楊 振, 陳智強, 王訥敏, 吳文景, 馬祥慶, 吳鵬飛

(1.福建農(nóng)林大學林學院；2.國家林業(yè)局杉木工程技術研究中心；3.人工林可持續(xù)經(jīng)營福建省高校工程研究中心，福建 福州 350002)

杉木(Cunninghamialanceolata(Lamb.) Hook.)是我國重要造林樹種，在生產(chǎn)生活中應用極為廣泛[1]，但其大面積分布的南方紅壤區(qū)有效磷含量極低，難以維持杉木人工林長期生產(chǎn)力.由于磷是植物生長所必需的大量元素之一，是核酸、磷脂、輔酶等物質(zhì)的重要組成部分，在光合活動中起重要作用[2]，因此人工施加磷肥是杉木培育過程中的一種重要手段[3].根系施磷是目前最主要的施磷方式，但有研究表明，根系施磷極易造成磷素浪費且對環(huán)境存在一定負面影響，加上世界磷礦資源已相當匱乏[4]，亟需探索一種更為合理的施磷方式.

葉面施肥作為一種新型施肥方式，已成為供給植物營養(yǎng)的重要途徑[5].葉面施肥可加速植物對營養(yǎng)元素的吸收，無論吸收效率還是施肥效果均優(yōu)于根系施磷[6-7].根系施磷配合葉面施磷能大大提高蓖麻(RicinuscommunisL.)生物量的積累，并提高了鉛脅迫下蓖麻對重金屬鉛的轉(zhuǎn)運能力，從而起到對土壤鉛的修復作用[8].葉面施加磷鉀肥能顯著提高作物的抗旱耐寒能力[9].胡映全[10]研究發(fā)現(xiàn)，根外追肥顯著影響銀杏(GinkgobilobaL.)光合特性.目前，有關葉面施肥對作物生產(chǎn)力的研究較多，而對林木的影響研究較少，尤其是通過葉片光合能力研究葉面施磷對植株生長力影響的報道甚少.

因此，本試驗選擇杉木同一無性系幼苗為研究對象，通過設置葉面施磷、根系施磷和不施磷3種供磷方式，采用破壞性室內(nèi)盆栽試驗，利用光合儀及透射電鏡等技術，分別于試驗前期(幼苗培養(yǎng)60 d)和試驗后期(幼苗培養(yǎng)120 d)測定分析不同施磷方式處理下杉木葉片光合特性、熒光參數(shù)和葉綠體形態(tài)等光合能力指標以及根、莖、葉磷素分配量的變化，探討葉面施磷方式對杉木光合系統(tǒng)的影響機理，為林木合理葉面施磷提供科學理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗在福建農(nóng)林大學林學院溫室大棚內(nèi)進行，選擇福建省洋口林場國家杉木良種基地培育的“寬冠型”無性系(061)苗木為試驗材料[11].參試材料為一年生苗木，生長健壯，試驗初始的平均苗高為40.37 cm，平均地徑為4.47 mm.選取口徑40 cm、高32 cm的聚乙烯塑料花盆作為培養(yǎng)容器進行栽培試驗，培養(yǎng)基質(zhì)為洗凈河沙，每盆裝25 kg洗凈河沙(過2 mm篩)，其有效磷含量為痕量.

1.2 試驗設計

于2016年4月20日將參試杉木幼苗栽植于栽培容器中，采取破壞性試驗設計，以不施磷處理作為對照處理，設置根系施磷和葉面施磷2種處理，每種處理10個重復.采用1/8濃度的Hoagland營養(yǎng)液(表1)為杉木提供生長所需營養(yǎng)，根系施磷處理以KH2PO4為磷源，葉面施磷處理以NaH2PO4為磷源，并用KCl調(diào)節(jié)K含量，確保葉面施磷與不施磷處理中營養(yǎng)液K+濃度相同.根系施磷與葉面施磷處理中磷濃度均為3.875 mg·L-1，營養(yǎng)液pH值為5.5.在根部施磷處理中，每5 d澆1次1/8濃度的Hoagland營養(yǎng)液(含KH2PO4)[12]，每3 d向葉面均勻噴施純凈水；葉面施磷處理中，每3 d向葉面均勻噴施NaH2PO4溶液，每5 d向根部澆一次1/8濃度的不含磷Hoagland營養(yǎng)液；不施磷對照處理中，每5 d向根部澆1次1/8濃度的不含磷Hoagland營養(yǎng)液，每3 d向葉面均勻噴施純凈水.本試驗葉面施磷與根系施磷處理施加P總量一致，葉面噴施量均為每盆每次300 mL，共噴施20次；根部澆施量均為每盆每次500 mL，共澆灌12次.所有處理于每天午后向根部澆水200 mL，以保證苗木生長的正常需水，溫室內(nèi)溫度為25～35 ℃，相對濕度>80%，每天光照14 h(光照強度約800 μmol·m-2·s-1).分別于2016年6月19日(參試幼苗培養(yǎng)60 d的試驗前期)與8月19日(參試幼苗培養(yǎng)120 d的試驗后期)進行不同處理條件下苗木的收獲，每次每個處理隨機收獲5株進行室內(nèi)指標測定.

1.3 試驗方法

杉木光合能力指標分別于試驗前期(參試苗木培養(yǎng)60 d)和試驗后期(參試苗木培養(yǎng)120 d)上午9:00—11:00進行測定.采用Li-6400光合作用儀(Li-6400, Licor, USA)針狀葉室測定不同施磷方式下杉木幼苗葉片的凈光合速率(Pn)、蒸騰速率(Tr).測定條件為：葉室溫度(23±0.5) ℃，光照強度為1200 μmol ·m-2·s-1，環(huán)境CO2濃度370 μmol ·m-2·s-1，葉室流速500 μmol·s-1.

采用便攜式葉綠素熒光分析儀(OS-30P, Li-Cor)，測定基礎熒光參數(shù)(Fo)、最大熒光產(chǎn)量(Fm)和最大光化學熒光效率(Fv/Fm)等葉綠素熒光參數(shù).每個試驗階段測定3次，測定時選取杉木幼苗頂端的向陽葉片，由于杉木葉面較窄，故將葉片進行匯聚后用暗適應夾夾住葉片中部，充分暗反應20 min后測得數(shù)據(jù).

葉綠體形態(tài)測定：采集新鮮葉片迅速洗凈后置于戊二醛固定液中固定，置于冰箱中4 ℃條件下過夜，然后取出樣品，用鋒利刀片將樣品切成小塊，磷酸緩沖液清洗3次，每次15 min，2%鋨酸溶液4 ℃條件下固定2 h，PBS清洗3次，每次15 min，50%、70%、80%、90%、100%乙醇梯度逐級脫水，丙酮置換2次，依次在丙酮∶包埋劑為2∶1、1∶1、1∶2(體積比)的浸漬液及純包埋劑中進行浸漬，于65 ℃條件下包埋劑中聚合48 h.修塊后用Leica EM UC7進行超薄切片，切片厚度70 nm，醋酸雙氧鈾及醋酸鉛雙重染色，F(xiàn)EI Tecnai G2 Spirit透射電子顯微鏡觀察、拍照.

苗木收獲時將參試幼苗根、莖、葉分離，分別烘干、測定生物質(zhì)干重、粉碎，采用HNO4-HCLO4消煮法[13]進行消煮，利用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(ICP-OES, PekinElmer, USA)測定植物不同器官的磷含量，并計算不同器官的磷素分配量及全株磷素積累量[14-15].

表1 不同施磷方式1/8濃度Hoagland營養(yǎng)液配方Table 1 Formula of 1/8 concentration of Hoagland solution for different treatments

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用SPSS 16.0軟件進行雙因素方差分析，檢驗試驗持續(xù)時間(前期和后期)與施磷方式(葉面施磷、根系施磷和不施磷)2個因素對所測得杉木幼苗各光合能力指標是否存在交互作用，并進行不同試驗持續(xù)時間下各施磷方式處理之間的差異性分析(P=0.05).采用Origin 9.0作圖，圖中的值為平均值±標準差.采用PhotoShop CS6軟件進行葉綠體圖像的形態(tài)分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同施磷方式對杉木幼苗光合特性的影響

從表2可以看出，試驗持續(xù)時間與施磷方式對蒸騰速率(Tr)的影響存在極顯著的交互作用(P<0.01)，但對凈光合作用速率(Pn)的交互作用未達顯著水平(P>0.05)，從單個因素來看，試驗持續(xù)時間對Pn和Tr的影響均達極顯著水平(P<0.01)，施磷方式對Pn的影響未達顯著水平，但對Tr的影響達顯著水平(P<0.05).

表2 試驗持續(xù)時間與施磷方式對杉木葉片光合特性的影響1)Table 2 Effects of application duration and method on the photosynthetic characteristics of Chinese fir needles

1)*,P<0.05;**,P<0.01;ns,P>0.05.

如圖1所示，就試驗持續(xù)時間而言，試驗后期葉片的Pn和Tr均顯著高于或高于試驗前期.對施磷方式來說，無論試驗前期還是試驗后期，不同施磷方式對Pn的影響均不顯著；在試驗前期，不同施磷方式對Tr的影響不顯著，在試驗后期，不施磷處理的Tr顯著低于其他兩組處理.

2.2 不同施磷方式對杉木幼苗葉綠素熒光參數(shù)的影響

試驗持續(xù)時間與施磷方式對基礎熒光參數(shù)(Fo)、最大光學量子產(chǎn)量(Fv/Fm)的交互作用均達極顯著水平，但對最大熒光參數(shù)(Fm)的交互作用未達顯著水平.從單個因素看，隨著試驗持續(xù)時間的延長，不同施磷方式對Fm的影響均未達顯著水平(P>0.05)(表3).

試驗前期，不施磷處理的Fo顯著高于葉面施磷與根系施磷處理，F(xiàn)v/Fm顯著小于葉面施磷與根系施磷處理；試驗后期，根系施磷處理的Fo顯著低于葉面施磷與不施磷處理，F(xiàn)v/Fm顯著高于葉面施磷與不施磷處理(圖2).

不同小寫字母表示不同試驗時期不同施磷方式處理間差異顯著(P<0.05).圖1 不同試驗時期不同施磷方式對杉木葉片Pn和Tr的影響Fig.1 Effect of P application methods on Pn and Tr in the earlier and later stages of the trial

因素自由度F值FmFoFv/Fm試驗持續(xù)時間(a)12.365ns44.275**89.369**施磷方式(b)23.093ns30.148**61.130**a×b20.114ns13.013**40.579**

1)*,P<0.05;**,P<0.01;ns,P>0.05.

不同小寫字母表示不同試驗時期不同施磷方式處理間差異顯著(P<0.05).圖2 不同試驗時期不同施磷方式對杉木葉片F(xiàn)m、Fo和Fv/Fm的影響Fig.2 Effect of P application method and duration on Fm, Fo and Fv/Fm of Chinese fir in the earlier and later stages of the trial

2.3 不同施磷方式對杉木幼苗葉綠體形態(tài)的影響

杉木培養(yǎng)60 d(試驗前期)，不同處理葉綠體結(jié)構(gòu)相對完整，片層結(jié)構(gòu)清晰，葉綠體外膜平滑清晰，呈現(xiàn)出較完整的膜系統(tǒng).但葉面施磷處理下，葉綠體背向細胞壁拱起，葉綠體狹長消瘦，排列稀疏(圖3A)；根系施磷中，葉綠體大而飽滿，呈規(guī)則的橢圓狀，緊貼于細胞壁，排列緊密(圖3B)；不施磷處理中，葉綠體腫脹，由梭形或橢圓形變?yōu)榻雸A形，緊貼細胞壁，排列緊密(圖3C).

試驗持續(xù)至120 d，從杉木針葉的葉綠體亞細胞結(jié)構(gòu)來看，葉面施磷與根系施磷處理膜結(jié)構(gòu)變得模糊，片層結(jié)構(gòu)扭曲模糊且葉面施磷方式出現(xiàn)大而多的嗜鋨顆粒，分布密集(圖3D、3E)；不施磷處理葉綠體膜結(jié)構(gòu)與片層結(jié)構(gòu)均較為清晰，出現(xiàn)較多小而稀疏的嗜鋨顆粒(圖3F).從葉綠體的分布及數(shù)量來看，不施磷處理葉綠體結(jié)構(gòu)較為飽滿，但其與細胞壁分離，向細胞中心移動，數(shù)量較少(圖3I)，葉面施磷與根系施磷處理葉綠體緊貼細胞壁分布，與不施磷處理相比，其葉綠體數(shù)量更多，但出現(xiàn)不同程度的溶解現(xiàn)象，葉面施磷比根系施磷溶解更為嚴重(圖3G、3H).

A：葉面施磷后60 d；B：根系施磷后60 d；C：不施磷后60 d；D、G：葉面施磷后120 d；E、H：根系施磷后120 d；F、I：不施磷后120 d.圖3 不同試驗時間不同施磷方式對葉綠體超微結(jié)構(gòu)的影響Fig.3 Effect of P application methods on the ultrastructure of chloroplast in different experiment stages

2.4 不同施磷方式對杉木幼苗磷素分配的影響

雙因素方差分析結(jié)果(表4)表明，試驗持續(xù)時間對杉木根部磷素分配量的影響達到極顯著水平(P<0.01)，施磷方式對杉木根、葉及全株的磷素分配量的影響達極顯著水平(P<0.01)，而兩因素對葉、莖、葉部及全株磷素分配量的交互影響均未達到顯著水平(P>0.05).如圖4所示，試驗前期各處理對杉木各器官磷積累量的影響差異性均不顯著；在試驗后期，根系施磷處理的根部、莖部磷分配量及整株磷累積量顯著高于不施磷處理，葉面施磷處理的葉部磷分配量顯著高于不施磷處理.

表4 試驗持續(xù)時間和施磷方式對杉木磷素分配量的影響1)Table 4 Effect of P application time and method on P distribution pattern of Chinese fir

1)*,P<0.05;**,P<0.01;ns,P>0.05.

3 討論

葉片是植物進行光合作用的主要場所，光合速率是反映光合作用強弱的重要指標.陳智裕等[16]研究發(fā)現(xiàn)，在低磷或不供磷處理中，杉木幼苗的光合效率、蒸騰速率等指標明顯降低.根系增施磷肥能顯著提高水稻(Oryzasativa)的葉片凈光合速率與根莖葉部磷含量[17].與根系施肥相比，葉面施肥更高效，呂曉飛等[18]研究發(fā)現(xiàn)，葉面噴施磷酸二氫鉀能提高谷子(Setariaitalica)的凈光合速率.在本研究的試驗前期(苗木培養(yǎng)60 d)，葉面施磷、根系施磷、不施磷3種施磷方式對杉木幼苗的凈光合速率及蒸騰速率影響不大，而在試驗后期(苗木培養(yǎng)120 d)，葉面施磷與根系施磷凈光合速率、蒸騰速率顯著高于不施磷處理，這表明長期施磷處理對植物的凈光合速率及蒸騰速率具有促進作用[19].

不同小寫字母表示不同試驗時期不同施磷方式處理間差異顯著(P<0.05).圖4 不同試驗時期不同施磷方式對杉木磷素分配量的影響Fig.4 Effect of P application method on P distribution pattern of Chinese fir in the earlier and later stages of the trial

PSⅡ最大光學量子產(chǎn)量(Fv/Fm)是反應中心光能轉(zhuǎn)換效率的指標，表示植物受到逆境影響的程度[20]，本研究的試驗前期，不施磷處理的PSⅡ最大光學量子產(chǎn)量顯著低于葉面施磷與根系施磷處理，這說明施磷能提高植物的光能轉(zhuǎn)換效率，而在試驗后期，不施磷與葉面施磷處理的PSⅡ最大光學量子產(chǎn)量均顯著低于根系施磷處理，這表明長時間的葉面施磷與不施磷處理的PSⅡ反應中心均明顯遭受到損傷[21].從葉綠體形態(tài)結(jié)構(gòu)的完整性來分析，本研究發(fā)現(xiàn)，在葉面施磷處理下，杉木幼苗培養(yǎng)前期葉綠體結(jié)構(gòu)相對完整，但在試驗后期，由于磷素直接進入葉片，在葉肉細胞中逐漸富集，以致對葉綠體形成高磷脅迫，葉綠體出現(xiàn)了十分嚴重的溶解現(xiàn)象，造成葉綠體結(jié)構(gòu)破壞.這是由于葉綠體在進行正常代謝活動的同時，也會產(chǎn)生活性氧，正常情況下，葉綠體會調(diào)動自身酶系統(tǒng)對活性氧進行清除[22]，但在脅迫條件下會造成活性氧短時間內(nèi)大量增加，對葉綠體膜系統(tǒng)造成損傷[23-24].

研究表明，葉片是杉木重要的養(yǎng)分儲存庫[25]，葉面施磷能顯著提高植物葉部的磷分配量[26].當根系供磷時，由根系吸收的磷素營養(yǎng)依次滿足根、莖、葉的需求，運輸?shù)饺~時，磷的含量以大大減少，但若根部供應磷素過多，植物也會過量吸收，造成葉綠體的損傷[27].本試驗中，根系施磷顯著提高了植物各部位的磷吸收積累量[28]，但在試驗后期，葉綠體超微結(jié)構(gòu)也遭到輕微破壞，這與前人研究結(jié)果具有一致性[27].有趣的是，在不施磷處理中，葉綠體結(jié)構(gòu)相對完整，但葉綠體會脫離細胞壁，向細胞中心移動，這可能是葉綠體對低磷脅迫的一種響應機制[29].由于本研究中為保證不同處理中供K含量的一致性，在葉面施磷處理中采用噴施NaH2PO4溶液進行試驗，而其中Na+對植物的光合作用具有一定的刺激作用[30]，也有可能對葉綠體對低磷脅迫的形態(tài)生理學響應變化產(chǎn)生影響，這在今后研究中，應綜合分析各元素對植物光合生理的影響，以明確磷素在植物光合作用中扮演的角色，為供磷豐缺情況對葉片光合機理的影響機制提供更為科學的理論支撐.

4 結(jié)論

不同的施磷方式會對杉木幼苗光合系統(tǒng)造成不同的影響，葉面施磷與根系施磷方式均能促進葉部磷積累量，提高杉木幼苗的凈光合速率、蒸騰速率及最大光化學熒光效率，但過量的葉面施磷會造成葉綠體膜結(jié)構(gòu)受損，導致葉綠體溶解，葉綠體超微結(jié)構(gòu)破壞；低磷脅迫下葉綠體從細胞壁向細胞中心運動.今后應進一步研究葉面施磷濃度對植物光合作用的影響，以充分發(fā)掘葉綠體適應磷脅迫的響應機制，這對于指導林業(yè)生產(chǎn)實踐中合理施肥具重要意義.

致謝：福建農(nóng)林大學林學院何宗明研究員對本試驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計與分析給予了指導幫助；福建農(nóng)林大學林學院2017屆本科生吳其恒、林杉杉、向碩等同學參加盆栽及室內(nèi)分析工作，特此致謝！