， ，，，，，

2017年發(fā)布的全球結(jié)核病報(bào)告顯示，2016年新發(fā)現(xiàn)大約1 040萬(wàn)結(jié)核病例，印度、印度尼西亞、中國(guó)、菲律賓和巴基斯坦5個(gè)國(guó)家占56%[1]。利用結(jié)核分枝桿菌遺傳標(biāo)志物(具有遺傳的穩(wěn)定性和個(gè)體的多樣性)對(duì)結(jié)核分枝桿菌臨床分離株進(jìn)行分型研究，證實(shí)菌株的基因多態(tài)性，以此了解結(jié)核病的流行病學(xué)特征、分析患者產(chǎn)生耐藥的原因、推斷病原演變情況等，對(duì)于防治結(jié)核病具有重要的意義[2-3]?；赑CR技術(shù)的MLVA方法，由于其特異性高、分辨率強(qiáng)、效果明顯、操作簡(jiǎn)單方便和重復(fù)性好，美國(guó)疾病控制和預(yù)防中心推薦其為首選的結(jié)核桿菌基因分型方法[3]。因?yàn)樵诓煌瑓^(qū)域VNTR位點(diǎn)及位點(diǎn)組合有差異性，所以各個(gè)實(shí)驗(yàn)室都在盡力尋找適合當(dāng)?shù)氐奈稽c(diǎn)。本研究采用MLVA技術(shù)，選取15個(gè)VNTR位點(diǎn)對(duì)山西省的127株結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行基因分型及藥敏試驗(yàn)，以初步了解山西長(zhǎng)治及周邊地區(qū)結(jié)核分枝桿菌分子流行病學(xué)特征及耐藥性，為山西省預(yù)防和治療結(jié)核病提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1菌株 127株結(jié)核分枝桿菌菌株分別分離自長(zhǎng)治市、晉城市和臨汾市的臨床患者痰標(biāo)本，其中長(zhǎng)治106株，晉城20株，臨汾1株?；颊吣挲g16～90歲，平均44歲；男80例(63%)，女47例(37%)；農(nóng)民75例(59.06%)，學(xué)生14例(11.02%)，其他38例(29.92%)。長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院附屬和平醫(yī)院微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)菌株的培養(yǎng)、鑒定和保存。菌株H37Rv作為參照標(biāo)準(zhǔn)(中國(guó)疾病預(yù)防控制中心提供)。

1.2主要儀器與試劑 MasterMix(Beijing TsingKe Biotech Co., Ltd)、DL l 000 DNA Marker(Takara)、GoldenView(Aidlab Biotechnologies Co., Ltd)、瓊脂糖、PCR擴(kuò)增儀、凝膠成像儀及BioNumerics 5.0 分析軟件。

1.3基因分型 依據(jù)參考文獻(xiàn)選取15個(gè)VNTR位點(diǎn)[2,4-7](表1)。

表1 15個(gè)位點(diǎn)的引物、H37Rv重復(fù)單元和擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度及重復(fù)次數(shù)Tab.1 Primers of 15 locus and the size of repeat, the size of PCR product and the number of repeats of H37Rv strain

15個(gè)VNTR位點(diǎn)的引物依據(jù)參考文獻(xiàn)合成。

DNA提?。菏占m量經(jīng)Lowenstein Jensen(LJ)培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌體于400 μL蒸餾水懸菌，100 ℃金屬浴滅活裂解30 min，14 000 r/min的速度離心10 min，-20 ℃保存上清液以備用。

PCR：混合物總體積為25 μL：DNA模板1 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，2×TaqDNA酶13 μL，三蒸水9 μL。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性94 ℃ 10 min，變性94 ℃ 1 min，退火56 ℃ 1 min，延伸72 ℃ 1 min，共35個(gè)循環(huán)，最后延伸72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物在4 ℃保存。

瓊脂糖凝膠電泳：取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中電泳(含5 μL/100 mL Golden View)，置于紫外凝膠成像儀下觀察結(jié)果，與DNA marker進(jìn)行比較，估測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的相對(duì)分子質(zhì)量。實(shí)驗(yàn)中以H37Rv作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.4藥敏試驗(yàn) 對(duì)8種抗結(jié)核藥物分別采用比例法進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)。培養(yǎng)基中8種藥物的終濃度分別為異煙肼(INH)0.2 μg/mL，利福平(RFP)40 μg/mL，乙胺丁醇(EMB)2 μg/mL，鏈霉素(SM)4.0 μg/mL，卡那霉素(KN)30 μg/mL，丙硫異煙胺(PTH)40 μg/mL，對(duì)氨基水楊酸(PAS)1.0 μg/mL，左氧氟沙星(LFX)4.0 μg/mL[5]。耐藥標(biāo)準(zhǔn)：含藥培養(yǎng)基與對(duì)照培養(yǎng)基的菌落數(shù)相比，小于l%為敏感，大于或者等于l%為耐藥[5]。

1.5數(shù)據(jù)分析 每株菌株的PCR擴(kuò)增條帶均與H37Rv比較，確定每株菌株各個(gè)VNTR位點(diǎn)重復(fù)單元的重復(fù)次數(shù)，計(jì)算Hunter-Gaston指數(shù)(HGI)分析各位點(diǎn)的分辨能力。采用BioNumerics 5.0軟件進(jìn)行聚類分析，聚類方式用平均連鎖聚類法(UPGMA)，根據(jù)cluster-cutoff值差異進(jìn)行基因分型。采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS l7.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，運(yùn)用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法進(jìn)行組間差異比較，P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1基因多態(tài)性和聚類分析 運(yùn)用MLVA方法對(duì)127株結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行基因分型，DNA指紋圖譜顯示不同菌株表現(xiàn)出明顯的基因多態(tài)性。15個(gè)VNTR位點(diǎn)中，Mtub21、MIRU26 和ETRE位點(diǎn)多態(tài)性較高(HGI>0.6)；MIRU10、 ETRA、MIRU27、Mtub39 、Mtub30和MIRU39位點(diǎn)呈中等程度的多態(tài)性(0.3

圖1 127株菌株MLVA基因分型聚類分析Fig.1 Clustering analysis of 127 strains by MLVA

表2 15個(gè)VNTR位點(diǎn)的Hunter-Gaston指數(shù)Tab.2 Hunter-Gaston Index of 15 VNTR loci

注：1.Hunter-Gaston指數(shù)：分析VNTR位點(diǎn)重復(fù)單元多樣性的指數(shù)(0.0≤HGI≤1.0)；2.可信區(qū)間：多樣性指數(shù)的95%可信區(qū)間。

2.2藥敏試驗(yàn) 根據(jù)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)127株結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)[8]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：127株菌株對(duì)一線和二線抗結(jié)核藥物的總耐藥率分別為47.24%和23.62%。一線抗結(jié)核藥物的耐藥率：鏈霉素(40.94%)最高，依次是異煙肼(32.28%)、利福平(24.41%)，乙胺丁醇(6.30%)最低；二線抗結(jié)核藥物的耐藥率：左氧氟沙星(14.17%)最高，其次是卡那霉素(8.66%)、對(duì)氨基水楊酸(7.09%)，丙硫異煙胺(3.15%)最低。鏈霉素的單耐藥率最高(11.81%)，其次是異煙肼(2.36%)，未發(fā)現(xiàn)利福平和乙胺丁醇的單耐藥菌株；耐多藥率為21.26%(27/127)，其中有5株(3.94%)菌株對(duì)四種藥物同時(shí)耐藥；廣泛耐多藥率為3.15%(表3)。

2.3基因型與耐藥的關(guān)系 Ⅰ群菌株與其它菌株對(duì)一線和二線藥物的總耐藥率、一線和二線藥物的耐藥率、單耐藥率、耐多藥率、廣泛耐多藥率如下。Ⅰ群菌株與其它菌株的耐藥率進(jìn)行比較，兩者間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(α=0.05)(表4)。

表3 127株菌株的耐藥情況Tab.3 Drug resistance of 127 strains

3 討 論

MLVA基因分型方法有很多優(yōu)點(diǎn)，不僅特異性高、穩(wěn)定性強(qiáng)，且操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好，檢測(cè)結(jié)果還可以數(shù)字表示，不同實(shí)驗(yàn)室之間可相互進(jìn)行比較。

本研究采用15個(gè)VNTR位點(diǎn)對(duì)山西省的127株結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行基因分型，結(jié)果顯示Mtub21、MIRU26和ETRE對(duì)于分析山西省的結(jié)核分枝桿菌有較高的多態(tài)性；MIRU40、ETRB、ETRD、MIRU23、 ETRC的多態(tài)性較差。先前研究發(fā)現(xiàn)，在北京[9]QUB11b、Mtub21、MIRU39和MIRU16的多態(tài)性較高，青海省[4]菌株中多態(tài)性最好的是MIRU26，徐州[5]結(jié)核分枝桿菌的實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)MIRU26和Mtub21多態(tài)性較好，西藏地區(qū)[10]主要是MIRU31、Mtub21和ETRE多態(tài)性較高，四川地區(qū)[11]QUB11b和MIRU26的多態(tài)性較好，在韓國(guó)MIRU26和ETRE的區(qū)分力較高[12]，提示不同地區(qū)VNTR位點(diǎn)的多態(tài)性不同，Mtub21、MIRU26和ETRE位點(diǎn)在實(shí)驗(yàn)菌株的分析方面發(fā)揮著重要作用。127株菌株分為11個(gè)基因群，以Ⅰ群菌株(80.31%)為主，說(shuō)明這些菌株屬于親緣關(guān)系很近的同一個(gè)克隆系，可能為山西長(zhǎng)治及周邊地區(qū)的主要流行菌株，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)這類菌株的研究[13]。

表4 不同基因型菌株的耐藥性比較Tab.4 Drug resistance comparing in different genotype among strains

注：1，F(xiàn)isher確切概率法

耐藥結(jié)核病的流行，尤其是耐多藥患者增多，病程漫長(zhǎng)，傳染風(fēng)險(xiǎn)極高，是我國(guó)結(jié)核病疫情居高不下的重要原因[14]。2010年開(kāi)展的全國(guó)結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查顯示：一線、二線藥物的總耐藥率為36.8%和24.6%，耐多藥率6.8%[15]。

本次研究結(jié)果：一線藥物的總耐藥率為47.27%，耐多藥率為21.26%，顯然高于2010年全國(guó)調(diào)查結(jié)果，表明長(zhǎng)治及周邊地區(qū)結(jié)核病耐藥狀況仍然比較嚴(yán)重。一線藥物中鏈霉素的敏感性較低，乙胺丁醇的敏感性較高，二線藥物中左氧氟沙星的敏感性較低。鏈霉素是廣譜抗生素，必須與其它藥物聯(lián)合使用，但因其對(duì)神經(jīng)和腎的副作用，很多患者不按標(biāo)準(zhǔn)方案用藥或中途停藥，部分醫(yī)生用藥不規(guī)范，是造成鏈霉素耐藥的重要因素[16]。因左氧氟沙星利于痰菌轉(zhuǎn)陰、影像學(xué)療效改善和不良反應(yīng)少，成為治療耐多藥肺結(jié)核的最佳輔助選擇，但氟喹諾酮類藥物對(duì)其它致病菌較強(qiáng)的殺菌作用而被普遍使用，增加了它的耐藥率[16-17]。一線藥物中鏈霉素和異煙肼的單耐藥率較高，未發(fā)現(xiàn)利福平和乙胺丁醇的單耐藥菌株，二線藥物的敏感性高于一線藥物。臨床用藥建議：充分發(fā)揮利福平和乙胺丁醇的作用，規(guī)范地聯(lián)合用藥，特別是對(duì)于一線藥物高度耐藥的菌株聯(lián)合二線藥物進(jìn)行治療，以避免耐藥性的產(chǎn)生[18-19]。應(yīng)加大耐藥結(jié)核特別是耐多藥結(jié)核的監(jiān)控力度，繼續(xù)加強(qiáng)菌株培養(yǎng)和藥敏試驗(yàn)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果制定合理的化療方案或調(diào)整方案[20]。對(duì)患者進(jìn)行隨訪追蹤，監(jiān)督指導(dǎo)，以提高用藥的依從性。

Ⅰ群菌株(主要流行菌株)與其它菌株對(duì)一線、二線藥物的總耐藥率、一線和二線藥物的耐藥率、單耐藥率、耐多藥率及廣泛耐多藥率進(jìn)行比較，兩者間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明主要流行菌株與耐藥性無(wú)明顯相關(guān)性。

本實(shí)驗(yàn)標(biāo)本量有限，在今后的研究中，我們需不斷地加大樣本量，并且結(jié)合其它的分型方法——Spoligotyping來(lái)共同分析基因型與耐藥之間的關(guān)聯(lián)性。