朱光貞，楊 波，楊 芹，唐 鑫，張 灝，陳永泉，陳海琴，陳 衛(wèi)

(江南大學 食品學院，江蘇 無錫 214122)

共軛脂肪酸是指含有共軛雙鍵的多不飽和脂肪酸的位置和幾何異構體的總稱[1]。共軛亞麻酸(CLNA)是一組在不同位置(碳8,10,12；碳9,11,13；碳10,12,14；碳11,13,15)、不同構型(ttt,ctt,ctc,ccc,tct,ttc等)的十八碳三烯酸的位置和幾何異構體[2-3]，具有抗癌、抗炎癥、抗氧化、抗心血管疾病、減肥[4]等生理功能，并且相較于其他共軛脂肪酸，CLNA的生理作用更明顯[5]，同時共軛三烯脂肪酸有利于聚合和粘貼，在工業(yè)上可以作為有機涂料聚合物[6]。天然CLNA主要來源于植物種子，極少量來源于動物[7-8]。目前，天然CLNA的分離純化方法主要有尿素包合法[9]、超臨界CO2流體萃取法[10]等，將飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸進行分離，產(chǎn)物多為結構差異很小的混合物[1,3-4,11]，并且收率低，成本高；工業(yè)制備CLNA的方法主要包括化學合成法[12]、脫水法[13]、堿異構法[8]等，產(chǎn)物多為混合物[4]，制備過程中有機試劑可能有殘余，而且能耗大、效率低、污染環(huán)境。許多微生物(如瘤胃細菌、丙酸桿菌、乳酸菌等)可產(chǎn)CLNA，其異構體單一，多為碳9,11,15位置的十八碳三烯脂肪酸[14]。其中，瘤胃細菌(如溶纖維丁酸弧菌)是嚴格厭氧細菌，丙酸桿菌是致病菌，均不能滿足工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)的需要；相比較下，乳酸菌是兼性厭氧細菌，且近幾年來作為益生菌得到了大眾的普遍認可，是故本實驗選擇乳酸菌作為CLNA的代謝菌種。

Suzuki等[8]指出，CLNA的功能與其異構體的種類有關，而乳酸菌所產(chǎn)的CLNA與植物來源、化學合成的CLNA結構有所不同，因此乳酸菌發(fā)酵液中不同CLNA異構體之間的分離顯得尤為重要，又由于CLNA異構體的結構差異很小[3,10]，分離制備的方法成為了制約CLNA異構體研究的一大難題。

有文獻指出高效液相色譜法(HPLC)可以用來分離制備乳酸菌發(fā)酵液酯化形式的脂肪酸異構體[15]和游離形式的羥基脂肪酸[16]，但是游離態(tài)乳酸菌源CLNA單一異構體的分離制備還未有報道。本文主要通過薄層色譜和高效液相色譜兩種方法，對乳酸菌發(fā)酵液中游離形式CLNA分離制備的方法進行了研究，并成功得到了結構單一的CLNA異構體，為后續(xù)單一異構體的功能研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株

植物乳桿菌ZS2058，是本實驗室2004年從四川泡菜中篩選到的一株對共軛脂肪酸具有高轉化率的乳酸菌，可以將α-亞麻酸(LNA)轉化為3種CLNA，并且轉化率高達83.66%[17]。

1.1.2 培養(yǎng)基

MRS液體培養(yǎng)基：1.0%蛋白胨、2.0%葡萄糖、0.5%酵母提取物、1%牛肉膏、0.5%乙酸鈉、0.2%檸檬酸二銨、0.1%吐溫80、0.26%K2HPO4·3H2O、0.01%MgSO4·7H2O、0.005%MnSO4·H2O，pH為6.5。

MRS固體培養(yǎng)基為添加1.5%瓊脂的液體培養(yǎng)基。

1.1.3 主要試劑及儀器

α-亞麻酸(NuChek，純度≥99.9%)，三甲基硅烷化重氮甲烷(上海百靈威有限公司)，甲醇(HPLC級，上海百靈威有限公司)，甲酸(HPLC級，上海阿拉丁試劑有限公司)，乙腈(HPLC級，德國默克公司)，其他試劑均為分析純(國藥集團化學試劑有限公司)；此外，薄層層析硅膠制備板購買于乳山市太陽干燥有限公司。

色譜柱Ultimate?(5XB-C30，4.6 mm×250 mm，上海月旭公司)，色譜柱Hypersil(3GOLD-C18，100 mm×2.1 mm，美國賽默飛有限公司)、旋轉蒸發(fā)儀(德國Heidolph Digital)，QGC-36T氮吹儀(上海泉島公司)，GC-MS-QP2010 Ultra 氣相色譜-質譜聯(lián)用儀(日本島津公司)，UV-2450紫外分光光度計(日本島津公司)，HPLC-UV-MS-Q Exactive 高相液相色譜-質譜聯(lián)用儀(美國賽默飛有限公司)，Milli-Q超純水儀(美國Millipore公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株活化及培養(yǎng)

1.2.1.1 菌株活化

從植物乳桿菌ZS2058保菌管中挑取菌液劃線于MRS固體培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，挑取單菌落于MRS液體培養(yǎng)基中，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)靜置培養(yǎng)24 h，連續(xù)活化3代。

1.2.1.2 菌株培養(yǎng)

將活化好的菌液按1%接種量接種至含0.3 mg/mLα-亞麻酸的MRS液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。

1.2.2 脂肪酸提取

將培養(yǎng)后的菌液按菌液與異丙醇、正己烷體積比為3∶2∶3放入梨形分液漏斗中，振蕩10 min，靜置15 min后取上層正己烷層。上清液于旋轉蒸發(fā)儀中旋轉蒸干，用無水甲醇復溶，至脂肪酸終質量濃度約為2 mg/mL。

1.2.3 氣相色譜-質譜聯(lián)用(GC-MS)檢測

取10 μL樣品，添加十七烷酸(C17∶0)作為內標至終質量濃度為0.8 mg/mL，氮氣吹干，1 mL正己烷復溶，10 000 r/min離心2 min，取上清液，采用Yang等[18]的方法進行GC-MS檢測。

1.2.4 薄層色譜法分離CLNA及純度檢測

根據(jù)游離脂肪酸的極性大小，選擇的展開劑為氯仿-甲醇-乙酸。層析缸中提前放入1.0 cm左右高的展開劑，在另一個層析缸中提前鋪滿一層碘顆粒，使其在層析缸中充分平衡。

分別在距離薄層層析硅膠板上下邊緣1.5 cm處用鉛筆劃線，用毛細管輕輕在下線點樣。點樣結束后，放入水平放置的展開劑層析缸中(注意展開劑不要浸泡樣品)，待展開劑展開到上線后，取出硅膠板，晾干后放入碘顆粒層析缸中碘熏染20 min顯色。

待染色結束，取出硅膠板拍照，并把各部分用刀片刮下，氯仿萃取3次，采用Yang等[18]的方法將其甲酯化后，進行GC-MS檢測。

1.2.5 全波長掃描樣品中的脂肪酸

9,11,15-CLNA的最佳紫外吸收波長未有報道，故利用紫外分光光度計對植物乳桿菌ZS2058發(fā)酵液進行全波長掃描。

1.2.6 高效液相色譜柱的篩選

將HPLC-UV-MS系統(tǒng)串聯(lián)好后，根據(jù)需要，選擇合適的色譜柱、流動相及流速在進樣量50 μL、柱溫為常溫條件下進行實驗，根據(jù)色譜圖中的峰圖及質譜圖中的離子質荷比大小對樣品成分進行定性分析。

1.2.7 流動相的優(yōu)化

采用HPLC-UV分離制備游離CLNA，在高效液相系統(tǒng)中安裝好色譜柱，設置流動相及流速，紫外波長設置為全波長掃描中吸收值最大的波長，在進樣量50 μL、柱溫為常溫條件下對樣品中的CLNA進行分離條件優(yōu)化。

1.2.8 制備產(chǎn)物的純度檢測

將制備得到的CLNA單一異構體于旋轉蒸發(fā)儀中旋轉蒸干，用無水甲醇復溶，取10 μL樣品甲酯化[18]后，采用1.2.3中的方法進行GC-MS檢測。

2 結果與討論

2.1 薄層色譜法分離植物乳桿菌ZS2058發(fā)酵液中的CLNA

在薄層色譜分析條件為展開劑氯仿-甲醇-乙酸(體積比40∶10∶0.01)，上樣量0.15 mg時，薄層色譜法可將樣品分為3部分(見圖1A)，分別取下3部分脂質樣品，從遠離點樣點處依次為第一、二、三部分脂質樣品，經(jīng)萃取、甲酯化后進行GC-MS純度檢測，結果如圖1B、C、D所示。

注：A.植物乳桿菌ZS2058發(fā)酵液中CLNA分離的薄層色譜圖；B.第一部分脂質樣品的氣相色譜圖；C.第二部分脂質樣品的氣相色譜圖；D.第三部分脂質樣品的氣相色譜圖。

圖1植物乳桿菌ZS2058發(fā)酵液中CLNA分離的薄層色譜圖及3部分脂質樣品的純度檢測

由圖1可知，在薄層色譜法分離CLNA的最佳分離條件下得到3部分脂質樣品，沒有得到CLNA的單一異構體，其中摻雜著含量很高的C16∶0和C18∶0，與未進行分離的原發(fā)酵液成分相似。文獻報道薄層色譜法經(jīng)常應用于游離態(tài)脂肪酸和酯化形式脂肪酸的分離，但對于每種游離脂肪酸的分離幾乎沒有涉及，實驗結果表明薄層色譜法無法對乳酸菌源CLNA單一異構體進行分離，且樣品損失率很高，故在現(xiàn)有條件下薄層色譜法無法滿足本實驗的需求。

2.2 植物乳桿菌ZS2058發(fā)酵液的全波長掃描

有文獻[17]報道，HPLC-UV分離制備植物乳桿菌來源羥基脂肪酸時，紫外波長為205 nm和233 nm，HPLC-UV分離制備植物來源的酯化形式的9,11,13-CLNA時，紫外吸收波長是235 nm[8]，但是9,11,15-CLNA的紫外吸收波長未有報道，為了確定最佳的紫外吸收波長，對植物乳桿菌ZS2058發(fā)酵液進行了全波長掃描，結果如圖2所示。

圖2 植物乳桿菌ZS2058發(fā)酵液的全波長掃描圖

由圖2可知，植物乳桿菌ZS2058發(fā)酵液紫外吸收最大的波長為208 nm和232 nm，結合文獻報道，故高效液相色譜條件中紫外檢測器波長設置為205、233 nm。

2.3 高效液相色譜柱的篩選

根據(jù)文獻報道，C18高效液相色譜柱在脂肪酸制備中應用廣泛，而C30高效液相色譜柱更適合分離同分異構體。由于植物乳桿菌ZS2058發(fā)酵產(chǎn)生的3種CLNA異構體結構相似，差異甚小，故將C18高效液相色譜柱Hypersil(3GOLD-C18，100 mm×2.1 mm)和C30高效液相色譜柱Ultimate?(5XB-C30，4.6 mm×250 mm)進行比較，通過質譜圖中離子的質荷比大小，對物質進行定性分析。參考Kichino等[16]分離羥基脂肪酸的條件，設置流動相為乙腈-H2O(體積比80∶20)，流速0.25 mL/min(C18柱)，1 mL/min(C30柱)，并進行條件優(yōu)化，結果如圖3所示。

注：A.C18色譜柱條件優(yōu)化前，流動相為乙腈-H2O(體積比80∶20)；B.C18色譜柱條件優(yōu)化后，流動相為乙腈-H2O(體積比50∶50)；C.C30色譜柱條件優(yōu)化前，流動相為乙腈-H2O(體積比80∶20)；D.C30色譜柱條件優(yōu)化后，流動相為乙腈-H2O(體積比50∶50)。

圖3高效液相色譜柱的篩選

由于LNA只在205 nm波長下有吸收，而CLNA在205 nm和233 nm波長下均有吸收，故比較分離條件時僅比較了205 nm波長下的結果。

由圖3可知，隨著流動相中有機相的比例減少，液相色譜洗脫能力減弱，保留時間變長，但CLNA異構體逐漸分離開來。當流動相為乙腈-H2O(體積比50∶50)時，C18高效液相色譜柱分離到CLNA1、CLNA2兩種CLNA異構體，并且基本達到基線分離；C30高效液相色譜柱比C18高效液相色譜柱的保留時間長，但可以分離到CLNA1、CLNA2、CLNA3 3種CLNA異構體，故選擇C30高效液相色譜柱進行后續(xù)實驗。

2.4 流動相的優(yōu)化

經(jīng)過前期分離條件的優(yōu)化和對比，C30高效液相色譜柱可以分離得到3種CLNA異構體，但目前樣品中CLNA異構體的分離色譜峰峰形欠佳，拖尾嚴重，分離度小，保留時間不穩(wěn)定，仍需進一步優(yōu)化。高效液相色譜分離方法中經(jīng)常添加0.1%甲酸或醋酸銨來調節(jié)流動相的酸堿度，進而提高峰形質量。由于甲酸易揮發(fā)，不會與CLNA發(fā)生反應，分離過程中對樣品的影響較小，故選擇甲酸調節(jié)酸堿度，以改善峰形。

由于本實驗流動相消耗量較大，考慮到乙腈成本高，并且毒性比相似極性的甲醇大，所以嘗試甲醇作為流動相，流速1 mL/min，分離條件經(jīng)過進一步優(yōu)化，結果如圖4所示。

注：A.流動相為乙腈-H2O(體積比50∶50)；B.流動相為乙腈-H2O-甲酸(體積比50∶50∶0.01)；C.流動相為甲醇-H2O-甲酸(體積比70∶30∶0.01)。

圖4流動相的優(yōu)化

由圖4可知，流動相添加甲酸后，峰形得到了很好的改善，峰形變尖銳，異構體之間的分離度更好。雖然保留時間變長，但是改善了保留時間不穩(wěn)定的問題；當流動相為甲醇-H2O-甲酸(體積比70∶30∶0.01)時，雖然CLNA的分離度與乙腈-H2O-甲酸(體積比50∶50∶0.01)條件相似，但流動相中有機相的比例升高，保留時間縮短，有利于后續(xù)除去流動相及提高分離制備效率。由于樣品中CLNA3的含量低，且甲醇在205 nm波長下有部分吸收，導致C30高效液相色譜柱在205 nm波長條件下基線波動劇烈，所以在205 nm條件下沒有檢測到CLNA3。

當流動相為甲醇-H2O-甲酸(70∶30∶0.01)時，CLNA的保留時間長，為了縮短保留時間，提高制備效率，嘗試了梯度洗脫。結果表明，梯度洗脫時，基線漂移非常嚴重，且LNA與CLNA1的分離度不佳，改善梯度洗脫的條件也未能達到預想的目的，故梯度洗脫不適合C30高效液相色譜柱分離乳酸菌源CLNA異構體。

2.5 CLNA最優(yōu)分離條件的重復性驗證及CLNA異構體的純度檢測

將分離CLNA的最優(yōu)條件即C30高效液相色譜柱，流動相為甲醇-H2O-甲酸(體積比70∶30∶0.01)，流速為1 mL/min 進行3次重復實驗，以精密度為指標檢驗方法的重復性，并將分離得到的各個CLNA異構體進行純度檢測，結果如表1和圖5所示。

表1 CLNA最優(yōu)分離條件的精密度

由表1可知，CLNA 3種異構體在最優(yōu)分離條件下保留時間的RSD范圍為0.05%～0.38%，峰面積的RSD范圍為1.88%～4.65%，故該方法對3種CLNA異構體的測定有良好的精密度；由圖5A、B可知，C30高效液相色譜柱，流動相為甲醇-H2O-甲酸(體積比70∶30∶0.01)，流速為1 mL/min條件，LNA和CLNA1、CLNA1和CLNA2以及CLNA2和CLNA3的分離度高，重復性好。所以該條件是HPLC-UV分離乳酸菌源游離態(tài)CLNA的最優(yōu)條件。為了提高分離制備的效率，在保證色譜柱一定的分離度下可以適當增加樣品濃度以增加上樣量，同時可升高樣品和色譜柱的溫度至37℃，使樣品的溶解性更好，以達到高效分離制備的目的。

分離制備產(chǎn)物經(jīng)過甲酯化后進行GC-MS純度檢測，結果得到CLNA1的純度為97.48%，其中摻雜少量CLNA2；CLNA2的純度為100%；CLNA3的純度為65.30%，摻雜部分CLA，可能是由于在液相色譜圖中CLNA3及CLA的含量太少，檢測信號強度低，導致沒有分離開來。總之，部分制備產(chǎn)物的純度達到了單一異構體純度要求。

注：A.最優(yōu)分離條件在205 nm波長下的液相色譜圖；B.最優(yōu)分離條件在233 nm波長下的液相色譜圖；C.CLNA1的氣相色譜圖；D.CLNA2的氣相色譜圖；E.CLNA3的氣相色譜圖。

圖5CLNA最優(yōu)分離條件的重復性驗證及3種CLNA異構體的純度檢測

3 結 論

本文通過薄層色譜和液相色譜的方法，對分離條件進行優(yōu)化，確立了分離制備乳酸菌發(fā)酵液中CLNA的最優(yōu)條件：色譜柱Ultimate?(5XB-C30，4.6 mm×250 mm)；流動相為甲醇-水-甲酸(體積比70∶30∶0.01)；流速為1 mL/min；檢測紫外波長為205 nm和233 nm。該條件可以分離到3種CLNA異構體，并且分離度好，精密度高。制備得到的CLNA1純度為97.48%，CLNA2的純度為100%，CLNA3的純度為65.30%。本實驗也證明了薄層色譜法中展開劑為氯仿-甲醇-乙酸不能應用于分離乳酸菌發(fā)酵液中游離態(tài)CLNA異構體；C30高效液相色譜柱更適合分離乳酸菌發(fā)酵液中結構差異很小的游離態(tài)CLNA異構體；為了提高分離制備的效率，在保證色譜柱一定的分離度下可以適當增加樣品濃度以增加上樣量，同時升高樣品和色譜柱的溫度至37℃使樣品的溶解性更好，來達到高效分離制備的目的。雖然本文首次建立了分離制備乳酸菌源游離態(tài)CLNA的方法，但是液相色譜圖中CLNA3和CLA的檢測信號強度太低，導致兩者沒有分離開來，純度有待提高，后期可以進行第二次制備來獲得更高純度的CLNA3，為單一異構體的功能研究奠定基礎。