褚楊芳，圣 鈺，劉益飛，周國雄

（1南通瑞慈醫(yī)院消化內(nèi)科，江蘇226010；南通大學(xué)附屬醫(yī)院2病理科，3消化內(nèi)科）

我國潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis,UC）的發(fā)病率逐年上升[1-2]。該病病程漫長,常反復(fù)發(fā)作,病因及發(fā)病機(jī)制尚未明確,被世界衛(wèi)生組織列為現(xiàn)代難治病之一。UC病變主要限于結(jié)腸粘膜和粘膜下層,呈連續(xù)性彌漫性分布,以腸道細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix,ECM）降解和粘膜潰瘍形成為主要的病理特點(diǎn)。ECM主要成分有蛋白聚糖、Ⅳ型膠原、層粘連蛋白（laminin,LN）、纖維連接蛋白等。目前認(rèn)為基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases,MMPs）在ECM降解中起重要作用[3],但具體機(jī)理尚未明確。LN是ECM主要成分之一,不同LN三聚體有不同的功能,能調(diào)節(jié)細(xì)胞兩極、附著、播散以及遷移。Spenle等[4]研究發(fā)現(xiàn)UC患者結(jié)腸組織基底膜的LN免疫反應(yīng)缺失。

MMPs屬于膠原酶類家族,目前已發(fā)現(xiàn)有28種MMPs[5],其基質(zhì)底物包括明膠、膠原、蛋白多糖以及非基質(zhì)底物MMP-9、MMP-3前體。MMP-13結(jié)構(gòu)區(qū)域包括信號肽、前驅(qū)肽區(qū)、催化區(qū)及類血紅素結(jié)合蛋白區(qū)。MMP-13在MMPs激活過程中發(fā)揮重要的作用,可激活其他亞型MMPs,也可被其他MMPs激活。MMP-13在多種生理和病理過程中表達(dá)增高,例如在藥物誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎相關(guān)腸道腫瘤中表達(dá)明顯上調(diào)[6],在吸煙者口腔鱗癌中的表達(dá)也增加,且與TNM分期及淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)[7],在骨關(guān)節(jié)炎模型中表達(dá)增加[8]。國外 Vizoso[9]、Rath[10]等發(fā)現(xiàn)炎性腸?。╥nflammatory bowel disease,IBD）患者中MMP-13表達(dá)增加。

本研究選取南通瑞慈醫(yī)院和南通大學(xué)附屬醫(yī)院2015年1月—2017年5月UC患者30例腸鏡下病變部位活檢標(biāo)本以及病變遠(yuǎn)端10例正常粘膜標(biāo)本,聯(lián)合檢測LN和MMP-13的表達(dá),分析二者與病變程度的關(guān)系,以期探討UC的發(fā)生發(fā)展機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 慢性復(fù)發(fā)型UC患者30例均符合《炎癥性腸病診斷與治療的共識意見（2012年）》診斷標(biāo)準(zhǔn),其中男性8例,女性22例,平均年齡49.73±16.50歲,根據(jù)Mayo指數(shù)分度：輕度7例,中度11例,重度12例。均行電子結(jié)腸鏡檢查,取病變部位活檢標(biāo)本30例,取病變遠(yuǎn)端正常粘膜標(biāo)本10例。本研究獲得兩家醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)同意。

1.2 方法 將石蠟包埋的結(jié)腸組織切片,厚度5μm。HE常規(guī)染色。免疫組化染色：切片經(jīng)二甲苯脫蠟至水,梯度酒精脫苯。0.01 mol/L PBS沖洗3次,浸于0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液中,100℃,10 min,重復(fù)2次,室溫冷卻,放入自動(dòng)免疫組化染色儀。滴加3%H2O2,室溫孵育10 min,0.01 mol/L PBS沖洗3次,滴加一抗LN或MMP-13室溫過夜。0.01 mol/L PBS沖洗3次,滴加羊抗兔二抗,37℃孵育60 min,0.01 mol/L PBS沖洗3次。滴加高敏過氧化物酶復(fù)合物工作液,37℃孵育30 min。0.01 mol/L PBS沖洗3次。0.05%DAB顯色至陽性部位出現(xiàn)特異性顯色,脫水、透明、封片,光鏡下觀察。嚴(yán)格按使用說明書配制LN抗體、MMP-13抗體（艾博康上海公司）濃度。

1.3 免疫組化結(jié)果判定 顯微鏡高倍鏡下細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆?；驁F(tuán)塊為陽性細(xì)胞,根據(jù)陽性細(xì)胞所占比例分5級[11]：0=陰性（-）,1=陽性細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的1%～25%（+）,2=陽性細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)26%～50%（++）,3=陽性細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的51%～75%為（+++）,4=陽性細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)75%～100%（++++）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 通過EXCEL表導(dǎo)入數(shù)據(jù),采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析。定性數(shù)據(jù)差異性比較采用χ2檢驗(yàn),強(qiáng)度及相關(guān)分析采用Spearman等級相關(guān)性分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

圖1 UC病變遠(yuǎn)端粘膜HE染色（400×）

圖2 UC病變粘膜HE染色（箭頭所指為隱窩膿腫，400×）

2.1 HE染色 UC病變遠(yuǎn)端粘膜腺體結(jié)構(gòu)完整,排列整齊,杯狀細(xì)胞較多（圖1）；UC粘膜病變區(qū)腺體數(shù)目減少,杯狀細(xì)胞減少,見大量淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞、中性粒細(xì)胞浸潤,隱窩可見小膿腫（圖2）。2.2 LN表達(dá) UC病變腸粘膜30例中20例LN表達(dá)陽性（66.7%）,10例病變遠(yuǎn)端粘膜LN表達(dá)均陽性（100.0%）,UC病變組與對照組LN表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.444,P＜0.05）。重度UC組LN表達(dá)陽性率低于正常對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=10.476,P＜0.05）,輕度、中度UC表達(dá)陽性率與正常對照組比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。相關(guān)性分析顯示,三組病變程度與LN表達(dá)強(qiáng)度呈負(fù)相關(guān)（r=-8.222,P＜0.001）,提示隨著UC病情程度的加重,LN表達(dá)逐漸減少,重度UC病變組LN表達(dá)最低。見表 1,圖 3、4。

表1 UC腸粘膜LN表達(dá) 例

圖3 對照組LN表達(dá)（400×）

圖4 重度UC組LN表達(dá)（400×）

2.3 MMP-13表達(dá) 30例UC病變腸粘膜中25例MMP-13表達(dá)陽性（83.3%）,10例病變遠(yuǎn)端粘膜1例MMP-13表達(dá)陽性（10.0%）,UC病變組與對照組MMP-13表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=17.729,P＜0.001）。中度 UC 組（χ2=13.747,P＜0.001）、重度 UC組（χ2=18.277,P＜0.001）MMP-13表達(dá)陽性率與正常對照組比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。隨著病變程度的加重,MMP-13表達(dá)率逐漸增加,輕度UC組表達(dá)率與重度組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=8.686,P＜0.05）。相關(guān)性分析顯示,病變程度與MMP-13表達(dá)強(qiáng)度呈正相關(guān)（r=0.834,P＜0.001）,提示隨著UC病情程度的加重,MMP-13表達(dá)逐漸增強(qiáng)。見表2,圖5、6。

表2 UC腸粘膜MMP-13表達(dá) 例

圖5 輕度UC組MMP-13表達(dá)（400×）

圖6 重度UC組MMP-13表達(dá)（400×）

2.4 LN與MMP-13表達(dá)的相關(guān)性 UC病變腸粘膜及遠(yuǎn)端正常粘膜LN與MMP-13表達(dá)的相關(guān)性分析顯示,兩者呈負(fù)相關(guān)（r=-0.913,P＜0.001）,隨著 LN表達(dá)的減少,MMP-13表達(dá)逐漸增加。見表3。

表3 LN與MMP-13表達(dá)的相關(guān)性

3 討 論

LN是細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）中的非膠原糖蛋白,廣泛存在于基底膜的透明層,對維持基底膜結(jié)構(gòu)與功能的完整性起了極其重要的作用。當(dāng)LN遭到破壞時(shí),腸粘膜表現(xiàn)為基底膜破壞,細(xì)胞間隙增大,通透性增加,腸屏障受損,細(xì)菌與毒素移位,從而引發(fā)失控的炎癥反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn),UC病變遠(yuǎn)端腸粘膜腺體結(jié)構(gòu)規(guī)則,隱窩大小相似,見較多杯狀細(xì)胞和較少的中性粒細(xì)胞,LN位于被覆上皮細(xì)胞及腺體基底膜部,呈連續(xù)狀（見圖3）。UC病變組織隨著病情進(jìn)展,腺體逐漸減少,淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞及中性粒細(xì)胞逐漸增多,隱窩可見小膿腫,杯狀細(xì)胞逐漸減少,LN表達(dá)出現(xiàn)不同程度的缺損、變薄及中斷,重度UC者呈碎片狀（見圖4）。UC病變粘膜LN表達(dá)明顯少于遠(yuǎn)端正常腸粘膜,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）,與Spenlé等[4]研究結(jié)果相符。UC病變程度與LN表達(dá)強(qiáng)度呈負(fù)相關(guān)（P＜0.001）,提示隨著UC病情的加重,LN表達(dá)逐漸減少。

MMP-13能降解大部分ECM,目前已發(fā)現(xiàn)有28種MMPs[12],其中MMP-13屬于膠原酶,主要降解Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型膠原和結(jié)締組織膠原的三螺旋結(jié)構(gòu)[13]。本研究發(fā)現(xiàn),UC病變遠(yuǎn)端正常腸粘膜中MMP-13表達(dá)極少,表達(dá)率僅為10.0%,而病變部位MMP-13總表達(dá)率83.33%,中、重度UC病變組織MMP-13表達(dá)明顯高于病變遠(yuǎn)端正常腸粘膜,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）,與 Vizoso等[9]研究結(jié)果相符。在病變區(qū)域內(nèi)MMP-13廣泛分布于淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞、中性粒細(xì)胞胞漿內(nèi),隨著UC病情的加重,MMP-13表達(dá)逐漸增加（圖5、6）,相關(guān)性分析顯示UC病變程度與MMP-13表達(dá)強(qiáng)度呈正相關(guān)（P＜0.001）,說明隨著UC病情的加重,MMP-13表達(dá)逐漸增強(qiáng)。此外,LN表達(dá)與 MMP-13表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（P＜0.001）,隨著LN表達(dá)的減少,MMP-13表達(dá)逐漸增加。

LN是ECM主要組成成分,在重度UC中LN表達(dá)明顯減少,提示ECM遭到破壞,臨床上可能提示粘膜潰瘍形成,是否可通過某種途徑增加LN的表達(dá),來改善粘膜破損。MMP-13能降解ECM,且其表達(dá)與LN呈負(fù)相關(guān),MMP-13是否通過某種途徑參與基底膜損傷的發(fā)生發(fā)展,能否通過藥物干預(yù)減少M(fèi)MP-13的表達(dá),從而緩解基底膜損傷或使腸粘膜修復(fù)。這些疑問可能為將來UC的治療研究提供新的方向。