陳 浩 ，李新方，孫 渺，張 鋼，楊 峰

(1.解放軍總醫(yī)院海南分院藥劑科，海南 三亞 572013； 2.海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院，上海 200433；3.陸軍軍醫(yī)大學(xué)高原軍事醫(yī)學(xué)系高原醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400038)

大蒜是百合科植物大蒜AlliumsativumL.的鱗莖，具有抗菌消炎、降血糖、抗疲勞、防治腫瘤等多種功效[1-3]。近期研究發(fā)現(xiàn)，大蒜皂苷具有顯著的抗缺氧活性，在缺氧引起的急、慢性高原病及其他相關(guān)疾病動(dòng)物模型中表現(xiàn)出良好療效，可能成為一種有效的高原抗缺氧藥物[4-5]。大蒜皂苷為甾體皂苷，1982年Smoczkiewicz在大蒜提取物中檢測(cè)到甾體皂苷至今，科學(xué)家已經(jīng)從大蒜提取物中分離鑒定了20種甾體皂苷，其中大蒜皂苷PIEB是大蒜的主要活性成分之一，具有較強(qiáng)的抗缺氧活性[6]。目前未見大蒜皂苷PIEB相關(guān)藥動(dòng)學(xué)研究的報(bào)道，對(duì)其含量分析的研究報(bào)道也較少。為了獲得大蒜皂苷提取物中皂苷成分在生物體內(nèi)的藥動(dòng)力學(xué)參數(shù)，本研究以PIEB為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，建立了LC-MS/MS法測(cè)定大鼠血漿中大蒜皂苷PIEB的含量方法，并研究了其體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)過程，以期為大蒜皂苷提取物，特別是PIEB的合理開發(fā)和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)[7-8]。

1 儀器與材料

1.1 儀器

高效液相色譜儀(色譜柱：Athena C18-WP，50 mm×2.1 mm,3 μm，美國Waters公司)；TSQ Quantum三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀，配ESI源(美國Thermo公司)；臺(tái)式冷凍離心機(jī)(MIKRO200R，Hettich)；超聲波清洗機(jī)(SK2004，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)；氮吹儀(SBH130D，Stuaet)；IKA振蕩器(VXR basic，IKA-Werke)；分析天平(AL104，梅特勒托利多儀器有限公司)。

1.2 試劑

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康清潔級(jí)SD大鼠24只，體重200～230 g，雌雄各半，海軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK(滬)2015-0028。室溫控制在22～28℃，相對(duì)濕度為(50±10)%，12 h晝夜節(jié)律照明，自由飲水，飼養(yǎng)1周。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分析條件

2.1.1色譜條件

Athena C18-WP色譜柱(50 mm×2.1 mm,3 μm)，柱溫25℃；流動(dòng)相A為水-乙腈(99∶1，0.05%甲酸)，B為乙腈-水(99∶1，0.05%甲酸)。梯度洗脫：0～6 min，10%～40%B；6～7 min，40% ～90%B；7～9 min，90%～10%B；流速：0.3 ml/min；進(jìn)樣量：10 μl。

2.1.2質(zhì)譜條件

采用負(fù)離子SRM工作模式；離子源為ESI源；噴霧電壓為3 000 V；加熱溫度為200℃；毛細(xì)管溫度300℃；鞘氣流速12 L/min；輔助氣流速3 L/min；PIEB的離子對(duì)m/z:1 259.04→1 097.70。

2.2 樣品的配制及處理

PIEB標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：精密稱取 PIEB 0.01 g置10 ml容量瓶中，用少量50%甲醇水溶液超聲溶解，定容至刻度，制成儲(chǔ)備液，濃度為1 mg/ml，于冰箱(-20℃)冷凍備用。

我國競(jìng)爭(zhēng)中立制度的具體實(shí)踐在上海自貿(mào)區(qū)條例中有所體現(xiàn)?！吨袊?上海)自由貿(mào)易試驗(yàn)區(qū)條例》(以下簡(jiǎn)稱《條例》)中?第四十七條明確規(guī)定了各類市場(chǎng)主體在自貿(mào)試驗(yàn)區(qū)內(nèi)，在監(jiān)管、稅收和政府采購方面享有公平待遇，這實(shí)際上就是OECD提出的競(jìng)爭(zhēng)中立制度所包含監(jiān)管中立、稅收中立、政府采購中立等內(nèi)容。但這并不意味著我國競(jìng)爭(zhēng)中立政策僅強(qiáng)調(diào)公平競(jìng)爭(zhēng)，我國競(jìng)爭(zhēng)中立還包含了自由競(jìng)爭(zhēng)的目標(biāo)，自由競(jìng)爭(zhēng)的目標(biāo)更多被規(guī)定在我國競(jìng)爭(zhēng)法中。同時(shí)，《條例》是在法治環(huán)境章節(jié)具體規(guī)定競(jìng)爭(zhēng)中立制度的，這不僅強(qiáng)調(diào)了競(jìng)爭(zhēng)中立制度的法律權(quán)威性，也表現(xiàn)出競(jìng)爭(zhēng)中立作為自貿(mào)區(qū)基本價(jià)值尺度的地位。?

PIEB標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋液：精密吸取100 μl PIEB儲(chǔ)備液、900 μl 10%甲醇水溶液，混勻，得100 μg/ml PIEB標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋液。

PIEB標(biāo)準(zhǔn)液：精密吸取243 μl PIEB標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋液、757 μl 10%甲醇水溶液，置1.5 ml尖底EP管中，渦旋混勻，濃度為24.3 μg/ml；精密吸取100 μl PIEB標(biāo)準(zhǔn)液、200 μl 10%甲醇水溶液，置1.5 ml尖底EP管中，渦旋混勻，依法逐級(jí)稀釋，得濃度為8 100、2 700、900、300、100 ng/ml系列標(biāo)準(zhǔn)液。

PIEB血漿標(biāo)準(zhǔn)樣品的配制：精密吸取10 μl PIEB標(biāo)準(zhǔn)液、90 μl空白血漿，混勻，得濃度為10、30、90、270、810、2 430 ng/ml系列血漿標(biāo)準(zhǔn)樣品。

大蒜皂苷總提取物溶液的配制：精密稱取大蒜皂苷總提取物0.50 g置500 ml容量瓶中，適量50%甲醇水溶液超聲溶解，定容至刻度，制成濃度為1 mg/ml的儲(chǔ)備液，于冰箱(-20℃)冷凍備用。

2.3 大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)試驗(yàn)

取24只健康SD大鼠，隨機(jī)分成4組，每組6只，雌雄各半。給藥前12 h禁食不禁水，給藥后4 h恢復(fù)進(jìn)食。灌胃給藥試驗(yàn)組包括低劑量組(50 mg/kg)、中劑量組(100 mg/kg)以及高劑量組(200 mg/kg)；靜脈給藥試驗(yàn)組統(tǒng)一為單劑量給藥(50 mg/kg)。按照預(yù)先設(shè)計(jì)的時(shí)間點(diǎn)由大鼠眼底靜脈叢采血約0.2 ml，收集在肝素抗凝的1.5 ml EP管中。灌胃給藥采血時(shí)間點(diǎn)為：給藥后5、15、30 min及1、6、8、11、24 h；靜脈給藥采血時(shí)間點(diǎn)為：給藥時(shí)(0 min)和給藥后5、15、30 min及1、6、8、11、24 h。

2.4 血漿樣品的處理

精密吸取血漿樣品100 μl，加入400 μl甲醇，立即渦旋10 s混勻，離心10 min(10 000 r/min，4℃)后吸取上清液400 μl，35℃下氮?dú)獯蹈桑?00 μl 10%甲醇水溶液復(fù)溶，渦旋混勻后離心10 min(10 000 r/min，4℃)，取上清液，LC-MS/MS進(jìn)樣分析。

2.5 血藥濃度數(shù)據(jù)分析與計(jì)算

PIEB的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)采用InnaPhase Kinetica2000TM軟件(美國)分析處理，并計(jì)算相關(guān)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。cmax為最大血藥濃度，血藥濃度-時(shí)間曲線下面積AUC(0→t)由梯形法計(jì)算得到，tpeak為給藥后血藥濃度達(dá)峰時(shí)間。

3 結(jié)果與討論

3.1 方法學(xué)考察

3.1.1專屬性與特異性

分別取大鼠空白血漿、大鼠空白血漿與PIEB標(biāo)準(zhǔn)樣品混合物以及給予大蒜皂苷總提取物后的大鼠血漿，按照“2.4”項(xiàng)下操作處理。在“2.1”項(xiàng)分析條件下，PIEB的色譜保留時(shí)間為3.9 min，色譜分析時(shí)間為9 min。給藥前空白血漿未檢測(cè)到PIEB，表明大鼠血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)PIEB的分析無干擾。大鼠的空白血漿、PIEB血漿標(biāo)準(zhǔn)品以及大蒜皂苷總提取物給藥后血漿色譜圖見圖1。

3.1.2線性范圍與靈敏度

取“2.2”項(xiàng)下PIEB血漿標(biāo)準(zhǔn)樣品，按“2.4”項(xiàng)下操作處理，進(jìn)樣分析。以PIEB峰面積Y對(duì)濃度X繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得到相應(yīng)的相關(guān)系數(shù)r值。另取10 ng/ml PIEB血漿標(biāo)準(zhǔn)樣品，按“2.4”項(xiàng)下操作處理，進(jìn)樣分析，平行操作6份，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算測(cè)得濃度，并計(jì)算定量下限(LLOQ)的準(zhǔn)確度與精密度：線性范圍10～2 430 ng/ml；標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，Y=-528.677+163.38X(r=0.999 8)，線性關(guān)系良好；LLOQ為10 ng/ml時(shí)，RSD為6.60%，準(zhǔn)確度為105.57%。

3.1.3精密度與準(zhǔn)確度

分別用大鼠空白血漿配制低、中、高3個(gè)濃度的PIEB血漿標(biāo)準(zhǔn)樣品，按“2.4”項(xiàng)下操作處理，每個(gè)濃度每日重復(fù)6次，連續(xù)3 d進(jìn)樣，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，分

別計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)樣品的測(cè)得濃度，以其標(biāo)示濃度為參照，計(jì)算測(cè)定方法的準(zhǔn)確度和日內(nèi)、日間精密度，結(jié)果見表1，表明日內(nèi)和日間精密度均<15%，準(zhǔn)確度在85%～115%之間。

圖1 空白血漿(A)、空白血漿+大蒜皂苷PIEB對(duì)照品(B)、給藥后10 min的血漿樣品(C)的色譜圖 1.大蒜皂苷PIEB

血漿樣品PIEB濃度(ρB/ng·ml-1)日內(nèi)測(cè)得濃度(ng/ml)精密度(RSD,%)準(zhǔn)確度(%)日間測(cè)得濃度(ng/ml) 精密度(RSD ,%)準(zhǔn)確度(%)2021.01±1.577.48105.0620.11±0.452.25100.53200201.00±4.362.17100.50203.84±4.412.16101.922 0002 124.80±31.491.48106.242 132.73±50.772.38106.64

3.1.4樣品穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

分別配制20、200、2 000 ng/ml 3種濃度PIEB血漿標(biāo)準(zhǔn)樣品，每個(gè)樣品各平行操作6份，分別考察上述樣本在4℃、25℃保存12 h，反復(fù)凍融3次的穩(wěn)定性。所測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確度在90%～110%范圍內(nèi)，RSD均<5%，表明PIEB血漿樣品在4℃及室溫下保存12 h后穩(wěn)定，經(jīng)3次反復(fù)凍融后不受影響。

3.1.5提取回收率與基質(zhì)效應(yīng)

取6份不同來源的空白大鼠血漿，按“2.4”項(xiàng)下方法處理后，分別加入低、中、高3種濃度PIEB標(biāo)準(zhǔn)液溶液復(fù)溶，分別進(jìn)樣，所記錄的峰面積為分子；取對(duì)應(yīng)濃度的PIEB對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)液分別進(jìn)樣，所記錄的峰面積為分母；計(jì)算大蒜皂苷PIEB的基質(zhì)因子。結(jié)果顯示低、中、高3個(gè)濃度的基質(zhì)效應(yīng)提取回收率分別為77.86%、67.87%和70.71%，RSD≤8.69%(n=6)，表明該方法無明顯的離子效應(yīng)。取低、中、高3種濃度PIEB，按“2.4”項(xiàng)下處理后，分別進(jìn)樣，所記錄的峰面積為分子；取空白血漿，按“2.4”項(xiàng)下處理后，分別加入對(duì)應(yīng)濃度的PIEB標(biāo)準(zhǔn)液復(fù)溶，進(jìn)樣后的峰面積為分母，計(jì)算大蒜皂苷PIEB的提取回收率，結(jié)果顯示低、中、高3種濃度大蒜皂苷PIEB在血漿樣品中的提取回收率分別為75.92%、82.13%和80.25%，RSD≤4.60%(n=6)。

3.2 PIEB在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)

3.2.1大鼠靜脈注射大蒜皂苷提取物后PIEB的藥動(dòng)學(xué)

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算大鼠靜脈注射大蒜皂苷提取物后，PIEB的濃度，并繪制平均血藥濃度-時(shí)間曲線(圖2)。

圖2 大鼠靜脈注射大蒜皂苷提取物后PIEB的平均藥-時(shí)曲線

所得數(shù)據(jù)經(jīng)軟件分析擬合，以非房室模型計(jì)算得到t1/2、AUC、cmax等藥動(dòng)學(xué)參數(shù)(表2)。結(jié)果表明，大鼠靜脈注射大蒜皂苷提取物后，PIEB即刻在

體內(nèi)達(dá)到最大血藥濃度，t1/2為322 min左右，平均駐留時(shí)間(MRT)為270 min。

3.2.2大鼠灌胃大蒜皂苷提取物后PIEB的藥動(dòng)學(xué)

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算大鼠灌胃大蒜皂苷提取物后PIEB的濃度，并繪制平均血藥濃度-時(shí)間曲線(圖3)，所得數(shù)據(jù)經(jīng)軟件分析擬合，以非房室模型計(jì)算得到t1/2、AUC、cmax等藥動(dòng)學(xué)參數(shù)(表2)。給予SD大鼠灌胃低、中、高濃度大蒜皂苷提取物后，PIEB的AUC、cmax等隨給藥劑量的增加而增大，可初步判定大蒜皂苷PIEB在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)過程屬于線性動(dòng)力學(xué)過程。

圖3 大鼠灌胃大蒜皂苷提取物后PIEB的平均藥-時(shí)曲線

參數(shù)靜脈注射(50 mg/kg)灌胃給藥(mg/kg)50100200cmax(ng/L)26 364±1 34314.8±3.845.2±57.9134.1±47.2tmax(t/min)—31±4468±9418±14t1/2(t/min)322.4 ±105.5763 ±1 1221 064±7292 191±2 243CL[ml/(min·kg)]30.3±12.913 730±9 82512 570±12 14810 001±8 524V(ml/kg)6 750±1 0624 710 517±1 331 7826 665 925±1 853 14711 895 277±7 931 275MRT(t/min)270±167938±1 5001 267±1 0612 915±3 085AUC(0-t)(ng·min /ml)1 922 048±933 6891 753±5043 688±9769 504±5 295AUC(0-∞)(ng·min /L)2 008 232±1 065 882 7 710±9 76116 992±12 99836 324±26 108

注：V為表觀分布容積

4 討論

筆者在實(shí)驗(yàn)中處理血漿樣品時(shí)，曾采用甲醇、乙腈來沉淀蛋白，均因基質(zhì)效應(yīng)太強(qiáng)，導(dǎo)致大蒜皂苷提取物中PIEB的響應(yīng)太低，本實(shí)驗(yàn)采取的前處理方法，提取回收率高，無明顯基質(zhì)效應(yīng)，適用于大蒜皂苷提取物血漿樣品的預(yù)處理[9-10]。

本實(shí)驗(yàn)建立并驗(yàn)證了測(cè)定大蒜皂苷提取物中PIEB的LC-MS/MS方法。藥動(dòng)學(xué)研究表明靜脈給藥大蒜皂苷總提物50 mg/kg 后，PIEB即刻在體內(nèi)達(dá)到最大血藥濃度，其t1/2為322 min左右，MRT為270 min；SD大鼠灌胃低、中、高濃度大蒜皂苷提取物后，PIEB的AUC、cmax等隨給藥劑量的增加而增大，可初步判定大蒜皂苷提取物中的PIEB成分在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)過程屬于線性動(dòng)力學(xué)過程，灌胃給藥結(jié)果表明大蒜皂苷提取物中的PIEB成分在大鼠體內(nèi)的生物利用度極低。