楊世龍，馬小芳

(南京林業(yè)大學(xué) 現(xiàn)代分析測試中心，江蘇 南京 210037)

銀杏內(nèi)酯化合物是銀杏葉特有的成分，目前在其他植物中尚未發(fā)現(xiàn)。銀杏內(nèi)酯屬于萜類化合物，主要包括銀杏內(nèi)酯A、B、C、J、M和白果內(nèi)酯，其中銀杏內(nèi)酯A、B、C、J、M屬于二萜類化合物，白果內(nèi)酯為倍半萜化合物[1](見圖1)。銀杏內(nèi)酯也是銀杏葉提取物中的一類主要成分，具有拮抗血小板活化因子的作用，可以用來保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)、治療老年癡呆、中風(fēng)；具有抗炎癥作用，可以用來治療器官移植、缺血再灌注等引起的炎癥，以及其他各種炎癥[2～5]；此外還具有抑制細(xì)胞凋亡、抗癌等作用[6～7]。目前，含有銀杏內(nèi)酯的藥物越來越受到人們的重視，銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液、銀杏達(dá)莫注射液、銀杏內(nèi)酯注射液，舒血寧注射液、銀杏葉片及其注射液等藥物已廣泛用于治療心腦血管疾病。但是，由于銀杏萜內(nèi)酯在銀杏葉中含量低，提取過程復(fù)雜，產(chǎn)量低，純度低，所以銀杏內(nèi)酯類的藥物價格相對較高。為進(jìn)一步提高銀杏內(nèi)酯產(chǎn)量和質(zhì)量，降低成本，讓更多的患者用得起，本文總結(jié)了一些銀杏萜內(nèi)酯的提取、分離和檢測方法，以期為銀杏內(nèi)酯的產(chǎn)業(yè)化提供參考。

圖1 銀杏內(nèi)酯A、B、C、J、M和白果內(nèi)酯

1 銀杏內(nèi)酯的提取分離

銀杏內(nèi)酯雖含有羥基，但由于結(jié)構(gòu)復(fù)雜，一般不溶于水，易溶于有機溶劑，故常用有機試劑作為提取試劑，常見的提取方法有：有機溶劑回流法、超聲波輔助提取法、微波輔助提取法。此外，還有超臨界提取法、閃式提取法、生物合成法等。

1.1 有機溶劑回流法

有機溶劑回流法常用于天然產(chǎn)物的提取，根據(jù)銀杏內(nèi)酯的溶解性，常常選用甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯等有機試劑作為提取試劑，有時使用它們的混合溶劑，效果會更好些。冷平生[8]等考察了甲醇、乙醇和丙酮水溶液對銀杏內(nèi)酯的提取效果，發(fā)現(xiàn)甲醇和丙酮的水溶液提取效果較好，而乙醇水溶液提取效果較差，并進(jìn)一步優(yōu)化了不同濃度的甲醇水溶液作為提取劑，發(fā)現(xiàn)甲醇濃度大時，提取物中雜質(zhì)較多，甲醇濃度過小時，銀杏內(nèi)酯的提取率過低，最終優(yōu)化得到20%甲醇水溶液的提取效果最好。有機溶劑回流法提取銀杏內(nèi)酯具有操作簡便，成本低等優(yōu)點，但是往往所得提取物中成分復(fù)雜，銀杏內(nèi)酯的含量相對較低，而其他方法相對較好。

1.2 超聲波、微波輔助提取法

超聲波具有機械效應(yīng)，空化效應(yīng)和熱效應(yīng)，能增大分子的運動，使有機試劑分子快速進(jìn)入到銀杏葉中，將有效成分快速溶解出來。同樣，微波通過其波動性、高頻性、熱特性和非熱特性，使銀杏葉中有效成分快速溶解出來。超聲波和微波輔助提取法都具有提取效率高、有機溶劑用量少、溫度低等優(yōu)點，很適合天然產(chǎn)物的提取。戴余軍等[9]研究了超聲波輔助提取銀杏葉內(nèi)酯的工藝，發(fā)現(xiàn)超聲波的功率和超聲時間對銀杏內(nèi)酯的提取率影響較大，當(dāng)超聲功率為360 W，超聲時間為10 min時，銀杏內(nèi)酯提取率可達(dá)0.535%，功率過大或者時間過長容易造成銀杏內(nèi)酯分解，提取率反而會降低。朱興一等[10]對微波輔助提取銀杏葉中內(nèi)酯的工藝進(jìn)行優(yōu)化，采用單因素實驗法和正交實驗法對提取銀杏內(nèi)酯的工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到的最佳提取工藝條件是：在500 W的功率下，用70%的乙醇水溶液，提取8 min，液固比為20∶1，此條件下得到的銀杏內(nèi)酯提取率為1.620 mg·g-1，提取效率和提取率明顯比有機溶劑回流法好。吳昊等[11]將超聲波輔助提取法和微波輔助提取法相結(jié)合，研究了超聲波-微波協(xié)同提取銀杏內(nèi)酯B的工藝參數(shù)，設(shè)置超聲功率為50 W，微波功率為300 W，微波協(xié)同運行時間為40 s，在此條件下，優(yōu)化得到銀杏內(nèi)酯B的最佳提取工藝為：以70%的乙醇溶液在50 ℃下提取4 min，液固比為20∶1，銀杏內(nèi)酯B的得率高達(dá)0.81%。相比單一的超聲波輔助提取法或者微波提取法，超聲波-微波協(xié)同提取法效率更好，提取效果更好。

1.3 超臨界提取法

超臨界提取法是利用處于超臨界狀態(tài)的溶劑具有氣體和液體的雙重性質(zhì)的特點來分離和純化混合物[12]。超臨界提取法常用的溶劑為CO2，因為CO2具有無毒、無溶劑殘留，提取效率高，而且CO2的超臨界狀態(tài)在較低的情況就可以達(dá)到，能耗低，已廣泛用于植物中有效成分的提取。潘炘等[13]采用超臨界CO2提取法研究了銀杏內(nèi)酯提取率隨著提取時間的動態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)在0～20 min總銀杏內(nèi)酯含量較高，而銀杏內(nèi)酯A的含量在60 min～80 min達(dá)到最大，銀杏內(nèi)酯B和銀杏內(nèi)酯C的含量在40 min～60 min達(dá)到最大，因此可以根據(jù)需要，通過改變提取時間來獲得不同比例的銀杏內(nèi)酯。近年來，亞臨界提取法也逐漸用于天然產(chǎn)物的提取，李文東等[14]采用亞臨界水提法，從銀杏葉中提取銀杏內(nèi)酯，采用單因素實驗和正交實驗優(yōu)化得到亞臨界水提法的最佳工藝：在180℃下提取3次，每次30 min，固液比為1∶25，在此條件下，銀杏內(nèi)酯的提取率0.4623%。

1.4 閃式提取法

閃式提取法利用高速的機械剪切力和攪拌力，在短時間內(nèi)將植物的花、莖、葉等組織打碎，讓組織內(nèi)的有效成分迅速與有機溶劑接觸，并達(dá)到平衡[15]。通常情況，閃式提取不需加熱，并且使用溶劑少，時間短，效率較高。王平等[16]采用正交實驗研究了閃式提取法提取銀杏內(nèi)酯的工藝條件，認(rèn)為在銀杏葉粒徑為50目時，用60%的乙醇提取5 min，固液比1∶20，在此條件下，銀杏內(nèi)酯的提取率為1.712 mg·g-1。

1.5 生物合成法

隨著生物技術(shù)的發(fā)展，利用菌株生產(chǎn)天然產(chǎn)物的研究越來越多，近年來，學(xué)者從銀杏的根、莖中分離得到的曲霉屬、盤長孢屬、孢霉屬菌株，尖孢鐮刀菌，色串孢屬和組絲菌屬等真菌均能生產(chǎn)銀杏內(nèi)酯及其類似物[17-19]。陳小明等[20]從銀杏的根、莖中分離得到了116種內(nèi)生真菌，并篩選得到了能生產(chǎn)銀杏內(nèi)酯的真菌，該真菌屬于毛霉屬。利用菌類生產(chǎn)銀杏內(nèi)酯具有產(chǎn)量高、成分單一等優(yōu)點，應(yīng)用前景較好。

盡管超聲波、微波輔助提取法，超臨界提取法和閃式提取法的提取率高，雜質(zhì)少，后處理方便，但是其成本高，尤其是超臨界提取法需要特殊的設(shè)備，產(chǎn)業(yè)化的成本高。生物合成法是一種新興的技術(shù)，可以通過微生物發(fā)酵的方法得到單一的內(nèi)酯，發(fā)展前景很好。雖然有機溶劑回流法是傳統(tǒng)的提取方法，采用此法得到的產(chǎn)物雖然含有較多雜質(zhì)，但此法所用儀器設(shè)備簡單，易于工業(yè)化，在優(yōu)化溶劑的基礎(chǔ)可以得到不錯的結(jié)果。但無論采用哪種方法得到的銀杏內(nèi)酯都需要進(jìn)一步純化，才能得到合格的內(nèi)酯產(chǎn)品。

2 銀杏萜類內(nèi)酯的分離純化

由于銀杏萜內(nèi)酯在銀杏葉中含量低，提取液中內(nèi)酯含量也不是很高，需要進(jìn)一步分離純化。常用的分離純化方法有柱色譜法，萃取，結(jié)晶等方法。

2.1 柱色譜法

柱色譜法常常用來分離提純化合物，常用來分離的填料有硅膠、大孔樹脂、氧化鋁等，同樣，這些填料也通常用于分離純化銀杏內(nèi)酯類化合物。硅膠和大孔樹脂柱常用來分離純化銀杏內(nèi)酯和銀杏黃酮，而氧化鋁柱子對銀杏黃酮吸附較大，常用來制備銀杏內(nèi)酯。王永剛等[21]采用閃式硅膠柱層析法將銀杏葉提取物中的黃酮和內(nèi)酯分開，發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯可以將銀杏內(nèi)酯從柱上洗脫下來，且損失較小，為銀杏內(nèi)酯的分離純化提供了新方法。韓金玉等[22]考察了AB-8 、DM-130 、D4020、ABD-4和NKA-9 5種大孔樹脂對銀杏內(nèi)酯的動態(tài)吸附，發(fā)現(xiàn)AB-8型號的大孔樹脂對銀杏內(nèi)酯的吸附和解析附較好，是提純銀杏內(nèi)酯最佳的填料。李新崗等[23]將含銀杏內(nèi)酯為6%銀杏葉提取物過氧化鋁柱，用乙醇洗脫，洗脫液經(jīng)濃縮、加水析出白內(nèi)酯色晶體，經(jīng)液相色譜檢測，內(nèi)酯含量高達(dá)95%。

2.2 溶劑萃取法

溶劑萃取法是根據(jù)銀杏內(nèi)酯在兩相溶劑中的分配系數(shù)不同，在其中的一相中分配系數(shù)大，溶解度大，而再另一相中分配系數(shù)小，溶解度小，當(dāng)兩相分離時，就達(dá)到分離銀杏內(nèi)酯的目的。通常，將銀杏葉提取物混懸于水中，采用合適的有機溶劑萃取，濃縮含有銀杏內(nèi)酯的有機溶劑，得到含量較高的銀杏內(nèi)酯。王成章等[24]采用乙酸乙酯、丁酮、環(huán)己酮、乙醚等不同的溶劑萃取銀杏葉提取液中的銀杏內(nèi)酯，并通過調(diào)節(jié)pH值、增加鹽濃度的方法提高溶液的相密度，發(fā)現(xiàn)，在此條件下，乙酸乙酯萃取效果最好，可以將銀杏內(nèi)酯的濃度富集到35%～40%。

2.3 結(jié)晶法

重結(jié)晶是提純化合物的常用手段。陳凡等[25]將含6.14%內(nèi)酯的銀杏葉提取物用乙酸乙酯萃取，萃取物用乙醇溶解后加入正己烷，讓銀杏內(nèi)酯析出，最后用熱的乙醇溶解，在低溫下重結(jié)晶，得到的銀杏內(nèi)酯純度大于95%。

2.4 其他方法

由于銀杏內(nèi)酯結(jié)構(gòu)相似，采用上述方法很難得到銀杏內(nèi)酯單體。隨著分子烙印技術(shù)的發(fā)展，選擇性地純化某一種銀杏內(nèi)酯成為現(xiàn)實。郭文生等[26]采用分子烙印技術(shù)，制備了能識別銀杏內(nèi)酯C的烙印聚合物，大大提高銀杏內(nèi)酯C的純度。

在分離純化銀杏內(nèi)酯的過程中，往往一種方法分離、純化后所得內(nèi)酯含量不是很高，需要將幾種分離純化方法聯(lián)合使用。柱色譜法、溶劑萃取法和結(jié)晶法都是常用的方法，將其中的兩種或者3種結(jié)合，會得到純度更高的銀杏內(nèi)酯。郁青等[27]將柱色譜法和萃取法相結(jié)合，對銀杏葉提取物進(jìn)行精制，得到含量高達(dá)70%的銀杏內(nèi)酯制品。樓鳳昌等[28]采用柱色譜法和重結(jié)晶得到純度較高的總銀杏內(nèi)酯，然后采用制備液相得到了6個銀杏內(nèi)酯的單體，將銀杏內(nèi)酯分離。此外，高速逆流色譜(HSCCC)技術(shù)的發(fā)展使得從復(fù)雜天然產(chǎn)物中提純單一組分成為可能，HSCCC是一種新型的液-液分配技術(shù)，固定相和流動相都是液體，避免了不可逆吸附，具有樣品損失少、快速和制備量大等優(yōu)點。蘇靜等[29]結(jié)合萃取法和柱色譜法得到銀杏內(nèi)酯的粗品后，以4∶5∶3∶5比例的己烷-醋酸乙酯-甲醇-水作為溶劑系統(tǒng)，采用HSCCC法得到白果內(nèi)酯、銀杏內(nèi)酯A和銀杏內(nèi)酯B的單體，純度均在98%以上；再以2∶6∶3∶5比例的己烷-醋酸乙酯-甲醇-水作為溶劑系統(tǒng)可以得到銀杏內(nèi)酯C的單體，純度最高可達(dá)98%。由此可以發(fā)現(xiàn)，聯(lián)用技術(shù)可以有效提高總銀杏內(nèi)酯的純度，并根據(jù)需要，采用高速逆流色譜、制備液相等技術(shù)可以制得銀杏內(nèi)酯的單體。

3 銀杏內(nèi)酯的檢測方法

銀杏內(nèi)酯類化合物由于紫外吸收弱，無法像黃酮類化合物用紫外檢測，常用來檢測銀杏內(nèi)酯類化合物的方法有高效液相色譜法、氣相色譜法、質(zhì)譜法、紅外光譜法等。

3.1 高效液相色譜法

高效液相色譜法(HPLC)是檢測銀杏內(nèi)酯的常用方法，色譜柱有正相柱和反相柱，檢測器常用示差折光檢測器(RID)和蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)。秦燕等[30]采用HPLC-RID法優(yōu)化了銀杏內(nèi)酯A、B、C和白果內(nèi)酯的檢測方法，使得銀杏內(nèi)酯的峰達(dá)到基線分離，并采用外標(biāo)法繪制了標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性關(guān)系較好，可以用來定量。張亞中等[31]采用HPLC-ELSD法測定了銀杏葉膠囊中內(nèi)酯的含量，實驗采用C18柱，正丙醇-四氫呋喃-水(1∶15∶84)為流動相；蒸發(fā)光散射檢測器的漂移管溫度115 ℃，也得到了滿意的結(jié)果。

3.2 氣相色譜法

銀杏內(nèi)酯也可以用氣相色譜進(jìn)行檢測，一般用N2將銀杏內(nèi)酯分離，采用示差折光檢測器或氫火焰離子化檢測器進(jìn)行檢測。劉紅梅等[32]研究了毛細(xì)管柱氣相色譜-氫火焰離子化檢測器對銀杏內(nèi)酯進(jìn)行分離檢測，并以角鯊?fù)闉閮?nèi)標(biāo)物，對銀杏葉提取物中的銀杏內(nèi)酯進(jìn)行定量檢測。廖詠玲等[33]采用大口徑毛細(xì)管氣相色譜-火焰離子化檢測器對銀杏葉提取物中的銀杏內(nèi)酯A、銀杏內(nèi)酯B、銀杏內(nèi)酯C和白果內(nèi)酯進(jìn)行了分離與測定，通過優(yōu)化溫度等條件，優(yōu)化了檢測方法，使其分離效果較好，檢測時間更短，為分析和檢測銀杏內(nèi)酯提供了參考。

3.3 質(zhì)譜檢測法

質(zhì)譜檢測根據(jù)分子量檢測待測物質(zhì)的含量，具有準(zhǔn)確度高，靈敏度高等優(yōu)點。由于銀杏內(nèi)酯分子量偏大，很難氣化，一般采用液質(zhì)聯(lián)用進(jìn)行檢測，不能直接進(jìn)行氣質(zhì)聯(lián)用檢測。Mauri[34]采用液質(zhì)聯(lián)用對銀杏葉提取物中銀杏內(nèi)酯A、B、C、J和白果內(nèi)酯進(jìn)行分離和檢測，采用電噴霧離子源，正離子模式，噴霧壓力為2 700 Torr，溫度為300 ℃，可以準(zhǔn)確地測定各個銀杏內(nèi)酯的含量，檢測限可達(dá)10 pg。陳學(xué)國等[35]用全二維液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜，采用大氣壓電離離子源，對銀杏葉提取物中的內(nèi)酯和黃酮成分進(jìn)行分離鑒定，檢測并鑒定了銀杏內(nèi)酯B、銀杏內(nèi)酯C和白果內(nèi)酯。

3.4 紅外光譜檢測法

紅外光譜檢測法是利用銀杏內(nèi)酯類化合物的羰基的特征吸收峰，根據(jù)羰基吸收峰面積的變化來對樣品中總內(nèi)酯進(jìn)行定性和定量分析。姚評佳等[36]用紅外法測定了銀杏葉提取物中的總內(nèi)酯含量，研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)酯類化合物的特征吸收峰在1 840 cm-1～1 726 cm-1范圍內(nèi)，以銀杏內(nèi)酯B為標(biāo)準(zhǔn)品，在5 μg·100 mg-1KBr～100 μg·100 mg-1KBr范圍內(nèi)，銀杏內(nèi)酯B在1 840 cm-1～1 726 cm-1范圍內(nèi)的峰面積和其含量線性關(guān)系較好，可以作為定量分析的依據(jù)，并以此測定了樣品中銀杏內(nèi)酯的含量，結(jié)果與高效液相色譜法接近，但此法更方便快捷。

3.5 其他檢測方法

張渝陽等[37]采用分光光度計法測定了銀杏萜內(nèi)酯的含量，其主要原理是利用銀杏內(nèi)酯在弱堿性條件下和三價鐵離子形成萜內(nèi)酯-羥肟酸鐵配合物，該配合物在514 nm處有一最大吸收峰，利用此峰強度的變化即可對銀杏內(nèi)酯進(jìn)行定性和定量檢測。實驗發(fā)現(xiàn)，該法在45 μg·mL-1～450 μg·mL-1范圍內(nèi)服從比耳定律，線性關(guān)系良好，其定量分析結(jié)果與HPLC法一致，可用于樣品中銀杏內(nèi)酯含量的測定。此外，核磁共振法也可以對銀杏內(nèi)酯類化合物進(jìn)行定性和定量分析，Choi等人[38]利用核磁共振氫譜對銀杏內(nèi)酯進(jìn)行定量檢測，以間苯三酚為內(nèi)標(biāo)物，將樣品用氘代丙酮和氘代苯的混合溶劑溶解(體積比1∶1)，根據(jù)內(nèi)酯12-H的峰面積來對內(nèi)酯含量進(jìn)行測定，該法不需要對樣品前處理，更加方便。

雖然對銀杏內(nèi)酯定性、定量檢測的方法較多，但是常用來檢測銀杏內(nèi)酯的方法是HPLC法，常用ELSD作為檢測器，此法檢測更準(zhǔn)確、穩(wěn)定性、重復(fù)性更好[39]，已成為國內(nèi)、國外藥典采用的方法。

4 展望

由于銀杏萜內(nèi)酯的諸多生物活性，制藥行業(yè)對銀杏內(nèi)酯需求量越來越大，銀杏內(nèi)酯的量產(chǎn)已迫在眉睫。雖然銀杏內(nèi)酯的提取分離的方法很多，但目前為止沒有適合工業(yè)化生產(chǎn)的工藝，因此，在今后的研究中應(yīng)從以下幾方面進(jìn)一步開發(fā)銀杏內(nèi)酯的量產(chǎn)工藝。

(1)擴(kuò)大銀杏葉GAP基地建設(shè)規(guī)模。按照《中藥材生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》(GAP)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)種植、管理銀杏資源，從源頭保證銀杏葉質(zhì)量，從而保證銀杏葉中內(nèi)酯的含量和質(zhì)量。

(2)優(yōu)化銀杏內(nèi)酯提取工藝。目前便于工業(yè)化提取銀杏內(nèi)酯的方法為有機溶劑回流法，但影響因素較多，需要進(jìn)一步優(yōu)化適合大規(guī)模工業(yè)化的工藝條件。其他提取方法提取效果雖好，但受儀器設(shè)備限制，導(dǎo)致產(chǎn)量低，因此，進(jìn)一步研究開發(fā)適合量產(chǎn)的儀器設(shè)備也顯得很重要。

(3)優(yōu)化銀杏內(nèi)酯純化工藝。柱色譜法是純化銀杏內(nèi)酯最有效的方法，是目前大量生產(chǎn)銀杏內(nèi)酯的主要方法，但是如何提高生產(chǎn)效率有待進(jìn)一步研究，可以從填料開發(fā)、上樣濃度、流速等方面著手。此外，制備銀杏內(nèi)酯單體也是一項極為有意義的工作。

(4)優(yōu)化檢測手段。目前，銀杏內(nèi)酯公認(rèn)的檢測方法是HPLC-ELSD法，該法對儀器的性能要求較高，需要優(yōu)化的參數(shù)較多，因此，在優(yōu)化現(xiàn)有檢測方法的同時，可以開發(fā)其他檢測方法，例如，質(zhì)譜法，核磁共振法都是檢測內(nèi)酯的有效手段。

總之，銀杏內(nèi)酯的量產(chǎn)還有很多工作要做，作為銀杏資源大國，銀杏深加工還相對落后，許多關(guān)鍵技術(shù)還有待突破，應(yīng)大力支持銀杏產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。