徐立蒲，張 文，王小亮，曹 歡，潘 勇，王靜波，王 姝，王 澎，江育林

( 北京市水產(chǎn)技術(shù)推廣站，北京 100176 )

鯉浮腫病毒(Carpedemavirus，CEV)是一種痘病毒，主要感染鯉魚(Cyprinuscarpio)和錦鯉(C.carpiokoi)，引起鯉浮腫病，或稱為錦鯉昏睡病[1-2]。該病能引起鯉魚和錦鯉出現(xiàn)較高的死亡率，病魚表現(xiàn)昏睡、爛鰓、凹眼等臨床癥狀。該病最早報道見于1974年的日本，之后陸續(xù)有北美和歐洲的報道[3-10]。近年來，我國北京、河北、浙江、云南等地養(yǎng)殖的鯉魚和錦鯉多次暴發(fā)一種急性爛鰓癥狀的疾病，死亡率高，造成重大經(jīng)濟(jì)損失，已確認(rèn)該病就是鯉浮腫病[11-16]。之后，全國水產(chǎn)技術(shù)推廣總站相繼在河南等地進(jìn)行了鯉浮腫病的監(jiān)測和流行病學(xué)調(diào)查[17]。調(diào)查結(jié)果表明，鯉魚(包括錦鯉)感染鯉浮腫病毒和發(fā)生鯉浮腫病的現(xiàn)象均較為普遍和嚴(yán)重。鑒于當(dāng)前該病防控形勢嚴(yán)峻，并且目前未見國內(nèi)外對鯉浮腫病的感染方式,尤其是未見魚感染鯉浮腫病毒后各組織器官內(nèi)病毒量動態(tài)變化情況等方面的研究報道?；诖?，在實驗室條件下，筆者比較研究3種不同感染方式下鯉浮腫病毒對錦鯉死亡率的影響，以及鯉浮腫病毒感染錦鯉后在魚體內(nèi)主要組織器官中的分布狀況和病毒量動態(tài)變化情況，以期為鯉浮腫病的檢測、診斷及防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病毒來源

病毒取自2016年北京市順義區(qū)某水產(chǎn)養(yǎng)殖場的50尾確診感染鯉浮腫病毒且有典型癥狀的發(fā)病錦鯉。共取鰓和腎約50 g，混合研磨后按1∶5加入含10%血清的M199細(xì)胞培養(yǎng)液，-80 ℃凍存?zhèn)溆?。使用前，將混合組織液pH調(diào)至7.5，4 ℃、4000 r/min離心15 min，取上清液。經(jīng)TaqMan Real-time PCR檢測，鯉浮腫病毒含量約2.9×105個/μL。

1.2 試驗魚

錦鯉購自北京鑫淼水產(chǎn)公司，全長15～20 cm，體質(zhì)量70～92 g。將魚分組暫養(yǎng)在水族箱內(nèi)，控制水溫為20～22 ℃。每7 d從各個水族箱內(nèi)隨機(jī)取3尾魚，取試驗魚鰓、腎、肝、脾、腦組織及器官，混合研磨后與含10%胎牛血清的M199細(xì)胞培養(yǎng)液按照1∶1比例混勻，凍融1次后用試劑盒抽提核酸，采用nested PCR方法進(jìn)行鯉浮腫病毒檢測[18]。連續(xù)2次檢測確認(rèn)，試驗魚未感染鯉浮腫病毒。

1.3 儀器和試劑

PCR儀為美國ABI Veriti型，熒光定量PCR儀為美國AB 7500型；2×Master PCR Mix購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司，DNA抽提試劑盒為德國QIAGEN公司生產(chǎn)，nested PCR以及TaqMan Real-time PCR所用引物、探針等均購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.4 人工攻毒試驗一

試驗共設(shè)置8個水族箱，編號為1～8號。每箱蓄水為150 L，放養(yǎng)13尾錦鯉。1號、2號為注射組，處理方式為腹腔注射，每尾魚注射0.2 mL的感染病魚的鰓和腎組織上清液(鯉浮腫病毒含量2.9×105個/μL)；3號、4號為劃傷后浸泡組，處理方式為先用針頭劃傷錦鯉體表，再在含2.4×108個/L鯉浮腫病毒的水中浸泡1 h后放回水族箱。5號、6號水族箱為浸泡組，將體表無損傷的魚于含2.4×108個/L鯉浮腫病毒的水中浸泡1 h后放回水族箱。7號、8號水族箱為空白對照組，不感染病毒。浸泡時水溫保持在20 ℃。試驗持續(xù)20 d。期間各試驗組不投喂，充氣泵不間斷充氣，保持水中溶解氧為7～8 mg/L，水溫為20～22 ℃。每3～4 d換水1次，換水量不超過25%。每日記錄死亡情況和臨床癥狀。每尾死亡魚均制為兩份樣品，一份為鰓樣品，一份為腎、肝、脾、腦的混合樣品。此外每日自7號或8號對照箱中抽取1尾魚制樣。

所有樣品制備方法均是稱取質(zhì)量0.5 g，充分勻漿后與500 μL M199細(xì)胞培養(yǎng)液混合。取樣后置-36 ℃凍存，至試驗全部結(jié)束后，統(tǒng)一用nested PCR對樣品進(jìn)行檢測[18]。

1.5 人工攻毒試驗二

試驗設(shè)置8個水族箱，體積為150 L/箱，每箱放20尾錦鯉。按順序編為1～8號，分為2個試驗組，即劃傷后浸泡組和對照組。劃傷后浸泡組設(shè)6個平行箱，編號為1～6號；對照組設(shè)2個平行箱，編號為7號和8號。劃傷后浸泡組處理方式為將健康錦鯉用針頭劃傷體表，在鯉浮腫病毒含量約2.4×108個/L的30 L水中浸泡1 h后放回各水族箱。對照組處理方式為將健康錦鯉用針頭劃傷體表后直接放回水族箱。劃傷浸泡時水溫保持在20 ℃。

試驗共進(jìn)行12 d。試驗期間不投喂，充氣泵不間斷充氣，保持水中溶解氧為7～8 mg/L，水溫為20～22 ℃。每日定時自1～6號箱中各箱隨機(jī)取1尾活魚(棄死魚)。每尾魚逐個器官制樣，即每尾魚均分別取全血、鰓、腦、腎、肝、脾、腸、肌肉組織制樣。鰓、腦、腎、肝、脾、腸、肌肉制備方法是稱取質(zhì)量0.5 g組織，充分勻漿后與500 μL M199細(xì)胞培養(yǎng)液混合；全血制備方法是抽取尾靜脈血500 μL，加500 μL M199細(xì)胞培養(yǎng)液混合。取樣后置-36 ℃凍存，此外每日自7號、8號對照箱中各抽取1尾魚制樣。試驗全部結(jié)束后，所有樣品統(tǒng)一用TaqMan Real-time PCR方法檢測[8]。

1.6 nested PCR檢測鯉浮腫病毒

樣品取200 μL組織上清液，采用試劑盒抽提核酸，參考文獻(xiàn)[18]的nested PCR方法進(jìn)行鯉浮腫病毒檢測。第一次PCR擴(kuò)增的正向引物F1： 5′-GCTGTTGCAACCATTTGAGA-3′，反向引物R1：5′-TGCAGGTTGCTCCTAATCCT-3′，擴(kuò)增該病毒編碼外膜蛋白的4a基因(P4a)中的548 bp片段；第二次擴(kuò)增的正向引物F2：5′-GCTGCTGCACTTTTAGGAGG-3′，反向引物R2：5′-TGCAAGTTATTTCGATGCCA-3′，再從中擴(kuò)增180 bp片段。

1.7 TaqMan Real-time PCR檢測和定量鯉浮腫病毒

以本實驗室制備、保存的4-1C質(zhì)粒(鯉浮腫病毒 P4a基因528 bp)標(biāo)準(zhǔn)品DNA個數(shù)6.0×1010個/μL，對其進(jìn)行10倍系列稀釋。取6.0×108～6.0×100個/μL的稀釋度，每個稀釋度3個平行，用于建立Real-time PCR檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品取200 μL組織上清液，采用試劑盒抽提核酸，按英國環(huán)境、漁業(yè)水產(chǎn)養(yǎng)殖研究中心的TaqMan Real-time PCR方法進(jìn)行鯉浮腫病毒檢測[8]。引物qF1:5′-AGTTTTGTAKATTGTAGCATTCC-3′，qR1:5′-GATTCCTCAAGGAGTTDCAGTAAA-3′，熒光探針probe1:5′-[FAM]+AGAGT TTGTTTCTTGCCATACAAACT+[BHQ]-3′。

組織的病毒載量按下式計算：

病毒載量/個·ng-1={[10(Ct值-38.73)/-3.3606×PCR反應(yīng)終體積20 μL/PCR體系加入的模板量2.5 μL]×抽提DNA終體積200 μL}/抽提核酸用組織量100 mg/1000

1.8 鰓組織病理觀察

試驗對象為人工攻毒試驗一中的錦鯉。在發(fā)病死亡高峰期，取出現(xiàn)昏睡、凹眼、爛鰓等癥狀的瀕死錦鯉和對照組錦鯉，剪取鰓絲，按鰓絲鏡檢法檢測[19]。同時分別取鰓絲室溫保存于10%甲醛固定液中，制備病理組織切片[19]，顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同感染方式對錦鯉感染鯉浮腫病毒的影響

試驗共持續(xù)20 d。空白對照組的魚無死亡；而采用注射、劃傷后浸泡、浸泡3種方式感染病毒的試驗組魚均出現(xiàn)爛鰓、凹眼、昏睡等典型鯉浮腫病癥狀(圖1)，并出現(xiàn)死亡(圖2)。不同感染攻毒方式的死亡率依次為劃傷后浸泡組(88%)>注射組(85%)>浸泡組(35%)(表1)。劃傷后浸泡組和注射組間的死亡率差異不顯著(P>0.05)，但這兩個組均與浸泡組之間存在極顯著差異(P<0.01)。

劃傷后浸泡組試驗魚在試驗第4 d開始出現(xiàn)死亡情況，第5～7 d出現(xiàn)死亡高峰，死亡情況共持續(xù)9 d。試驗開始的4～5 d內(nèi)，發(fā)病錦鯉僅有不同程度的鰓絲損傷，無其他癥狀。至第6～7 d，發(fā)病錦鯉開始出現(xiàn)凹眼以及昏睡癥狀；剪取魚鰓時會出現(xiàn)黑色血液，極快即凝固；發(fā)病錦鯉的體表、鰭條有出血癥狀。第8 d，發(fā)病錦鯉出現(xiàn)了全身浮腫癥狀；剖檢脾淤黑腫大，腹水嚴(yán)重。表現(xiàn)癥狀與報道的鯉浮腫病癥狀基本一致。

浸泡組試驗魚在第5 d開始出現(xiàn)死亡情況，死亡持續(xù)9 d。試驗錦鯉的發(fā)病過程和癥狀與劃傷后浸泡組基本相同，僅死亡率低于劃傷后浸泡組。

注射組試驗魚在試驗第2 d開始出現(xiàn)死亡情況，但第2 d和第3 d死亡數(shù)量均較少，第4 d后死亡情況與劃傷后浸泡組相近，死亡持續(xù)14 d。試驗錦鯉的發(fā)病過程和癥狀與劃傷后浸泡組基本相似。

檢測3種感染方式下死亡錦鯉的鰓樣品以及肝、腎、腦、脾混合樣品，均可擴(kuò)增出鯉浮腫病毒的548 bp和180 bp特異性條帶。而對照組魚不能擴(kuò)增出鯉浮腫病毒特異性條帶(圖3)。

圖1 人工感染病魚癥狀(爛鰓和凹眼)

圖2 3種不同方式感染試驗組魚的累積死亡情況各曲線上標(biāo)注數(shù)字為相應(yīng)時間的累積死亡魚尾數(shù).

圖3 人工感染試驗第7 d死亡錦鯉的nested PCR檢測鯉浮腫病毒電泳示意a：第一輪PCR擴(kuò)增結(jié)果電泳，b：第二輪PCR擴(kuò)增結(jié)果電泳；+：陽性對照，-：對照組鰓、肝、腎、腦、脾的混合樣，C：空白對照；1：注射組的鰓，2：注射組的肝、腎、腦、脾的混合樣；3：劃傷后浸泡組的鰓，4：劃傷后浸泡組的肝、腎、腦、脾的混合樣；5：浸泡組的鰓，6：浸泡組的肝、腎、腦、脾的混合樣.

項目注射組劃傷浸泡組浸泡組對照組1#2#3#4#5#6#7#8#試驗魚數(shù)/尾1313131313131313死亡數(shù)/尾101212114500死亡率/%77929285313800平均死亡率/%8588350

2.2 劃傷后浸泡感染方式下鯉浮腫病毒在不同組織器官中的檢出情況

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒4-1C梯度稀釋后，獲得Real-time PCR擴(kuò)增曲線(圖4)，由左至右依次為6.0×108～6×100個/μL；陰性和空白對照沒有擴(kuò)增。以6.0×108～6.0×100個/μL質(zhì)粒密度的對數(shù)為橫坐標(biāo)，以Real-time PCR反應(yīng)過程中樣品擴(kuò)增達(dá)到閾值水平經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)(3個平行樣Ct值的平均數(shù))為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖5)，標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸系數(shù)為0.999。質(zhì)粒密度與Ct值關(guān)系：Ct=-3.3606lg(質(zhì)粒密度)+38.73。

2.2.2 各組織器官中鯉浮腫病毒的動態(tài)分布情況

錦鯉采用劃傷后浸泡法人工感染鯉浮腫病毒，第1～3 d，各組織中均未檢出鯉浮腫病毒。至第4 d，在鰓組織中首先檢測到鯉浮腫病毒，病毒載量為0.4 個/ng，并且隨著時間的推移鰓組織中鯉浮腫病毒的含量呈上升趨勢，至第7 d達(dá)到峰值，病毒載量為314.8個/ng，隨后病毒載量逐日降低，至第12 d在鰓組織中檢測不到鯉浮腫病毒(表2)。在腎、肝、腦、肌肉和脾組織中也檢出了鯉浮腫病毒，但是鯉浮腫病毒在這些組織中的含量及存在時間均顯著低于鰓組織，表明鰓是鯉浮腫病毒增殖的最主要靶器官。試驗期間在血和腸組織中未檢出鯉浮腫病毒。在對照組魚的各組織中未檢出鯉浮腫病毒。

圖4 Real-time PCR檢測靈敏度試驗由左至右質(zhì)粒梯度依次為6.0×108～6.0×100 個/μL.

圖5 Real-time PCR擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線以6.0×100～6.0×108個/μL梯度的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線擴(kuò)增.

2.3 病魚鰓組織病理觀察

在劃傷后浸泡組感染發(fā)病高峰時，取鰓絲制作水浸片觀察，可見鰓絲末端細(xì)胞增生，呈腫大狀并相互黏附，有融合；末端充血嚴(yán)重，膨大成球狀(圖6)。進(jìn)一步觀察病理組織切片，病魚鰓上皮組織腫脹，并有很多脫落，鰓血管充血和裸露，有血細(xì)胞大量逸出(圖7)。

表2 錦鯉人工感染鯉浮腫病毒后不同組織中平均病毒載量 個/ng

注：NT表示未檢出.

圖6 錦鯉鰓絲水浸片a:對照組錦鯉; b:劃傷后浸泡組發(fā)病錦鯉,鰓絲變粗并相互黏附(空箭頭)、末端充血膨大成球狀(實箭頭).

圖7 錦鯉鰓組織切片a.對照組錦鯉; b.劃傷后浸泡組發(fā)病錦鯉, 箭頭示鰓上皮組織脫落.

3 討 論

3.1 不同方式感染鯉浮腫病毒對錦鯉發(fā)病狀況和死亡率的影響

在注射、劃傷后浸泡、浸泡3種感染方式下，試驗魚均出現(xiàn)了爛鰓、凹眼、昏睡等鯉浮腫病典型癥狀[3-5]，nested PCR檢測也確認(rèn)試驗錦鯉的鰓樣品以及肝、腎、腦、脾混合樣品中存在鯉浮腫病毒，說明可通過人工感染方式感染鯉浮腫病毒。浸泡，特別是劃傷后浸泡可導(dǎo)致錦鯉較高的死亡率(88%)，這也符合痘病毒在動物間的傳播途徑——主要通過皮膚的傷口感染，或由污染環(huán)境的直接或間接傳染[20]。這提示養(yǎng)殖魚類皮膚損傷或寄生蟲叮咬在鯉浮腫病毒感染中起到比較重要的作用。浸泡組死亡率較劃傷后浸泡組低很多，推測當(dāng)錦鯉感染鯉浮腫病毒后，如果體表沒有損傷或其他應(yīng)激刺激，不會導(dǎo)致較高的死亡率。有研究表明，在養(yǎng)殖過程中發(fā)生鯉浮腫病后，施用抗菌或殺蟲藥、換水等應(yīng)激措施會導(dǎo)致鯉魚或錦鯉更高的死亡率[13,17]，本試驗結(jié)果也驗證了這一點(diǎn)。注射組在試驗第2 d即開始出現(xiàn)死魚情況，但檢測結(jié)果顯示，未見病毒增殖，且第2 d死亡數(shù)量較少，第3 d后死亡情況與劃傷后浸泡組相似，前3 d試驗魚的死亡可能因注射損傷所致，非病毒感染所致。

據(jù)國內(nèi)外已有報道，鯉浮腫病發(fā)病水溫范圍較廣，在7～27 ℃時均可發(fā)病[1-7,10-12]。經(jīng)對我國河南等地區(qū)發(fā)生的鯉浮腫病的養(yǎng)殖場流行病學(xué)調(diào)查顯示，發(fā)病一般有兩個高峰，5—6月和9月，這兩個時間段養(yǎng)殖水溫為20～27 ℃[17]。本試驗在20～22 ℃水溫下進(jìn)行，感染死亡率為35%～88%，這與調(diào)查的實際生產(chǎn)中鯉浮腫病發(fā)病死亡率基本一致。但20～22 ℃水溫是否為鯉浮腫病的最適發(fā)病溫度還有待進(jìn)一步研究確定。

3.2 鯉浮腫病毒的主要靶器官及在不同組織內(nèi)的分布和變化情況

溫智清等[14]檢測發(fā)現(xiàn)，云南發(fā)病錦鯉鰓和腎中鯉浮腫病毒載量為1～5 個/ng，鰓中病毒載量約為腎的6～7倍。Adamek等[21]在研究鯉浮腫病毒感染鯉魚的臨床癥狀與鯉魚鰓、皮膚組織中的病毒載量關(guān)系時，發(fā)現(xiàn)鰓組織的平均病毒載量(520 個/ng)顯著高于皮膚組織。本試驗采用劃傷后浸泡感染試驗進(jìn)一步研究了各組織器官中鯉浮腫病毒載量動態(tài)變化情況，在鰓、腎、肝、腦、脾、肌肉組織中均能檢出鯉浮腫病毒，其中鯉浮腫病毒在鰓組織中出現(xiàn)最早(第4 d)、持續(xù)存在時間最長(7～8 d)、含量最高(峰值為314.8 個/ng組織)。在顯微鏡下進(jìn)一步觀察鰓絲水浸片，鰓絲末端細(xì)胞增生，并有融合；觀察鰓絲組織切片，鰓絲血管中血細(xì)胞大量逸出，這些均是鰓有顯著組織病理變化的表現(xiàn)。這表明鰓是鯉浮腫病毒感染的最主要靶器官。推測原因為，痘病毒科種類傳播的主要方式是通過皮膚的傷口感染[20]，鰓絲最易受到寄生蟲或水質(zhì)影響而被破壞，且鰓絲與養(yǎng)殖水中鯉浮腫病毒直接接觸。鰓絲末端細(xì)胞增生的組織病理變化，會嚴(yán)重影響血液的氣體交換，導(dǎo)致魚缺氧，出現(xiàn)浮頭、反應(yīng)遲緩、甚至死亡。研究結(jié)果還顯示，除鰓外，鯉浮腫病毒在腎組織內(nèi)載量較低并能持續(xù)存在4～5 d；鯉浮腫病毒在肝、腦、脾、肌肉(含皮膚)組織內(nèi)載量低且存在時間短。在感染的第12 d，包括鰓在內(nèi)的各組織已經(jīng)檢測不出鯉浮腫病毒。因此在開展鯉浮腫病監(jiān)測及檢測工作時，建議主要取鰓和腎組織。

不同感染方式對錦鯉感染鯉浮腫病毒影響的試驗結(jié)果顯示，劃傷后浸泡組試驗魚第4 d開始出現(xiàn)死亡，第5～7 d出現(xiàn)死亡高峰，死亡共持續(xù)9 d。劃傷后浸泡組試驗魚各組織器官中鯉浮腫病毒的動態(tài)分布情況顯示，錦鯉感染鯉浮腫病毒后有3 d的潛伏期，然后病毒大量增殖，在第7～9 d到達(dá)高峰，隨后病毒量開始逐漸下降。上述兩個試驗結(jié)果顯示，錦鯉感染鯉浮腫病毒后的死亡情況和病毒增殖情況基本同步，這也與實際生產(chǎn)中發(fā)病死亡過程相似。綜上認(rèn)為，在20～22 ℃，錦鯉感染鯉浮腫病毒有3～5 d的潛伏期，發(fā)病時間持續(xù)約9 d，隨后各組織中病毒含量下降直至消失，這一現(xiàn)象提示魚能夠產(chǎn)生足夠的免疫力，這也為用疫苗控制鯉浮腫病提供了可能性。關(guān)于魚感染鯉浮腫病毒后抗體產(chǎn)生和細(xì)胞免疫的變化情況，還有待于進(jìn)一步的深入研究。建議在進(jìn)行鯉浮腫病毒監(jiān)測時，最好抽取正在發(fā)病的魚或尚未發(fā)病的魚作為樣本；如果取發(fā)病停止后存活的魚為樣本，則易得到假陰性檢測結(jié)果，造成漏檢。