高志強(qiáng)，汪 琳，姜 焱，蒲 靜，趙相鵬，尹 羿，張 偉

（1. 北京出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心，北京 100026；2. 江蘇出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心，江蘇南京 210001）

豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea，PED）是以豬的嚴(yán)重腸炎、嘔吐、水樣腹瀉等消化道癥狀為特征的高度接觸性病毒性傳染病。該病病原為豬流行性腹瀉病毒（PEDV），1987年于比利時(shí)被首次分離鑒定[1]。PEDV為有囊膜的單股正鏈RNA病毒，屬于冠狀病毒科。病毒基因組大小約28 kb，由5'非編碼區(qū)（5' UTR），3'非編碼區(qū)域（3'UTR）和至少7個(gè)開(kāi)放閱讀框（ORFs）組成。編碼蛋白包括4個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白（S蛋白、E蛋白、M蛋白和N蛋白）以及3個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白（復(fù)制酶1a、1b和ORF3）[1]。PED于1973年在我國(guó)首次被發(fā)現(xiàn)，目前流行于國(guó)內(nèi)許多種豬場(chǎng)，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)持續(xù)造成較為嚴(yán)重的危害[2]。前些年，美國(guó)暴發(fā)PED并在其國(guó)內(nèi)快速傳播，造成新生仔豬死亡率增高，給美國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了重大打擊[3]。PEDV的快速及時(shí)檢測(cè)，對(duì)于預(yù)防和控制PED傳播和暴發(fā)至關(guān)重要。目前，檢測(cè)PEDV的傳統(tǒng)方法包括病毒分離、熒光抗體檢測(cè)、ELISA以及核酸擴(kuò)增檢測(cè)等。其中，核酸擴(kuò)增類(lèi)檢測(cè)方法因具有快速、靈敏、特異的優(yōu)點(diǎn)，已逐漸成為送檢樣品中PEDV快速檢測(cè)的首選方法，尤其是RT-PCR和熒光定量RT-PCR，應(yīng)用最為廣泛[4]。

LAMP是一種恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，擴(kuò)增效率高，不需要特殊儀器，具有快速、特異的優(yōu)點(diǎn)，而且可以通過(guò)在反應(yīng)前加入指示劑，實(shí)現(xiàn)可視化結(jié)果判斷，對(duì)于樣品的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)非常實(shí)用[5]。PEDV M蛋白為一種含量豐富的囊膜蛋白，序列保守特異。因此，本研究采用基于HNB可視化顯色的方法，針對(duì)PEDV M基因建立了RT-LAMP檢測(cè)技術(shù)，并通過(guò)特異性和靈敏度評(píng)價(jià)，用于送檢病死豬樣本檢測(cè)，以期為PEDV現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)提供一種可靠的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒核酸及被檢樣品 PEDV AQL1和CL株，豬瘟病毒HCLV核酸，偽狂犬病毒Nanyangju，豬繁殖與呼吸綜合征病毒MLV RespPRRS/Repro，豬傳染性胃腸炎病毒Purdue115，豬鏈球菌2型C55606核酸：均為本實(shí)驗(yàn)室保存；150份糞拭子：豬場(chǎng)送檢；37份病死豬臟器樣品：北京市順義區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所送檢。

1.1.2 主要試劑 TIANamp病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒（DP315）：購(gòu)自天根生化科技有限公司；AMV反轉(zhuǎn)錄酶、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑：購(gòu)自Promega公司；Bst DNA聚合酶：購(gòu)自NEB公司；Ex HS Taq DNA聚合酶、dNTP等：購(gòu)自TaKaRa公司；羥基萘酚藍(lán)（HNB）：購(gòu)自Fluka公司。

1.1.3 主要設(shè)備 Roche 480熒光PCR儀：Roche公司產(chǎn)品；毛細(xì)管電泳儀QIAxcel：QIAGEN公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 為確保引物的保守性和特異性，隨機(jī)選取20株不同地域來(lái)源的PEDV M基因序列，使用Vector NTI進(jìn)行序列比較，結(jié)果見(jiàn)圖1。根據(jù)PEDV M 基因序列，使用在線軟件Primer explorer version 4（http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html）設(shè)計(jì)1套LAMP引物，并根據(jù)序列比對(duì)結(jié)果，對(duì)個(gè)別堿基進(jìn)行簡(jiǎn)并。設(shè)計(jì)的引物委托上海生工生物工程有限公司合成，引物名稱、序列見(jiàn)表1。

1.2.2 內(nèi)引物與MgSO4濃度優(yōu)化 采用25 μL 體系，以5 μL 10-4稀釋的病毒RNA為模板，基礎(chǔ)體系為1×ThermoPol 緩沖液、16 U Bst DNA聚合酶、5 U AMV 反轉(zhuǎn)錄酶、10 U RNA酶抑制劑，betaine 濃度固定為0.8 mol/L，HNB濃度固定為0.12 mmol/L，dNTPs濃度固定為200 nmol/L，外引物量固定為10 pmol。內(nèi)引物量從40～120 pmol，以20 pmol量遞增，MgSO4濃度從1.0～6.0 mmol/L，以0.5 mmol/L遞增，篩選最適合MgSO4濃度和最佳內(nèi)引物量。反應(yīng)條件為62 ℃ 1 h。

1.2.3 環(huán)引物有效性檢測(cè) 在1.2.2優(yōu)化體系基礎(chǔ)上，分別配制加入和未加入40 pmol環(huán)引物L(fēng)F和BF的反應(yīng)體系，分別對(duì)5 μL 10-3～10-7稀釋的病毒RNA模板進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)反應(yīng)管顏色變化和毛細(xì)管電泳結(jié)果確定環(huán)引物的有效性，從而確定最終反應(yīng)體系。反應(yīng)條件為62 ℃ 1 h。

1.2.4 反應(yīng)溫度優(yōu)化 為確定最佳反應(yīng)溫度，RT-LAMP 從60～65 ℃ ，以1 ℃進(jìn)行遞增，對(duì)5 μL 10-4稀釋的病毒RNA 進(jìn)行檢測(cè)，以10 min為間隔，觀察反應(yīng)管顏色變化，確定最佳反應(yīng)溫度。

圖1 PEDV LAMP引物設(shè)計(jì)區(qū)域的序列比對(duì)

表1 PEDV LAMP引物名稱和序列

1.2.5 靈敏度試驗(yàn) 應(yīng)用優(yōu)化的反應(yīng)體系，對(duì)10倍系列稀釋的含105～10-2TCID50/mL的2株P(guān)EDV病毒液，分別提取RNA進(jìn)行檢測(cè)，并與行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[6]規(guī)定的熒光RT-PCR方法進(jìn)行靈敏度比較。

1.2.6 特異性試驗(yàn) 應(yīng)用建立的反應(yīng)體系，對(duì)豬流行性腹瀉病毒、豬瘟病毒HCLV、偽狂犬病毒Nanyangju核酸，豬繁殖與呼吸綜合征病毒MLV RespPRRS/Repro、豬傳染性胃腸炎病毒Purdue115、豬鏈球菌2型C55606核酸進(jìn)行檢測(cè)，以驗(yàn)證方法的特異性。

1.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 對(duì)稀釋至10、1、0.1 TCID50/mL的0.2 mL 2株P(guān)EDV病毒液分別提取RNA，應(yīng)用建立的RT-LAMP方法進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)稀釋度均進(jìn)行3次重復(fù)，以驗(yàn)證方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

1.2.8 糞拭子樣品和病死豬樣品檢測(cè) 應(yīng)用建立的方法對(duì)150份豬糞拭子樣品，以及北京市順義區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所送檢的37份病死豬臟器樣品進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)與熒光RT-PCR檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

2.1 反應(yīng)體系優(yōu)化

經(jīng)多次重復(fù)試驗(yàn)確立的最終反應(yīng)體系包括：5 μL RNA 模 板，1×ThermoPol 緩 沖 液4 mol/L betaine 5 μL，0.1 mol L MgSO40.5 μL，10 mmol/L dNTPs 1 μL，3 mmol/L HNB 1 μL，10 pmol F3 和B3，80 pmol FIP和BIP，LF和BF均為40 pmol，16 U Bst DNA聚合酶，5 U AMV 反轉(zhuǎn)錄酶，10 U RNA酶抑制劑。陽(yáng)性反應(yīng)管為天藍(lán)色，而陰性反應(yīng)管為紫羅蘭色，顯色反應(yīng)結(jié)果與毛細(xì)管電泳結(jié)果一致。使用環(huán)引物，靈敏度可達(dá)10-6，而不使用環(huán)引物，靈敏度為10-5，檢測(cè)靈敏度差1個(gè)數(shù)量級(jí)（圖2）。

圖2 環(huán)引物有效性檢測(cè)結(jié)果

2.2 反應(yīng)溫度試驗(yàn)

反應(yīng)溫度試驗(yàn)結(jié)果顯示，62、63 ℃效果最好，因此選擇較高的63 ℃作為最佳反應(yīng)溫度。

2.3 靈敏度試驗(yàn)

對(duì)于2株P(guān)EDV病毒，應(yīng)用建立的RT-LAMP反應(yīng)體系可在1 h內(nèi)檢出0.2 mL 0.1 TCID50/mL 病毒液中提取的RNA，與熒光RT-PCR方法靈敏度一致，表明方法的靈敏度可以滿足要求。圖3～圖5為PEDV AQL1株和CL株靈敏度檢測(cè)結(jié)果。

2.4 特異性試驗(yàn)

應(yīng)用建立的檢測(cè)反應(yīng)體系，對(duì)PEDV、豬瘟病毒HCLV、偽狂犬病毒Nanyangju、豬繁殖與呼吸綜合征病毒MLV RespPRRS/Repro、豬傳染性胃腸炎病毒Purdue115、豬鏈球菌2型C55606核酸進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)建立的檢測(cè)方法與上述病原核酸均無(wú)交叉反應(yīng)。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

對(duì)于2株P(guān)EDV病毒，連續(xù)3次對(duì)稀釋至10、1、0.1 TCID50/mL的0.2 mL病毒液提取核酸進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，2個(gè)毒株3個(gè)稀釋度的病毒核酸3次重復(fù)檢測(cè)均為陽(yáng)性，表明建立方法的重復(fù)性可以滿足要求。

2.6 糞拭子和病死豬樣品檢測(cè)

應(yīng)用建立的方法，對(duì)150份豬糞拭子樣品和北京市順義區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所送檢的37份病死豬的臟器樣品進(jìn)行了RT-LAMP檢測(cè)，同時(shí)與熒光RT-PCR檢測(cè)方法進(jìn)行了比較。結(jié)果顯示，150糞拭子樣品中，檢出陽(yáng)性樣品7份，37病死豬樣品 中的2份小腸組織為陽(yáng)性，與熒光RT-PCR檢測(cè)結(jié)果完全一致（圖6、圖7）。

圖3 RT-LAMP 靈敏度試驗(yàn)眼觀檢測(cè)結(jié)果

圖4 RT-LAMP 靈敏度試驗(yàn)毛細(xì)管電泳檢測(cè)結(jié)果

圖5 熒光RT-PCR試驗(yàn)的靈敏度試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

目前PEDV可能存在于國(guó)內(nèi)大多數(shù)種豬場(chǎng)，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成較為嚴(yán)重的持續(xù)性危害。如果能在現(xiàn)場(chǎng)快速檢出樣品中的PEDV進(jìn)而快速采取措施，對(duì)于PED防控具有重要實(shí)際意義[2]。PEDV 診斷方法包括臨床診斷方法和實(shí)驗(yàn)室診斷方法。在臨床實(shí)踐中，有經(jīng)驗(yàn)的獸醫(yī)可依據(jù)臨床癥狀和病理變化做出初步診斷，但確診需要實(shí)驗(yàn)室的一些特異性檢測(cè)方法。對(duì)于PEDV檢測(cè)，目前常用方法為病毒分離鑒定、熒光抗體、免疫電鏡和核酸檢測(cè)等。病毒分離鑒定周期長(zhǎng)，需要數(shù)天到數(shù)周，不能滿足早期診斷的要求；抗原的免疫學(xué)檢測(cè)方法存在靈敏度較差的問(wèn)題。而核酸檢測(cè)方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、快速、高通量、重復(fù)性好、自動(dòng)化程度高、易標(biāo)準(zhǔn)化操作和試驗(yàn)的生物安全性高等突出優(yōu)點(diǎn)，目前已逐漸成為PEDV檢測(cè)的首選方法，尤其是RT-PCR和熒光定量RT-PCR方法，目前應(yīng)用非常廣泛。但核酸檢測(cè)方法需要比較精密的儀器設(shè)備，而且還需定期檢定，不適用現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)使用[2]。本研究設(shè)計(jì)了一套針對(duì)8個(gè)檢測(cè)區(qū)域的LAMP引物，建立了PEDV RT-LAMP檢測(cè)技術(shù)。靈敏度試驗(yàn)結(jié)果顯示，可在1 h內(nèi)檢出0.2 mL 0.1 TCID50/mL病毒液的病毒核酸，與熒光RT-PCR檢測(cè)方法靈敏度一致。

圖6 陽(yáng)性樣品的RT-LAMP檢測(cè)結(jié)果

圖7 陽(yáng)性樣品熒光RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

研究表明LAMP由于產(chǎn)物量大，開(kāi)蓋檢測(cè)很容易發(fā)生氣溶膠污染，因此許多實(shí)驗(yàn)室都采用更嚴(yán)格的分區(qū)管理措施和加入指示劑進(jìn)行閉管檢測(cè)的方法。本研究使用了0.12 mmol/L HNB作為指示劑實(shí)現(xiàn)了閉管檢測(cè)，陽(yáng)性反應(yīng)管呈現(xiàn)天藍(lán)色，而陰性反應(yīng)管顏色不變，仍為紫羅蘭色。此外，為防止污染，還在反應(yīng)管中加入了20 μL液體石蠟來(lái)封閉反應(yīng)體系，有效防止了檢測(cè)中的氣溶膠污染。在對(duì)送檢的150份糞拭子檢測(cè)中，檢出陽(yáng)性樣品7份，從37份病死豬樣品中，檢出2份小腸組織陽(yáng)性，檢測(cè)結(jié)果與行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的熒光RT-PCR檢測(cè)方法檢測(cè)結(jié)果一致，證實(shí)了方法的實(shí)用性。

4 結(jié)論

一系列試驗(yàn)表明，本研究建立的RT-LAMP檢測(cè)技術(shù)快速、靈敏、特異，可于1 h內(nèi)檢出0.2 mL 0.1 TCID50/mL的病毒RNA，與實(shí)時(shí)熒光RTPCR檢測(cè)方法靈敏度一致，與豬瘟病毒、豬偽狂犬病病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒2型以及豬鏈球菌2型核酸均不發(fā)生交叉反應(yīng)。187份糞拭子及病死豬組織樣品的應(yīng)用檢測(cè)結(jié)果顯示，該方法與熒光定量RT-PCR方法檢測(cè)結(jié)果一致，表明建立的方法適用于送檢樣品的PEDV現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。