陳 新,吳慧穎,邢曉娜

(1.遼寧省人民醫(yī)院;2.吉林大學(xué)第二醫(yī)院;3.中國醫(yī)科大學(xué)人民醫(yī)院，遼寧 沈陽110015)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)的病因及發(fā)病機(jī)制迄今尚不明確，已有證據(jù)表明β淀粉樣蛋白(amyloid β-protein，Aβ)在AD的發(fā)病中起著至關(guān)重要的起始及樞紐作用[1]，是各種原因誘發(fā)AD的共同通路。Aβ是老年斑的主要組成成分，Aβ聚集在導(dǎo)致老年斑形成、突觸減少、神經(jīng)功能失調(diào)、神經(jīng)元死亡以及有臨床癥狀的癡呆方面起關(guān)鍵作用[2]。本研究構(gòu)建了DNA疫苗p(Aβ3-10)10-mIL-4，編碼重復(fù)10次的Aβ3-10并且融入小鼠白細(xì)胞介素4(interleukin-4，IL-4)作為基因佐劑，探討其免疫AD轉(zhuǎn)基因鼠(APP/PS1)免疫反應(yīng)類型、腦內(nèi)老年斑及炎癥反應(yīng)的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物與試劑8月齡APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠15只，購自中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物部。質(zhì)粒大量提取試劑盒(OMEGA)；抗Aβ抗體6E10(Signet)；Aβ42肽(AnaSpec)；即用型SABC免疫組化試劑盒(武漢博士德)；ECM830電穿孔儀(美國BTX)。

1.2p(Aβ3-10)10-mIL-4合成及提取[3]人工合成重復(fù)10次的Aβ3-10的基因片段，裝載到puc57載體。雙酶切(Aβ3-10)10基因片段和模板質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-mIL4。將(Aβ3-10)10基因片段克隆入pcDNA3.1(+)-mIL4質(zhì)粒，合成重組質(zhì)粒p(Aβ3-10)10-mIL-4。測序正確后用質(zhì)粒大量提取試劑盒進(jìn)行大量提取。

1.3動物免疫15只8月齡雌性APP/PS1轉(zhuǎn)基因鼠隨機(jī)分成3組，每組5只。p(Aβ3-10)10-mIL-4組(觀察組)：每只鼠免疫p(Aβ3-10)10-mIL-4，100 μg/次。pcDNA3.1(+)組(陰性對照組)：每只鼠免疫pcDNA3.1(+)，100 μg/次。兩組小鼠注射質(zhì)粒前腹腔注射10%水合氯醛，麻醉后在左后肢股四頭肌肌肉注射質(zhì)粒100 μg，之后用ECM830電穿孔儀進(jìn)行電穿孔[4]；Aβ42組(陽性對照組)：每只鼠免疫Aβ42肽50 μg/次，左后肢股四頭肌肌肉注射。第1次免疫后每2周免疫一次，第3次免疫后每1個(gè)月免疫一次，共免疫9次。

1.4脾細(xì)胞培養(yǎng)上清的細(xì)胞因子檢測

1.4.1脾細(xì)胞培養(yǎng) 最后一次免疫2周后，每組選取2只小鼠。斷頸處死小鼠，將小鼠脾臟置于100 μm孔徑的尼龍網(wǎng)篩上，用鑷子將脾搗碎并用注射器內(nèi)柱輕輕研磨組織塊。將所得溶液離心。將所得沉淀重懸于5 ml紅細(xì)胞裂解液(ACK溶液)中，再次離心。將沉淀重懸于5 ml PBS中，離心。將懸液加入96孔培養(yǎng)板中每份懸液加8個(gè)孔，每孔加100 μl細(xì)胞懸液。分別在每一份懸液8個(gè)孔中的前2孔加入RPMI 1640培養(yǎng)液，100μl/孔；接著2個(gè)孔加入重組質(zhì)粒p(Aβ3-10)10-mIL-4真核表達(dá)蛋白產(chǎn)物[4]，100 μl/孔(10 μg/ml)；接著2個(gè)孔加入Aβ42，100μl/孔(10μg/ml)；最后2個(gè)孔加入ConA(伴刀豆凝集素A)，100 μl/孔(2 μg/100 μl)。于37℃、5%CO2、90%濕度培養(yǎng)箱內(nèi)連續(xù)培養(yǎng)72 h。將刺激物各孔上清小心吸出，-70℃凍存。

1.4.2細(xì)胞因子檢測 ELISA試劑盒檢測細(xì)胞因子IL-4及γ干擾素(IFN-γ)。步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。(1)IL-4測定：將標(biāo)準(zhǔn)品依次稀釋為240 pg/ml，120 pg/ml，60 pg/ml，30 pg/ml，15 pg/ml。在酶標(biāo)包被板上加樣。封板后置37℃溫育30 min。洗滌5次。每孔加入酶標(biāo)試劑50 μl，空白孔除外。封板后置37℃溫育30 min。洗滌5次。每孔先后加入顯色劑A、B各 50 μl， 37℃避光顯色15 min。終止反應(yīng)。450 nm波長測量各孔的吸光度(OD值)。

(2)IFN-γ測定：標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋：將標(biāo)準(zhǔn)品依次稀釋為800 pg/ml，400 pg/ml，200 pg/ml，100 pg/ml，50 pg/ml。其余步驟同IL-4測定步驟。

1.5免疫熒光檢測老年斑及小膠質(zhì)細(xì)胞APP/PSl轉(zhuǎn)基因小鼠腦組織石蠟切片二甲苯脫蠟，梯度酒精脫二甲苯，PBS沖洗，微波煮沸抗原修復(fù)，自然冷卻，PBS沖洗。經(jīng)正常驢血清(normal donkey serum，NDS)(1∶20)室溫預(yù)孵育1 h后，小鼠抗Aβ抗體6E10 (1∶1000)和兔Iba1抗體(1∶500)混合液室溫孵育過夜，漂洗，F(xiàn)ITC和TexasRed標(biāo)記的熒光二抗混合液室溫2 h孵育，漂洗，熒光封片劑封片，共聚焦激光掃描顯微鏡下觀察并采集圖像和分析。

2 結(jié)果

2.1重組質(zhì)粒p(Aβ3-10)10-mIL-4的構(gòu)建目的基因(Aβ3-10)10片段成功合成并克隆入pcDNA3.1(+)-mIL-4質(zhì)粒中。經(jīng)酶切及測序證實(shí)質(zhì)粒構(gòu)建正確。

2.2ELISA方法檢測脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中的細(xì)胞因子水平在相應(yīng)抗原刺激后的脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中，Aβ42組(108.19±11.24 pg/ml)及p(Aβ3-10)10-mIL-4組(102.73±14.83 pg/ml)的IL-4的含量均明顯高于pcDNA3.1(+)組(28.67±5.14 pg/ml)(P<0.01)，但是兩組比較無顯著差異(P>0.05，圖1A)。Aβ42組的IFN-γ的含量(263.34±29.3 pg/ml)明顯高于p(Aβ3-10)10-mIL-4組(96.8±8.35 pg/ml)(P<0.01)及pcDNA3.1(+)組(80.66±12.45 pg/ml)(P<0.01)。而p(Aβ3-10)10-mIL-4組和pcDNA3.1(+)組的IFN-γ含量沒有顯著差別(P>0.05，圖1B)。

2.3DNA疫苗p(Aβ3-10)10-mIL-4免疫對APP/PS1轉(zhuǎn)基因鼠腦內(nèi)老年斑及小膠質(zhì)細(xì)胞的影響免疫熒光結(jié)果顯示，pcDNA3.1(+)組APP/PS1轉(zhuǎn)基因鼠腦內(nèi)可見很多Iba1陽性細(xì)胞，尤其圍繞在老年斑周圍。Aβ42組及p(Aβ3-10)10-mIL-4組腦組織中的Iba1陽性細(xì)胞及老年斑與pcDNA3.1(+)組相比明顯減少(圖2)。

注：圖1 A：脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子IL-4含量。**與pcDNA3.1(+)組經(jīng)相應(yīng)抗原(1640)刺激后IL-4含量比較，P<0.01，#Aβ42組及p(Aβ3-10)10-mIL-4組經(jīng)相應(yīng)抗原刺激后的IL-4含量比較，P>0.05。B:脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子IFN-γ含量。**與p(Aβ3-10)10-mIL-4組經(jīng)相應(yīng)抗原刺激后IFN-γ含量比較P<0.01，#與pcDNA3.1(+)組相應(yīng)抗原刺激后IFN-γ含量比較，P>0.05。

圖1脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子IL-4與IFN-γ含量

注：3組小膠質(zhì)細(xì)胞免疫熒光結(jié)果(A，B，C)；3組老年斑免疫熒光結(jié)果(D，E，F(xiàn))；3組小膠質(zhì)細(xì)胞和老年斑雙表達(dá)免疫熒光結(jié)果(G，H，I)。標(biāo)尺=50 μm。

圖2腦組織FITC和TexasRed熒光雙標(biāo)記小膠質(zhì)細(xì)胞和老年斑結(jié)果

3 討論

針對如何阻斷和延遲AD早期Aβ的積聚以及如何消除已形成的Aβ斑塊沉積已經(jīng)成為近年來AD治療的一個(gè)重要研究方向[2]。研究表明，用Aβ42肽免疫AD模型鼠時(shí)能夠產(chǎn)生高滴度的抗Aβ抗體，減少鼠腦內(nèi)Aβ的沉積，并能使鼠的學(xué)習(xí)和記憶功能得到改善[5,6]。Aβ42肽疫苗(AN1792)在Ⅱ期臨床試驗(yàn)時(shí)，因?yàn)?%的病人出現(xiàn)了無菌性腦膜腦炎而被迫停止[7]。隨后的研究認(rèn)為無菌性腦膜腦炎由T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫反應(yīng)(Th1型免疫反應(yīng))引起[8]。為了建立一種能產(chǎn)生Th2型免疫反應(yīng)的安全AD免疫，研究者進(jìn)行了一些實(shí)驗(yàn)性免疫策略的探索。本研究選擇Aβ3-10做為目的基因片段，已有研究證實(shí)Aβ1-15是誘導(dǎo)B細(xì)胞體液免疫的主要表位[9]，選擇該片段將避免產(chǎn)生T細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。本研究選擇了Th2型細(xì)胞因子IL-4作為佐劑[10]，同時(shí)選擇體內(nèi)電穿孔作為基因遞送途徑[11]，以增強(qiáng)p(Aβ3-10)10-mIL-4的免疫反應(yīng)。

研究認(rèn)為主要誘導(dǎo)Th2型免疫反應(yīng)的免疫方式對于AD的預(yù)防和治療是安全的。Th2型免疫反應(yīng)通過產(chǎn)生IL-4、IL-5等細(xì)胞因子增強(qiáng)體液免疫反應(yīng)；而Th1型免疫反應(yīng)主要產(chǎn)生IFN-γ、IL-2等細(xì)胞因子誘導(dǎo)細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[12]。本研究中，Aβ42疫苗免疫后，脾細(xì)胞體外培養(yǎng)，經(jīng)自身抗原刺激，分泌的細(xì)胞因子IFN-γ和IL-4均較高。p(Aβ3-10)10-mIL-4疫苗免疫后，培養(yǎng)液中IL-4較高，而IFN-γ低。說明Aβ42疫苗引起的免疫反應(yīng)既有Th1免疫反應(yīng)，也有Th2 免疫反應(yīng)，p(Aβ3-10)10-mIL-4疫苗免疫后產(chǎn)生的免疫反應(yīng)類型為Th2型，這樣就降低了發(fā)生炎癥反應(yīng)副作用的可能性。

阿爾茨海默病的神經(jīng)炎癥過程是腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞所參與和介導(dǎo)的一種免疫反應(yīng)。對AD的病理研究發(fā)現(xiàn)活化的小膠質(zhì)細(xì)胞主要圍繞在淀粉樣斑塊的周圍[13]，Aβ與膠質(zhì)細(xì)胞受體結(jié)合而使其激活并表達(dá)細(xì)胞因子，活化的小膠質(zhì)細(xì)胞一方面作為腦內(nèi)的巨噬細(xì)胞可以吞噬沉積的Aβ，減少老年斑的形成；另一方面小膠質(zhì)細(xì)胞激活后產(chǎn)生的大量炎性因子，如IL-6等，可以誘發(fā)腦內(nèi)炎癥反應(yīng)，或直接損傷神經(jīng)元[14]。本研究顯示，Aβ42組及p(Aβ3-10)10-mIL-4組免疫后，鼠腦內(nèi)皮層及海馬的小膠質(zhì)細(xì)胞較pcDNA3.1(+)組明顯減少，與老年斑的減少相一致。說明疫苗免疫后轉(zhuǎn)基因鼠腦內(nèi)的膠質(zhì)細(xì)胞活化減少，炎癥反應(yīng)情況得到了改善，從而可以改善神經(jīng)炎性營養(yǎng)失調(diào)，避免神經(jīng)元的損傷及死亡。

總之，DNA疫苗p(Aβ3-10)10-mIL-4免疫APP/PS1轉(zhuǎn)基因鼠后能夠產(chǎn)生Th2 免疫反應(yīng)，減輕小鼠腦內(nèi)Aβ沉積，同時(shí)可以改善鼠腦內(nèi)的炎癥反應(yīng)。我們將在后續(xù)研究進(jìn)一步探討p(Aβ3-10)10-mIL-4疫苗的免疫效果及安全性，希望該疫苗能作為AD治療的理想疫苗。