章小霞，顧麗麗，姜晨霞，王 燕，任曉燕

（1南通市婦幼保健院病理科，江蘇226018；2南通大學(xué)附屬醫(yī)院病理科）

乳腺癌作為女性中最常診斷的癌癥之一,是婦女健康面臨的主要威脅[1-2]。全世界每年有超過130萬新增患者,約50萬人死于乳腺癌[3]。中國近幾年乳腺癌的發(fā)病率增加近30%,死亡率比過去的30年翻了一番[4]。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展,乳腺癌的診斷和治療取得了一定的進(jìn)展,但目前的治療效果及患者的生活質(zhì)量仍不盡人意[5]。

PFKFB3,即6-磷酸果糖激酶-2/果糖雙磷酸酶3,在各種生物細(xì)胞中廣泛存在,其mRNA和蛋白質(zhì)水平在胃癌、結(jié)腸癌、前列腺癌等組織中顯著高于正常組織[6-7],但PFKFB3在乳腺癌中的表達(dá)及其與患者預(yù)后的關(guān)系國內(nèi)尚未有報道。本實驗應(yīng)用免疫組織化學(xué)法及定量即時聚合酶鏈鎖反應(yīng)（quantitative real time polymerase chain reaction,qRT-PCR）檢測PFKFB3在乳腺癌組織中的表達(dá)情況,分析PFKFB3表達(dá)與臨床病理特征及患者預(yù)后的關(guān)系,報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2011年1月—2012年12月南通大學(xué)附屬醫(yī)院病理科130例乳腺癌患者的癌組織及相應(yīng)癌旁組織（距腫瘤邊緣＞5 cm）的石蠟標(biāo)本。另收集南通大學(xué)附屬醫(yī)院2017年6月12例乳腺癌患者手術(shù)切除的新鮮癌組織及對應(yīng)癌旁組織,-80℃凍存待測。所有患者術(shù)前均未經(jīng)任何抗腫瘤治療,臨床資料及隨訪記錄完整,隨訪截至2017年12月。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化檢測PFKFB3蛋白表達(dá)：將收集的130例乳腺癌組織及其癌旁組織石蠟切片,脫蠟,0.3%過氧化氫封閉,PBS沖洗。100℃烤箱烘烤5 min,自然冷卻以修復(fù)抗原,PBS沖洗3遍。10%小牛血清封閉,PBS沖洗。加入鼠抗人PFKFB3一抗（1∶100）（Abcam公司）,36℃孵育2 h,PBS沖洗3遍。山羊抗鼠IgG二抗（Abcam公司）孵育30 min,PBS沖洗3遍。DAB顯色、蘇木素復(fù)染、封片。

由2名有經(jīng)驗的病理醫(yī)師采用半定量評分法在顯微鏡下判讀。高倍鏡下記錄400個細(xì)胞,根據(jù)染色強(qiáng)度評分：陰性（無黃色）記0分,弱陽性（淡黃色）記1分,中等陽性（棕黃色）記2分,強(qiáng)陽性（棕褐色）記3分。按照染色陽性細(xì)胞占所有細(xì)胞的百分比記分：無陽性細(xì)胞記0分,陽性細(xì)胞＜10%記1分,≥10%～＜50%記2分,≥50%～＜80%記3分,≥80%記4分。最終評分=陽性細(xì)胞百分比記分×染色強(qiáng)度評分,0～4分為陰性,＞4分為陽性[7]。

1.2.2 qRT-PCR檢測PFKFB3mRNA表達(dá)：采用Invitrogen公司Trizol試劑盒、qRT-PCR試劑盒。將凍存的12例新鮮乳腺癌新鮮組織用玻璃研磨器進(jìn)行研磨,提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,以β-actin為內(nèi)參,PCR擴(kuò)增試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增。特異性引物序列為PFKFB3-F（5′-AGCCCGGATTACAAAGAC TGC-3′） 和 R（5′-GGTAGCTGGCTTCATAGCAAC-3′）。qPCR 反應(yīng)參數(shù)：95 ℃ 3 min、95℃ 50 s、55℃ 40 s、72℃ 60 s,共擴(kuò)增40循環(huán)。實驗結(jié)果采用2-ΔΔCt表示PFKFB3 mRNA相對表達(dá)量,重復(fù)3次,取3次平均值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 使用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量數(shù)據(jù)以±s表示,兩組間比較行t檢驗,多組比較行方差分析；臨床病理特征與PFKFB3表達(dá)的關(guān)系采用Pearson χ2檢驗；繪制Kaplan-Meier生存曲線進(jìn)行預(yù)后分析,采用Log-rank單因素分析及COX比例風(fēng)險回歸模型分析影響預(yù)后的因素。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 PFKFB3在乳腺癌中的表達(dá)免疫組化 結(jié)果顯示,PFKFB3蛋白主要定位于乳腺癌細(xì)胞漿,少量定位于細(xì)胞核,陽性表達(dá)率為60.8%（79/130）,而癌旁組織為20.0%（26/130）（圖1）,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=44.875,P＜0.001）。qRT-PCR 結(jié)果顯示,乳腺癌組織及癌旁組織PFKFB3 mRNA相對表達(dá)量分別為1.73±0.21、0.78±0.21,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖 2）。

圖1 免疫組化檢測PFKFB3蛋白的表達(dá)情況（400×）

圖2qRT-PCR檢測PFKFB3mRNA的表達(dá)情況

2.2 PFKFB3蛋白表達(dá)與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系 PFKFB3蛋白表達(dá)與腫瘤分級、原發(fā)腫瘤大小（T）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（N）、TNM分期及分子分型相關(guān)（P均＜0.05）,而與患者年齡、腫瘤部位及組織類型無關(guān)（P均＞0.05）。見表 1。

2.3 PFKFB3蛋白表達(dá)與乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)系Kaplan-Meier生存曲線顯示,PFKFB3蛋白表達(dá)陽性患者的總生存率低于陰性患者,差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）（圖 3）。Log-Rank 檢驗結(jié)果顯示,130例患者中位生存時間為61.67±2.67個月,PFKFB3蛋白陰性、陽性者術(shù)后5年總生存率分別為80.39%、39.24%,生存時間分別為71.78±1.94個月 、50.07±3.49個月,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。

表1 PFKFB3蛋白表達(dá)與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系 例（%）

圖3 Kaplan-Meier生存曲線分析PFKFB3表達(dá)與乳腺癌預(yù)后關(guān)系

2.4 影響預(yù)后因素分析 單因素生存分析顯示,PFKFB3蛋白表達(dá)（陰性vs陽性）、腫瘤分級（ⅠvsⅡvsⅢ）、原發(fā)腫瘤大小（T1 vs T2 vs T3+T4）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（N0 vs N1+1+2）、TNM 分期（0+ⅠvsⅡvsⅢ）及分子分型（Luminal A vs Luminal B vs Her2型vs三陰）與乳腺癌患者預(yù)后相關(guān)（P均＜0.05）,而年齡（＜40歲vs≥40歲,＜60歲 vs≥60歲）、腫瘤部位（左側(cè) vs右側(cè)）及組織類型（浸潤性導(dǎo)管癌vs浸潤性小葉癌vs粘液癌vs其他）等與預(yù)后無關(guān)（P均＞0.05）。多因素分析進(jìn)一步顯示,PFKFB3蛋白表達(dá)、TNM分期為乳腺癌患者預(yù)后的獨立危險因素（P均＜0.05）。見表2。

表2 影響乳腺癌預(yù)后因素分析

3 討 論

近年來乳腺癌的發(fā)病率居高不下,發(fā)病年齡趨于年輕化[8]。乳腺癌的異質(zhì)性很高,其臨床進(jìn)展不同,形態(tài)學(xué)特點各異,分子生物學(xué)分型多樣,對治療的反應(yīng)不一,這些特點嚴(yán)重影響著患者的診斷、治療及預(yù)后。目前乳腺癌根據(jù)其分子特點主要分為以下4種亞型：腔面A、腔面B、基底樣/三陰型和HER2型[9],依據(jù)分子分型對患者進(jìn)行針對性治療已取得一定的成效,但是考慮到乳腺癌的復(fù)雜性和可變性,新的乳腺癌生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)和治療靶點的鑒定顯得更為重要[10]。

惡性腫瘤的增殖、侵襲及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移均需要足夠的營養(yǎng)和能量,腫瘤細(xì)胞代謝旺盛,為了滿足快速增殖及侵襲轉(zhuǎn)移的需要,必須精細(xì)調(diào)節(jié)自身的能量代謝,即所謂的代謝重編程,其中最為主要的代謝方式是“有氧糖酵解”。腫瘤細(xì)胞在有氧情況下仍能維持高水平的無氧糖酵解,可將葡萄糖分解成乳酸,即Warburg效應(yīng)[11],因此抑制腫瘤細(xì)胞的糖酵解即可抑制其增殖分化及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。PFKFB家族有4個亞型：PFKFB1、2、3、4,它們在組織中的表達(dá)及作用不同。1995年從腦組織中發(fā)現(xiàn)并分離出PFKFB3[12],具有激酶和磷酸酶的雙重活性,其激酶活性較強(qiáng),磷酸酶活性較弱[13]。

因PFKFB3C端序列的不同,分為光譜型和誘導(dǎo)型,后者在正常組織中的表達(dá)水平非常低,在許多腫瘤細(xì)胞中表達(dá)水平較高,如胃癌,結(jié)腸癌、肺癌及前列腺癌等[14]。作用機(jī)制如下：PFKFB3是磷酸果糖激酶-1（PFK-1）激活劑,PFKFB3的升高可增強(qiáng)PFK-1的活性,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞攝取的葡萄糖迅速酵解,為細(xì)胞增殖提供足夠的能量；其次,PFKFB3對于含有Ras轉(zhuǎn)化細(xì)胞腫瘤的生長十分必要,促進(jìn)正常的血管生成以及腫瘤細(xì)胞的生長,加速腫瘤的發(fā)生與發(fā)展；再次,HIF-1α和p38／MK2信號通路的激活及PFKFB3第461位點絲氨酸的磷酸化可使其表達(dá)上調(diào),進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖[15]；另外,PFKFB3在細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡中也發(fā)揮一定的作用[16]。由此可見,PFKFB3在維持癌癥的發(fā)展和進(jìn)展中發(fā)揮著重要作用,可能成為癌癥治療一個有吸引力的靶點[17]。

本研究對130例乳腺癌標(biāo)本研究結(jié)果顯示,PFKFB3蛋白在乳腺癌組織中表達(dá)率高于癌旁組織,差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）；PFKFB3蛋白表達(dá)與腫瘤分級、原發(fā)腫瘤大?。═）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（N）、TNM分期及分子分型相關(guān)（P＜0.05）；5年生存率PFKFB3蛋白陰性患者為80.39%,陽性患者為39.24%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；多因素分析表明PFKFB3蛋白表達(dá)、TNM分期是乳腺癌患者預(yù)后的獨立危險因素（P＜0.05）,提示PFKFB3與腫瘤細(xì)胞增殖、分化及侵襲能力密切相關(guān),可促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展,是乳腺癌患者預(yù)后的危險因素。

綜上所述,PFKFB3在乳腺癌組織中高表達(dá),且與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān),其高表達(dá)提示乳腺癌患者預(yù)后不良。