祝海燕

(山東濰坊科技學(xué)院/山東省高校設(shè)施園藝實驗室 壽光 262700)

自然界中正常植物都是整倍體植物(2n)，其體細(xì)胞中染色體組(x)是整倍存在的，如二倍體植物(2n=2x)、三倍體植物(2n=3x)及四倍體植物(2n=4x)等。而植物三體(2n+1)是指在正常植物(2n)的染色體組中多一條額外染色體的植物個體，屬非整倍體植物。由于額外染色體的性質(zhì)不同，植物三體又可分為初級三體、次級三體、三級三體和端三體四種類型，其中以初級三體應(yīng)用最廣。

植物初級三體是重要的遺傳工具材料。利用初級三體可進(jìn)行目標(biāo)染色體的分離，可將基因、連鎖群等定位到特定染色體上，從而構(gòu)建基因的物理圖譜。因此，對植物初級三體的創(chuàng)建和研究國內(nèi)外都十分重視。本文就植物三體的概念、類型，初級三體產(chǎn)生途徑、鑒定方法及在遺傳學(xué)研究中的應(yīng)用做一概述。

1 植物三體的類型

根據(jù)額外染色體的來源和性質(zhì)，可將三體分為以下四種類型：

1.1 初級三體 在正常(2n)染色體組基礎(chǔ)上，某對同源染色體增加了一條額外的完整的染色體(圖1)。

圖1 初級三體示意圖

1.2 次級三體 在正常(2n)染色體組基礎(chǔ)上，某對同源染色體增加了一條由自己一條染色體臂構(gòu)成的等臂染色體(圖2)。

圖2 次級三體示意圖

1.3 三級三體 在正常(2n)染色體組基礎(chǔ)上，某對同源染色體增加了一條自己的易位染色體(圖3)。

圖3 三級三體示意圖

1.4 端三體 在正常(2n)染色體組基礎(chǔ)上，某對同源染色體增加了一條端著絲點染色體(圖4)。

圖4 端三體示意圖

在植物的四種三體類型中，初級三體是最常見、研究最多的，在植物遺傳學(xué)研究中應(yīng)用最廣的三體類型。

2 植物初級三體產(chǎn)生的途徑

2.1 自然發(fā)生 三體植物在自然界可自然產(chǎn)生，如Blakeslee最早從曼陀羅中分離出的全部12個染色體的初級三體都是自然產(chǎn)生的。三體植株的自然發(fā)生主要來源于減數(shù)分裂中的錯分離，倘若某對同源染色體在后期Ⅰ不分離，其結(jié)果就會產(chǎn)生n+1和n-1兩種配子，進(jìn)而與正常(n)配子受精結(jié)合產(chǎn)生三體和單體植株。但這種不分離現(xiàn)象并不常見，自然發(fā)生的頻率較低，平均不到千分之一。因此，依靠自然途徑獲得一套初級三體是十分困難的。

2.2 人工創(chuàng)建 目前，植物的三體系一般都是通過人工選育獲得。主要是通過三倍體自交或回交分離非整倍體植株獲得，通過組織培養(yǎng)和物理途徑也可獲得一些三體。

2.2.1 雜交途徑 利用同源三倍體減數(shù)分裂染色體的無規(guī)律分配，從3x×2x或2x×3x的雜交子代中篩選三體植株，是人工創(chuàng)建植物三體系的主要途徑。迄今為止，一些重要農(nóng)作物(如番茄、玉米、水稻、甜菜、大麥、油菜和谷子等)的初級三體系均是通過該途徑創(chuàng)建而成的。該途徑的優(yōu)點是適用性比較廣泛、可靠性高，一般能獲得三倍體的植物，均能篩選出初級三體系。

2.2.2 射線誘發(fā) 利用各種射線(如χ和γ射線)誘發(fā)，使染色體分裂異常，從而提高三體等非整倍體的發(fā)生頻率，如胡保民等[1]用γ射線處理陸地棉種子，其自交后代群體內(nèi)的非整倍體頻率顯著提高，并從中分離出了3個三體和2個四體。

2.2.3 同源四倍體小孢子培養(yǎng) 劉宗賢等[2]從同源四倍體水稻的花粉植株中鑒定出了三體植株。申書興等[3]利用同源四倍體大白菜游離小孢子培養(yǎng)獲得了139個非整倍體小孢子植株系，初步建成了全套的白菜初級三體系，為植物初級三體的創(chuàng)建開辟了一條新途徑。

3 植物初級三體的鑒定

3.1 形態(tài)學(xué)方法 植物的初級三體由于是在植物正常染色體組(2n)的基礎(chǔ)上額外增加了一條正常的染色體，從而使植物所涉及的相關(guān)染色體上的基因劑量由原來的2份增加為3份。這種附加效應(yīng)，使得植物初級三體植株在形態(tài)上與正常植株相比表現(xiàn)出一定的差異。例如，直果曼陀羅的各三體植株與正常植株相比其球形朔果出現(xiàn)不同程度的形態(tài)變異。另外，水稻、玉米、番茄和甘藍(lán)等植物部分三體植株在形態(tài)學(xué)上均有不同程度的差異。但通過形態(tài)學(xué)差異鑒定植物三體準(zhǔn)確性不高，只能作為初步篩選的依據(jù)。

3.2 有絲分裂染色體核型分析 對生物細(xì)胞核內(nèi)全部染色體的形態(tài)特征(如染色體的數(shù)目、形態(tài)、長度、帶型及著絲粒位置等)所進(jìn)行的分析稱為染色體的核型分析。不同物種的染色體組具有不同的核型，且具有很高的穩(wěn)定性和再現(xiàn)性。因此，通過植物染色體核型分析可對植物初級三體進(jìn)行鑒定。張成合等[4]通過染色體核型分析，鑒定了甘藍(lán)的全套初級三體。但染色體核型分析鑒定植物初級三體對染色體數(shù)目較少，或染色體較大且細(xì)胞內(nèi)染色體差別較大的作物準(zhǔn)確性較高，而對染色體較小且染色體差別較小的作物用核型分析，就不能準(zhǔn)確鑒定，故需采用其他方法鑒定。

3.3 染色體分帶核型分析 染色體分帶技術(shù)是通過一定的堿、酸、鹽和溫度等因素對染色體進(jìn)行處理，借助Giemsa等染料染色，使染色體在一定部位呈現(xiàn)深淺程度不同的染色區(qū)段而形成特定的帶紋，由于其帶紋在各染色體上顯示的位置、寬窄、大小、數(shù)目、濃淡等具有相對的穩(wěn)定性，故可用來進(jìn)行染色體的鑒別和分析。姚青等[5]利用染色體分帶G帶技術(shù)，成功地進(jìn)行了水稻三體的鑒定。盛茂銀[6]利用染色體分帶C帶技術(shù)對甜蕎整套三體材料進(jìn)行了鑒定。隨著染色體分帶技術(shù)的不斷發(fā)展，染色體分帶核型分析已成為三體鑒定的一個重要方法。

3.4 熒光原位雜交技術(shù)鑒定 20世紀(jì)90年代以后，原位雜交技術(shù)等現(xiàn)代手段使染色體顯帶方法又有進(jìn)一步的改進(jìn)和完善，形成了熒光原位雜交顯帶技術(shù)，已經(jīng)被用于染色體的鑒別和分析。軒淑欣等[7]以5s rDNA為探針，用熒光原位雜交技術(shù)對大白菜3個三體材料額外染色體的歸屬進(jìn)行了鑒定。此外，有研究用染色體分帶C-帶帶型分析技術(shù)和熒光原位雜交技術(shù)對普通蕎麥的12個三體進(jìn)行了鑒定。

4 植物初級三體在植物遺傳學(xué)研究中的應(yīng)用

4.1 利用三體分離特點進(jìn)行標(biāo)志基因定位 由于三體自交后代的分離比例與二倍體不同，并且三體由父母方傳遞頻率不同，可對三體由父母方進(jìn)行傳遞的總體平均數(shù)加以修正，從而以F2分離比例為標(biāo)準(zhǔn)判定基因的染色體歸屬。例如，Dong YJ等[8]利用三體將水稻的香味基因定位在水稻的第8條染色體上。矮桿基因、光敏核不育基因也相繼被定位到水稻的染色體上。

4.2 對三體植物進(jìn)行同功酶分析，把同功酶基因定位到特定染色體上 用“三體系”的每個三體為母本，分別與2n個體雜交，選雜種F1的三體進(jìn)行酶譜分析。如果F1表達(dá)了雙體的酶譜型，即呈現(xiàn)了相對染色強度1∶1兩條酶帶(單體酶)，表明該同功酶基因與測定的三體無關(guān)。如果F1表達(dá)了相對染色強度為2∶1的兩條酶帶(單體酶)，即呈現(xiàn)了三體酶譜型，表明該同功酶基因與三體有關(guān)。WuKS等[9]利用水稻三體的酶譜分析，成功地把10個同功酶基因分別定位到不同的染色體上。此外，利用三體分析法，對玉米、番茄和大麥等植物的某些同功酶基因也成功進(jìn)行了染色體定位。

4.3 利用分子雜交技術(shù)，對連鎖群進(jìn)行染色體定位 由于初級三體增加一條同源的額外染色體，位于該染色體上的DNA含量亦以等比例增加，使得位于所涉及染色體上的DNA劑量也由原來的2份增加至3份。因此通過制作不同初級三體的等量DNA膜，并以待測DNA序列作探針進(jìn)行Southern雜交，其雜交信號的強度與基因組中標(biāo)記DNA的劑量成正比。所以，根據(jù)雜交信號的強弱便可測知這些序列所在的染色體。Young等[10]用這一原理通過制備番茄不同初級三體等量DNA膜，并與基因組克隆進(jìn)行Southern雜交，從而將52個克隆定位在不同染色體上。

4.4 利用初級三體進(jìn)行目標(biāo)染色體的分離 利用初級三體減數(shù)分裂終變期及中期Ⅰ染色體分裂行為的特點，對于一些染色體較小，通過核型分析較難將各條染色體區(qū)分開的作物，可較準(zhǔn)確地辨別目標(biāo)染色體從而實現(xiàn)目標(biāo)染色體的分離。魏建華等[11]以粳稻第12號初級三體為材料，采用玻璃針染色體微分離法，成功地分離到了水稻第12號染色體，為水稻特定染色體的微分離、體外擴增找到了新途徑，也為以后的水稻目標(biāo)染色體特異性文庫的建立奠定了基礎(chǔ)。

4.5 以三體為母本與未知易位純合體雜交來鑒別易位所涉及的染色體 以各初級三體為母本分別與未知易位純合體雜交，然后對雜交子代植株的減數(shù)分裂行為進(jìn)行顯微觀察，如果下代植株染色體在減數(shù)分裂前期Ⅰ同源染色體聯(lián)會時出現(xiàn)有一個四體環(huán)和一個三價體或一個四體環(huán)和一個二價體加單價體，則該三體染色體不涉及易位染色體。如果下代染色體聯(lián)會時出現(xiàn)一個五價體(環(huán)或鏈)，表明易位染色體與該三體染色體有關(guān)。