陳慧勤，崔 婷

(1.蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床教學(xué)辦，江蘇蘇州215006;2.北京聯(lián)合大學(xué)圖書館，北京100101)

多菌靈(Carbendazim，MBC)是一種廣譜苯并咪唑類抗真菌農(nóng)藥，對真菌引起的病害如灰霉病、白粉病等有著較好的防治效果，因此廣泛應(yīng)用于果蔬等植物病蟲害的防控［1－3］。然而，多菌靈化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，在環(huán)境中的半衰期較長，容易在果蔬表面造成嚴(yán)重的殘留［4－6］。且農(nóng)用多菌靈可濕性粉劑、懸浮劑等在果蔬表面附著力較強(qiáng)，難以實(shí)現(xiàn)較徹底的清洗［7］。多菌靈可引起人類多個(gè)器官的病變及細(xì)胞內(nèi)DNA的突變，因此果蔬表面多菌靈殘留對人體健康造成極大危害［8－9］。尋找多菌靈降解的有效方案成為解決該問題的關(guān)鍵。

可降解多菌靈的細(xì)菌已有較多報(bào)道。目前篩選到的多菌靈降解菌集中在紅球菌、羅爾斯通氏菌、芽孢桿菌等幾種［10－12］，其中部分菌種可利用多菌靈為唯一碳源生長。然而微生物法降解多菌靈時(shí)間消耗較長且活體微生物制劑穩(wěn)定性較差，難以實(shí)現(xiàn)果蔬表面多菌靈的快速降解。相比之下，從可降解多菌靈的微生物中篩選其水解酶成為較理想的選擇。水解酶是一大類酶的總稱，可用于多種化學(xué)鍵的催化斷裂，如脂肪酸水解、蛋白水解等。多菌靈的第一步水解是其C－N單鍵的斷裂，催化該化學(xué)鍵斷裂的水解酶僅有部分報(bào)道，從諾卡氏菌、副球菌等中克隆出的水解酶均屬于水解酶中降解非肽C－N鍵的亞類(EC3.5)［13－14］。該類酶屬于酰胺水解酶，用于多種氨基酸的酶法合成，具有較高的催化活性和催化效率［15］。基于此種水解酶的專一性、有效性等指標(biāo)，可將該酶使用于果蔬表面多菌靈殘留的分解。

本研究擬從自然界中篩選高效多菌靈降解菌，并設(shè)計(jì)簡并引物從降解菌中擴(kuò)增其多菌靈水解酶基因。將水解酶基因在大腸桿菌BL21中過表達(dá)后進(jìn)行蛋白純化，并將純化后的蛋白作為酶制劑對黃瓜、草莓等表面多菌靈殘留的降解劑，用于日常生活中的果蔬農(nóng)殘清洗。

圖1 多菌靈及其降解產(chǎn)物2－氨基苯并咪唑結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structure formula of carbendazim and its degradation product 2－aminobenzimidazole

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

多菌靈可濕性粉劑 四川國光農(nóng)化股份有限公司;多菌靈標(biāo)準(zhǔn)品 Sigma公司;實(shí)驗(yàn)所需各類試劑 北京化工廠;土壤樣品 北京市平谷區(qū)桃樹基地多菌靈使用區(qū)域采集;DNA合成及測序 北京華大基因;多菌靈篩選培養(yǎng)基成分為:多菌靈0.5 g/L，磷酸氫二鉀0.3 g/L，磷酸二氫鉀0.6 g/L，硫酸銨2 g/L，硫酸鎂0.2 g/L，碳酸鈣0.1 g/L，瓊脂粉15 g/L;LB培養(yǎng)基成分為:氯化鈉10 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，固體培養(yǎng)基中加入瓊脂粉15 g/L;His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒 碧云天生物科技有限公司;SDSPAGE所用上樣緩沖液 北京全新拓達(dá)科技有限公司;用于實(shí)驗(yàn)的新鮮果蔬 均購自京東超市商城，購買當(dāng)天即進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

LC－20液相色譜儀、LCMS－8030液相色譜－質(zhì)譜連用儀 日本島津公司;754N紫外可見光分光光度計(jì) 上海奧普樂公司;DYCZ－24DN電泳儀 北京六一儀器廠;TGL－10B離心機(jī) 上海安亭公司;DHG－9070A培養(yǎng)箱及干燥箱 上海一恒儀器廠;Scienzt－IID超聲細(xì)胞破碎儀 寧波新芝生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種分離及鑒定

1.2.1.1 菌種的分離 取多菌靈污染的土壤樣品0.5 g置于離心管中，使用無菌水吸打混勻后靜置，取上清液涂布至多菌靈篩選培養(yǎng)基平板，倒置于37℃培養(yǎng)箱中恒溫48 h后，將長出的菌落轉(zhuǎn)移至新多菌靈篩選培養(yǎng)基傳代，將連續(xù)3代在只含多菌靈的培養(yǎng)基上長出的單菌落挑出至LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)并保存。

1.2.1.2 菌種的鑒定 菌種的鑒定使用16S DNA比對法。參照參考文獻(xiàn)［16］，使用通用引物27F和1492R進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增，電泳確認(rèn)后送至華大基因進(jìn)行測序鑒定。系統(tǒng)發(fā)育樹使用MEGA5.0軟件繪制。

1.2.1.3 多菌靈降解實(shí)驗(yàn) 多菌靈降解實(shí)驗(yàn)所用培養(yǎng)基與篩選培養(yǎng)基所用無機(jī)鹽相同，唯一碳源多菌靈的初始濃度設(shè)定為30 mg/L(前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果)。將單菌落接種于4 mL的LB液體培養(yǎng)基中，并于37℃200 r/min條件下培養(yǎng)12 h，測定菌液OD600。調(diào)整其稀釋倍數(shù)，使得0.1 g干重菌體細(xì)胞轉(zhuǎn)接至裝液量為100 mL的250 mL三角瓶中于37℃200 r/min條件下培養(yǎng)。每24 h取一定量的菌液進(jìn)行后續(xù)生物量及多菌靈含量的測定。生物量參照文獻(xiàn)采用比色法測定［17］，將一定量的菌液經(jīng)過12000 r/min離心10 min取上清液，對菌液中多菌靈含量通過HPLC測定。

1.2.2 基因克隆、蛋白表達(dá)及純化

1.2.2.1 水解酶基因的克隆 將篩選出可降解多菌靈的菌種挑出至1 mL無菌水中混勻，進(jìn)行基因組DNA提取。以提取后的基因組DNA為模板，設(shè)計(jì)簡并引物 F:5'－CGCGGATCCATGGANCTCANTGAN CAGNATGC;3'－ R:5'－ CCCAAGCTTTCNTGCTGNCA GNCTGANCCTGT 3'－，使用梯度 PCR進(jìn)行擴(kuò)增。PCR程序?yàn)?4℃、3 min，94 ℃、1 min，退火 40 s，72℃、1 min，30個(gè)循環(huán);72℃、10 min，16℃保存。退火溫度梯度為47、50、53、56、59、62、65 ℃?；驍U(kuò)增后使用Bam HI和Hind III酶切位點(diǎn)切割基因和p ET－28a質(zhì)粒，切膠回收后16℃連接過夜。將重組質(zhì)粒與E.coli BL21感受態(tài)細(xì)胞混合后42℃熱擊90 s，加入1 mL的LB培養(yǎng)基，并涂布至含有30 mg/L的卡那霉素LB固體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h后鑒定重組子。

1.2.2.2 蛋白的表達(dá) 將重組菌在含有卡那霉素(30 mg/L)及含0.05 mmol/L Isopropylβ－DThiogalactoside(IPTG)的 LB培養(yǎng)基中37℃200 r/min誘導(dǎo)表達(dá) 12 h后，取出 200 uL菌液12000 r/min離心10 min去上清，沉淀中加入蛋白電泳上樣緩沖液后，沸水浴10 min，再次12000 r/min離心10 min后，使用上清液進(jìn)行SDS－PAGE。SDSPAGE采用12%聚丙烯酰胺凝膠，上樣量20 uL，恒壓120 V。電泳結(jié)束后使用20 mmol/L的考馬斯亮藍(lán)G250常溫染色2 h，換無菌去離子水脫色12 h。

1.2.2.3 蛋白的純化 將重組菌接種在20 mL的LB液體培養(yǎng)基中，37℃下 200 r/min培養(yǎng) 12 h。12000 r/min離心10 min去上清后，使用 pH7.0的50 mmol/L磷酸鉀緩沖液重懸細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞超聲破碎(80 W，工作3 s，停2 s，100次)。蛋白純化使用碧云天蛋白純化試劑盒進(jìn)行，將破碎液過鎳柱后，使用試劑盒中W1洗滌液洗掉未吸附蛋白，再用試劑盒中D1洗脫液將目標(biāo)蛋白洗脫。酶活測定時(shí)使用細(xì)胞破碎液10 uL或純化后蛋白1 ug加入至含有1 mmol/L多菌靈溶液中，測定其在37℃培養(yǎng)箱中靜置10 min后多菌靈殘留，計(jì)算其消耗量。酶活定義為1 h內(nèi)消耗1μmol/L多菌靈所需要的酶量。

1.2.3 果蔬表面農(nóng)殘降解 以土豆為例，將新鮮的土豆表面洗凈，浸泡在含有10 mg/L的多菌靈溶液中5 min后取出。將土豆平均分組，其中實(shí)驗(yàn)組和對照組分別設(shè)置30個(gè)樣品用于平行實(shí)驗(yàn)。自然晾干后分別取每組三個(gè)樣品置于不同托盤中，將純化后的水解酶KY－1配制為1 mg/L的水劑，以相等劑量噴灑于多菌靈浸泡后的土豆表面，對照組以相等體積的無菌水噴灑，噴灑后對照組和實(shí)驗(yàn)組分別置于30℃培養(yǎng)箱測定果蔬表面多菌靈降解。每隔24 h取出三個(gè)實(shí)驗(yàn)組和三個(gè)對照組的樣品，分別浸泡在200 mL無菌水中10 min，取上清液過0.22 um微孔濾膜檢測多菌靈含量。以初始晾干后果蔬表面多菌靈含量為100%，計(jì)算多菌靈降解率。

式中，M0為初始晾干后果蔬表面多菌靈峰面積;Mi為每次取樣時(shí)測得該時(shí)間點(diǎn)果蔬表面多菌靈峰面積。

黃瓜、西紅柿和草莓以相同的實(shí)驗(yàn)方法測定。

1.2.4 檢測方法 多菌靈液相檢測使用島津LC－20液相色譜紫外檢測器，C18色譜柱，柱溫30℃，流動相為30%的甲醇水溶液，磷酸濃度0.05%，檢測波長280 nm。質(zhì)譜采用ESI電離源，毛細(xì)管電壓3.0 k V，錐孔電壓30 V，離子源溫度100℃，脫溶劑溫度400℃，錐孔氣流量50 L/h，脫溶劑氣流量700 L/h，液質(zhì)檢測掃描質(zhì)量范圍m/z:50～300。標(biāo)準(zhǔn)曲線為多菌靈標(biāo)準(zhǔn)溶液檢測后以含量－峰面積繪制，標(biāo)準(zhǔn)溶液多菌靈濃度為 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g/L，標(biāo)準(zhǔn)曲線為 y=103730x，x 為多菌靈濃度，y 為峰面積，R2=0.9991。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)中每個(gè)樣品重復(fù)3次測定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用Origin 8.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 多菌靈降解菌的篩選與鑒定

經(jīng)過連續(xù)篩選，最終得到一株可利用多菌靈為唯一碳源生長的細(xì)菌，經(jīng)過16S rRNA序列鑒定及序列比對，確認(rèn)該菌種為產(chǎn)酸克雷伯菌 Klebsiella oxytoca，命名為K.oxytoca KO－1。該菌種的16S rRNA擴(kuò)增結(jié)果如圖2中所示，在第1泳道中約1500 bp位置出現(xiàn)了清晰的條帶。如圖3中所示，發(fā)育樹分析表明，K.oxytoca KO－1與產(chǎn)酸克雷伯菌親緣關(guān)系較為接近，但仍與已知菌種存在一定差異，為目前尚未被篩選鑒定過的新菌種。

圖2 K.oxytoca KO－1菌16SDNA的PCR電泳圖Fig.2 PCR amplification of 16SDNA of K.oxytoca KO－1.注:M:DNA Marker DL5000;1:16SDNA of K.oxytoca KO－1。

圖3 K.oxytoca KO－1的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of K.oxytoca KO－1

2.2 多菌靈降解

將所篩選K.oxytoca KO－1接入液體多菌靈培養(yǎng)基，所測得多菌靈降解及生物量如圖4中所示。由圖4中可以看出，30 mg/L多菌靈在液體培養(yǎng)基中第7 d被完全消耗，平均降解速率為4.29 mg/L·d。與張桂山等［11，16］結(jié)果相比，K.oxytoca KO－1 在液體培養(yǎng)基中對多菌靈降解速度較快。K.oxytoca KO－1的生長在第3 d到達(dá)平穩(wěn)期，細(xì)胞最高吸光度值為0.16。本實(shí)驗(yàn)中未加入除多菌靈外的有機(jī)物，因此K.oxytoca KO－1的生長受到了限制［18］。其次，多菌靈為殺菌劑，其對K.oxytoca KO－1的生長也產(chǎn)生了一定的抑制作用。該數(shù)據(jù)也說明，使用微生物法除去多菌靈，存在降解菌生長易受多菌靈影響等問題。

圖4 多菌靈降解及K.oxytoca KO－1的OD600吸光度值Fig.4 Carbendazim degradation and OD600 of K.oxytoca KO－1

2.3 水解酶編碼基因的克隆

根據(jù)K.oxytoca中的多個(gè)水解酶基因序列比對并設(shè)計(jì)簡并引物，梯度PCR擴(kuò)增其水解酶基因，擴(kuò)增結(jié)果如圖5中所示。由圖5中可知，水解酶基因在退火溫度為50～59℃區(qū)間內(nèi)時(shí)被成功擴(kuò)增出。經(jīng)測序鑒定，該基因大小為837 bp，命名為ky1。序列比對后確認(rèn)該基因與來自K.oxytoca M1中的水解酶基因HR38_01345有約99%的同源性，堿基存在7處差別，具體見表1。

圖5 ky1基因的PCR擴(kuò)增Fig.5 PCR amplification of ky1注:M:DNA Marker DL5000;1～7:退火溫度47、50、53、56、59、62、65 ℃時(shí)的 PCR 產(chǎn)物。

表1 ky1與HR38_01345的堿基差別Table 1 The DNA sequence differencesbetween ky1 and HR38_01345

2.4 ky－1的表達(dá)純化及催化產(chǎn)物檢測

將ky1基因使用Bam HI和Hind III酶切位點(diǎn)連接入表達(dá)載體p ET－28a后轉(zhuǎn)入BL21中，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。實(shí)驗(yàn)SDS－PAGE結(jié)果如圖6中所示。在1泳道，成功表達(dá)出大小為28 kDa的KY－1，而對照組相應(yīng)位置沒有條帶出現(xiàn)，證明表達(dá)成功。使用鎳柱純化蛋白后，可見到3泳道中清晰的條帶，成功得到了KY－1純化蛋白。酶活實(shí)驗(yàn)顯示，未純化及純化后的KY－1比活力達(dá)到0.16和36.8 U/mg。純化后的KY－1比未純化的大腸桿菌細(xì)胞破碎液催化多菌靈的能力有了大幅度的提高，證明純化后的KY－1有著較強(qiáng)的清除多菌靈的潛力。對KY－1酶催化產(chǎn)物檢測，檢測結(jié)果如圖7中所示。質(zhì)譜圖中m/z為192.10和134.20為多菌靈及其降解產(chǎn)物2－氨基苯并咪唑［13］。液質(zhì)結(jié)果顯示，KY－1成功將多菌靈分解。

圖6 KY－1的SDS－PAGE分析Fig.6 SDS－PAGE analysis of KY－1注:M:蛋白標(biāo)尺;1:E.coli(pET－28a－ky1)粗蛋白;2:E.coli(pET－28a)粗蛋白;3:純化后的 KY－1。

圖7 液質(zhì)分析多菌靈代謝產(chǎn)物Fig.7 HLPC－MSanalysis of carbendazim degradation product注:m/z192和134分別為多菌靈及其代謝產(chǎn)物2－氨基苯并咪唑。

Pandey等［13］從諾卡氏菌種克隆出可水解多菌靈的酯酶MheI，編碼基因長度為729 bp，Km和Kcat值分別 為 6.1 μmol/L 和 170 min－1。 Hang 等［19］從Hansschlegelia zhihuaiae S113中克隆并表達(dá)出SulE，可用于多菌靈降解，但未對酶活進(jìn)行測定。Lei等［20］從Microbacterium sp.djl－6F克隆出mehI基因，表達(dá)蛋白 Km和 Kcat值分別為6.69 μmol/L 和160.88 min－1，并對其進(jìn)行了突變。相比之下，KY－1的Km和Kcat值分別為6.26μmol/L和168 min－1，催化效率與上述報(bào)道較為接近。本實(shí)驗(yàn)中的蛋白KY－1可通過E.coli表達(dá)系統(tǒng)大量獲得，且酶催化活性較高，是工業(yè)級酶制劑生產(chǎn)的較好選擇。

2.5 去除果蔬農(nóng)殘

將純化后的KY－1制備為酶制劑后，分別噴灑于多菌靈污染的西紅柿、黃瓜、土豆及草莓的表面，用于檢測多菌靈的降解。由圖8中可知，多菌靈在果蔬表面有自然降解的發(fā)生，其中西紅柿表面降解較快，而草莓表面降解較慢，推測原因?yàn)槲骷t柿表面褶皺越少，噴灑蒸餾水對其多菌靈洗脫較為有利。噴灑KY－1酶制劑后，各種果蔬表面多菌靈殘留均有較為明顯的下降，噴灑酶制劑6 d后，西紅柿、黃瓜、土豆及草莓表面多菌靈剩余分別為70.2%、65.2%、62.1%和57.2%。同時(shí)，相比于各自對照組的多菌靈殘留量，多菌靈降解最多的為草莓，減少量為37.3%;降解最少的為西紅柿，減少量為10.5%。由以上數(shù)據(jù)可以看出，表面褶皺越多的果蔬，其多菌靈自然降解越慢。而加入KY－1后，表面褶皺多的果蔬，多菌靈得到了較快的降解。造成該現(xiàn)象可能的原因?yàn)?，表面褶皺給酶催化多菌靈降解提供了更多的比表面積，促進(jìn)了酶解反應(yīng)的進(jìn)行。

圖8 KY－1酶制劑清除果蔬表面多菌靈Fig.8 Degradation of carbendazim residue on surface of fruits by KY－1注:A:西紅柿;B:黃瓜;C:土豆;D:草莓。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)從土壤中篩選出了一株高效降解多菌靈的產(chǎn)酸克雷伯菌 KY－1，并從其基因組中克隆出837 bp的水解酶基因ky1。將ky1在E.coli中表達(dá)純化后，液質(zhì)檢測其表達(dá)產(chǎn)物KY－1成功將多菌靈降解為2－氨基苯并咪唑。使用KY－1酶制劑對果蔬表面多菌靈進(jìn)行降解，成功減少了西紅柿、黃瓜、土豆及草莓表面的多菌靈殘留，最高減少了37.3%。本研究成功使用酶法對果蔬表面農(nóng)殘進(jìn)行了降解去除。果蔬表面的農(nóng)藥殘留是在其生長及儲存階段噴灑但未被降解及清洗掉的部分農(nóng)藥，其中部分農(nóng)藥殘留因水溶性較小而難以清洗。使用微生物法可降解部分農(nóng)藥殘留，但其降解速度較慢，難以滿足市場化的應(yīng)用需求。相比之下本研究中所制備的KY－1可快速有效實(shí)現(xiàn)果蔬表面多菌靈的降解，且其生產(chǎn)成本較低，是未來果蔬清洗添加劑的選擇之一。