樣理想化的抗原是很罕見的。因為腫瘤存在組織學上的異質(zhì)性，由多種表達不同突變基因的癌細胞和基質(zhì)細胞構(gòu)成。目前獲得應(yīng)用的CD19和BCMA并不是腫瘤特異性抗原，而是B細胞系的標志物，它們對應(yīng)的 CAR-T產(chǎn)品治療B細胞B-ALL、DLBCL、MM 的成功是依賴于對包括惡性癌細胞在內(nèi)的所有 B系細胞的清除，而且在一定的時間內(nèi)患者可以耐受B細胞缺失，才使這類 CAR-T產(chǎn)品獲得好的治療效果。當我們要把CAR-T技術(shù)擴展到其他腫瘤應(yīng)用時，可能就難找到如此理想的靶分子了。尤其是實體瘤細胞基因突變活躍，蛋白表達異質(zhì)更明顯，要找到腫瘤特異且覆蓋率很高的合適靶點十分困難。同時，腫瘤內(nèi)形成的微環(huán)境也會抑制CAR-T細胞的活性。如何讓CAR-T細胞找到生長在特定的器官或組織內(nèi)的腫瘤，并克服腫瘤微環(huán)境的抑制，對腫瘤細胞實施清除，而不傷及正常細胞，是擴展CAR-T技術(shù)適應(yīng)癥必須要突破的一個重要難題。臨床前實驗中對串聯(lián)或并聯(lián)的雙靶點的CAR-T細胞設(shè)計具有良好提示性的效果，此類的技術(shù)路線有可能解決實體腫瘤細胞缺乏單一和特異的抗原問題。此外，科學家在實驗室還研制出了第三代和第四代CAR-T技術(shù)。第三代CAR分子是在第二代 CAR分子的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)上再增加兩個共刺激結(jié)構(gòu)域（CD28或4-1BB等），以增強CAR-T活力和持久力。第四代CAR分子是讓T細胞在表達 CAR分子的同時，再表達另一個可分泌的蛋白，常見的有 T細胞活化因子、PD-1/PD-L1抗體等，以期提高CAR-T細胞對腫瘤的浸潤能力并抵抗來自腫瘤微環(huán)境的抑制作用。新一代的 CAR-T技術(shù)使得有些聯(lián)合治療的想法可以在一個CAR-T細胞上實現(xiàn)，避免了多種藥聯(lián)合臨床試驗的設(shè)計和應(yīng)用難題。

另一項非常有前景的免疫細胞技術(shù)是 TCR-T，這項技術(shù)的出發(fā)點就是為了治療實體腫瘤。它借助于T細胞與生俱來的T細胞受體（TCR）結(jié)構(gòu)和生物學功能，通過模擬和篩選，制備出經(jīng)基因工程化改造后的能表達新 T細胞受體的細胞，再通過 MHC呈遞的腫瘤特定抗原以識別腫瘤細胞并殺傷這些腫瘤細胞。雖然制備這樣的TCR-T細胞產(chǎn)品，需要有比制備CAR-T產(chǎn)品更復雜、更高端的技術(shù)和工藝（包括應(yīng)用基因編輯等新技術(shù)，解決HLA-亞型的限制等難題）。但因為TCR分子可以用于針對細胞內(nèi)的腫瘤抗原進行設(shè)計而不像CAR分子只限于識別細胞表面的抗原分子，這就大大增加了對腫瘤抗原的選擇范圍和在實體瘤上進行應(yīng)用的可能性。TCR-T技術(shù)的臨床試驗?zāi)壳罢谶M行中，尚無批準上市的產(chǎn)品，在該領(lǐng)域領(lǐng)先的企業(yè)包括Adaptimmune/GSK、Kite、Juno和TCR2等。

4.2.3 如何降低基因轉(zhuǎn)導帶來的臨床未知風險？目前廣泛采用的將CAR基因?qū)隩細胞的技術(shù)以缺失復制能力的慢病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體為主。這些經(jīng)改造過的病毒載體可以有效地把外源基因?qū)肽康募毎蚪M內(nèi)，是基因治療的主要工具。應(yīng)用中雖然可以通過控制病毒劑量和活性來控制插入目的細胞基因組中的CAR基因拷貝數(shù)，但原理上這些插入位點是隨機性的，存在因為外源性基因片段插入導致某個重要內(nèi)源基因的失活或變異的可能性。最近報道的兩個CAR-T臨床案例就是對這種不可控風險的提示。第一個是意外的驚喜，賓大朱恩教授團隊在用靶向CD19的CAR-T細胞治療CLL的臨床試驗中，發(fā)現(xiàn)了其中1位完全緩解的患者外周血中94%的CAR-T細胞來源于同一個初始的被轉(zhuǎn)化的T細胞（具有相同的基因型）。經(jīng)過基因組測序發(fā)現(xiàn)，這一群細胞CAR分子的插入位點是在TET2基因上，造成了一個TET2基因座位的失活（恰巧，該患者的另一個TET2等位基因有先天突變失活）。而TET2基因功能的喪失，造成了該CAR-T細胞在擴增中占據(jù)了絕對優(yōu)勢，進而導致癌細胞的持續(xù)殺傷和病人完全緩解。雖然這是小概率事件，我們必須要正視這種基因插入導致的臨床效果的不確定因素，以及它們在體內(nèi)可能的長期影響。另一個案例也是來自于朱恩教授團隊在自然醫(yī)學期刊上的報道，1位白血病患者接受了CTL019治療后9個月復發(fā)并最終死亡。究其原因，發(fā)現(xiàn)是因為在逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將CAR基因轉(zhuǎn)導入T細胞時，碰巧也將CAR基因轉(zhuǎn)入了CD19陽性的腫瘤 B細胞中。該腫瘤細胞上表達的CAR分子上的scFv起到了罩蓋和保護其自身CD19抗原的作用，免于被CAR-T細胞殺傷。這警示了我們要關(guān)注此類的連帶效應(yīng)，最好開發(fā)新的工藝和方法能去除不需要的其他細胞，尤其是血液里的腫瘤細胞，以避免此類事件的發(fā)生。

4.2.4 如何進一步改進CAR-T生產(chǎn)工藝以降低成本和價格？工欲善其事，必先利其器。在制備CAR-T產(chǎn)品時需要縮短時間，引入自動化設(shè)備，減少人力消耗和人為因素造成的偏差。還有一個重要發(fā)展方向，就是開發(fā)異體細胞技術(shù)。設(shè)想，如果能用健康供者的免疫細胞，通過基因編輯手段，去除所有能引起移植物抗宿主和宿主抗移植物反應(yīng)的基因，再轉(zhuǎn)入CAR基因并使轉(zhuǎn)導的T細胞極大化的擴增，制成可以治療多個患者劑量的產(chǎn)品。這樣的產(chǎn)品即為“現(xiàn)貨供應(yīng)（off the shelf）”，與傳統(tǒng)的藥物相似，一次生產(chǎn)制備的產(chǎn)品可以供多個患者治療使用。病人也不需要等待產(chǎn)品制備的時間，能夠盡量利用治療窗口期。法國的一家叫 Cellectis的生物技術(shù)公司，就是專注于開發(fā)這種同種異體CAR-T細胞療法，已經(jīng)有3款針對不同靶點的項目在臨床試驗階段。這一領(lǐng)域還有后起之秀Allogene，他們的UCART19對B-ALL的I期臨床試驗，在與anti-CD52單抗聯(lián)用的條件下，獲得了82%（14/17）完全緩解率，在此過程中也沒有出現(xiàn)3級或以上的移植物抗宿主病的副作用。由于原理上認為，異體細胞存在對宿主細胞進行攻擊的風險，異體CAR-T技術(shù)往往會加入“安全開關(guān)”，一旦在患者體內(nèi)出現(xiàn)安全問題，可以通過啟動自殺機制來抑制這樣的移植物抗宿主反應(yīng)。但要注意的是，由于 T細胞為終末分化的細胞，其在體外擴增傳代的能力是有限的，所以原理上講，一個供體樣品想制備出成千上萬的劑量還是不可能的。鑒于此，有學者提出通過細胞命運重編程，將體細胞誘導成多能性干細胞達到擴增目的后，轉(zhuǎn)入CAR結(jié)構(gòu)，再將這樣的多能性CAR陽性干細胞誘導分化成 T細胞，以獲得大量CAR-T細胞，這樣的技術(shù)路線被稱為iPSCAR-T技術(shù)。但這可能會遇到 T細胞再定向分化效率不可控的問題，以及在干細胞上進行多個基因操作導致成瘤致瘤風險增加的擔憂。不管如何，異體細胞技術(shù)如能真正實現(xiàn)臨床應(yīng)用，將可以平攤很多固定費用，大大降低生產(chǎn)成本。

4.2.5 如何發(fā)展出適合CAR-T產(chǎn)品的商業(yè)化應(yīng)用模式？CAR-T作為自體活細胞藥物，它并不能通過傳統(tǒng)的藥品銷售流通渠道，而是由生產(chǎn)商直接與定點醫(yī)院合作。一旦病人進行白細胞單采，企業(yè)有義務(wù)確保產(chǎn)品的成功制備和質(zhì)控放行，并且要在一定的時間內(nèi)將產(chǎn)品保證質(zhì)量的送達醫(yī)院，回輸給病人。而在等待這樣一個復雜流程完成的時間內(nèi)，病人的身體狀況和疾病本身的進展程度可能會發(fā)生變化，造成無法接受CAR-T產(chǎn)品的回輸。對病人來說，必須要到指定的醫(yī)院就醫(yī)，那么全國到底要設(shè)多少這樣的醫(yī)院才能滿足廣大患者就醫(yī)需求？供應(yīng)鏈和冷鏈物流如何管理？病人如何從其它非指定醫(yī)院導入到具備CAR-T產(chǎn)品治療的醫(yī)院？如何定價收費？患者如何獲得醫(yī)保？如何推動商業(yè)大病保險來減少患者的經(jīng)濟負擔？在這樣的商業(yè)運作過程中，會有很多前所未有的問題需要去探索和研究、去創(chuàng)新和突破。而且CAR-T產(chǎn)品的生產(chǎn)者和運營者必須在產(chǎn)品獲批上市前做好相應(yīng)的準備工作，才能使CAR-T這項革命性的腫瘤治療藥物不會因為商業(yè)運作的不成功而不能惠及廣大患者。

5 總結(jié)

我們正處在一個腫瘤治療手段日新月異的時代，也同時是癌癥的發(fā)生和致命率不斷增長的階段，所謂道高一尺，魔高一丈。人類抗癌的任務(wù)是長期的和艱巨的。免疫細胞CAR-T藥物的開發(fā)和臨床應(yīng)用已經(jīng)為部分腫瘤治療帶來了革命性的飛躍，使得人們不再談癌色變。如何把這類技術(shù)推廣到更多的適應(yīng)癥尤其是實體瘤，且具有更好的療效、更安全的指數(shù)，將是近期研發(fā)的主攻方向，也是每個藥物科研人員夢寐以求的事?！?/p>

（摘自《中國細胞生物學學報》2019年第4期）