朱鳴陽(yáng)

（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，重慶 400010）

益生菌被世界衛(wèi)生組織（WHO）定義為攝入適當(dāng)?shù)牧繉?duì)食用者健康有益的一類活的微生物的總稱，普遍應(yīng)用于生物工程、食品安全、生命健康以及畜牧業(yè)等領(lǐng)域。在國(guó)外已經(jīng)研究出很多益生菌保健產(chǎn)品[1]。唾液鏈球菌（Streptococcus salivarius），原名嗜熱鏈球菌，是用于酸奶發(fā)酵的兩個(gè)重要菌株之一，屬于口腔正常菌群[2]。與正常人相比，口腔中的唾液鏈球菌數(shù)量較少者更容易口臭，這是由于口腔內(nèi)一種革蘭氏陰性厭氧菌代謝生成的一種揮發(fā)性硫化物是引起的[3]。研究表明，唾液鏈球菌最先在嬰幼兒的口腔中存在，能夠產(chǎn)生一種可參與機(jī)體生物屏障的構(gòu)成，維持機(jī)體口腔菌群生態(tài)穩(wěn)定的細(xì)菌素，抑制與口臭有關(guān)系的細(xì)菌[4]。此外，發(fā)酵過(guò)程中添加唾液鏈球菌使得酸奶的黏度有所增加，增強(qiáng)了酸奶的風(fēng)味。同時(shí)，唾液鏈球菌與保加利亞乳桿菌一起發(fā)酵還存在共生效應(yīng)，唾液鏈球菌在生長(zhǎng)可以生成甲酸，刺激保加利亞乳桿菌繁殖，而保加利亞乳桿菌可分解酪蛋白形成多種氨基酸以及多肽，促進(jìn)唾液鏈球菌的新陳代謝[5]。

本論文首先從美國(guó)Now foods公司生產(chǎn)的“諾奧清益口含片BLIS K12”中分離篩選得到唾液鏈球菌，并根據(jù)唾液鏈球菌對(duì)生長(zhǎng)所需的六大營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不同需求設(shè)計(jì)了固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)條件，觀察唾液鏈球菌的生長(zhǎng)狀況并對(duì)培養(yǎng)條件其進(jìn)行優(yōu)化。進(jìn)行放大培養(yǎng)后，用平板活菌計(jì)數(shù)法檢測(cè)活菌數(shù)量，并進(jìn)行凍干處理，得到唾液鏈球菌菌粉，并總結(jié)出一條完整的工藝生產(chǎn)路線。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

菌株從美國(guó)Now foods公司生產(chǎn)“諾奧清益口含片BLIS K12”中分離篩選獲得。

1.2 試驗(yàn)試劑

牛肉膏、胰蛋白胨、酪蛋白胨，淀粉、瓊脂、酵母膏、葡萄糖、蔗糖、乙酸鈉、檸檬酸二胺、氯化鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、硫酸錳、氯化鈣、VitB1、脫脂乳、谷氨酸鈉、吐溫-80、甘油。均為化學(xué)純。

1.3 儀器與設(shè)備

SPX-250-III生化培養(yǎng)箱，上海躍進(jìn)有限公司產(chǎn)品；MA240D型電子天平，上海第二天平儀器廠產(chǎn)品；LS-35LD高壓滅菌鍋，蘇州江東精密儀器有限公司產(chǎn)品；DNM-9606酶標(biāo)分析儀，北京普朗醫(yī)療有限公司產(chǎn)品；LGJ-100F冷凍干燥機(jī)，松源凍干有限公司產(chǎn)品。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4.1 固體培養(yǎng)條件篩選

參考已有文獻(xiàn)對(duì)唾液鏈球菌的理化特性設(shè)計(jì)了四種不同的固體培養(yǎng)基，分別為：

唾液鏈球菌培養(yǎng)基[6]：牛肉膏4 g，蛋白胨2 g，淀粉4 g，瓊脂3 g，蒸餾水200 mL，pH7.2。

MRS培養(yǎng)基[6]：酪蛋白胨2 g，牛肉膏2 g，酵母膏1 g，葡萄糖1 g，乙酸鈉1 g，檸檬酸二胺0.4 g，吐溫-80 0.2 g，磷酸氫二鉀0.4 g，硫酸鎂0.04 g，硫酸錳 0.001 g，碳酸鈣 4 g，瓊脂 3 g，蒸餾水 200 mL，pH7.2。

乳酸菌培養(yǎng)基[7]：酵母膏1.5 g，胰蛋白胨1.5 g，葡萄糖2 g，磷酸二氫鉀0.4 g，西紅柿汁20 mL，吐溫-80 0.2 g，蒸餾水200 mL，pH7.2。

Eliker瓊脂培養(yǎng)基[8]：胰蛋白胨4 g，蔗糖1 g，酵母膏1 g，氯化鈉 0.8 g，乙酸鈉0.3 g，葡萄糖1g，Vc0.01 g，乳糖1 g，瓊脂3 g，蒸餾水200 mL，pH7.2。

將配制好的培養(yǎng)基放入高壓滅菌鍋中進(jìn)行121℃滅菌20 min，待其還未凝固前傾注入滅菌平板及斜面中備用。

隨后37℃下置于普通培養(yǎng)箱及CO2的體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，記錄此時(shí)為0 h，分別于12、24、48、72 h觀察菌落的生長(zhǎng)情況。

1.4.2 液體培養(yǎng)條件篩選

參照唾液鏈球菌的理化性質(zhì)以及之前用到的固體培養(yǎng)條件，設(shè)計(jì)兩種液體培養(yǎng)條件[9],分別為：乳糖7 g，蔗糖3.5 g，葡萄糖3.5 g，胰蛋白胨14 g，酪蛋白胨7 g，酵母膏7 g，磷酸氫二鉀/磷酸二氫鉀0.02 mol/L，硫酸鎂200 mg/L，硫酸錳100 mg/L，氯化鈣60 mg/L，VitB1 10 mg/L，蒸餾水1 L的比例配制200 mL的液體培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)pH為7.2；考察不含VitB1而其他條件與前述培養(yǎng)基一致的條件下對(duì)唾液鏈球菌生長(zhǎng)的影響。

將經(jīng)過(guò)三次傳代的單菌落接種到新的斜面中，靜置培養(yǎng)18 h，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的唾液鏈球菌接種3環(huán)至200 mL的培養(yǎng)液中，搖勻后37℃下置于體積分?jǐn)?shù)為5%CO2的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，記錄此時(shí)為0 h，分別于2、4、8、12、24 h取樣，用酶標(biāo)儀測(cè)量分光光度值。

1.4.3 放大培養(yǎng)及活菌計(jì)數(shù)

確定好液體培養(yǎng)條件后按照相應(yīng)的比例進(jìn)行放大培養(yǎng)，培養(yǎng)液總量為5 L，分別裝入12個(gè)錐形瓶中，12 h后進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，將待測(cè)樣品取樣稀釋104、105、106倍，分別將三個(gè)稀釋度的樣品吸取200 μL倒入適量冷卻到45℃左右試驗(yàn)1.4.1中的唾液鏈球菌培養(yǎng)基和MRS培養(yǎng)基中，混勻，冷卻。待凝固后，按照試驗(yàn)1.4.1的條件培養(yǎng)，此過(guò)程嚴(yán)格無(wú)菌操作。培養(yǎng)24 h之后進(jìn)行平板活菌數(shù)計(jì)數(shù)，公式為：cfu/mL＝平板中單菌落的平均數(shù)×稀釋倍數(shù)×5。

1.5 凍干

放大培養(yǎng)12 h后，在進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)的同時(shí)，收集菌液，此時(shí)的唾液鏈球菌應(yīng)處于平臺(tái)期。將菌液在無(wú)菌條件下轉(zhuǎn)移到離心杯中，轉(zhuǎn)速3 500 rpm，20℃離心15 min，棄掉上清，加入3倍體積的無(wú)菌生理鹽水，再次3 500 rpm，20℃離心15 min，此過(guò)程重復(fù)3次，收集沉淀，轉(zhuǎn)移到無(wú)菌平板中進(jìn)行凍干處理。

按照10%的脫脂乳、1.5%的谷氨酸鈉、3%的甘油[10-13]配制為凍干保護(hù)劑，將加入保護(hù)劑后的菌液放入-60℃冰箱2 h進(jìn)行預(yù)凍，之后再轉(zhuǎn)移到凍干機(jī)里進(jìn)行凍干，48 h后收集產(chǎn)品，稱重。

2 結(jié)果與討論

2.1 固體培養(yǎng)條件篩選結(jié)果

本次試驗(yàn)中唾液鏈球菌固體培養(yǎng)采用了分別放入兩種培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，從表1和表2的對(duì)比可以看出，相同條件下放入CO2的體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中的平板上菌落生長(zhǎng)的情況更好，這可能是因?yàn)橥僖烘溓蚓且环N兼性厭氧型細(xì)菌，所以加入5%的CO2可以刺激唾液鏈球菌更好的生長(zhǎng)。

表1 不同固體培養(yǎng)基上唾液鏈球菌生長(zhǎng)情況（普通培養(yǎng)箱）

表2 不同固體培養(yǎng)基上唾液鏈球菌生長(zhǎng)情況（CO2的體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱）

對(duì)于四種不同的培養(yǎng)基：

第一種為普通唾液鏈球菌培養(yǎng)基，并未額外加入其他的無(wú)機(jī)鹽離子，維生素等。在CO2的體積分?jǐn)?shù)為5%培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，可觀察到平板上有較小的單菌落出現(xiàn)，數(shù)量適中。培養(yǎng)48 h后可見(jiàn)較大單菌落。

第二種為MRS培養(yǎng)基，除了加入必要的碳源和氮源之外，還額外加入了無(wú)機(jī)鹽離子乙酸鈉、檸檬酸二胺、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硫酸錳、碳酸鈣。在含有5%的CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后，可觀察到平板上有大量單菌落出現(xiàn)，24 h后可見(jiàn)較大的單菌落。

第三種為乳酸菌培養(yǎng)基，其中除了碳源氮源外，還額外加入了磷酸二氫鉀和鮮榨的西紅柿汁。但只有在含有CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后出現(xiàn)了菌落。

第四種是Eliker瓊脂培養(yǎng)基，其中將碳源更改為乳糖，并額外加入了無(wú)機(jī)鹽離子氯化鈉和乙酸鈉，以及抗壞血酸。但從結(jié)果顯示菌落生長(zhǎng)的情況和普通唾液鏈球培養(yǎng)基似。

2.2 唾液鏈球菌液體培養(yǎng)結(jié)果

本次試驗(yàn)中對(duì)比了兩種液體培養(yǎng)基，主要區(qū)別是1號(hào)瓶中加入了VitB1作為唾液鏈球菌的促生長(zhǎng)因子。

2.3 放大培養(yǎng)結(jié)果

放大培養(yǎng)后，培養(yǎng)液稀釋106倍和107倍，采用普通唾液鏈球菌培養(yǎng)基進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，試驗(yàn)結(jié)果如表3所示。

圖1 不同液體培養(yǎng)基中唾液鏈球菌生長(zhǎng)情況

表3 放大培養(yǎng)后活菌計(jì)數(shù)

2.4 唾液鏈球菌的放大培養(yǎng)后凍干結(jié)果

最終得到的凍干好的菌粉共計(jì)10.9 g，活菌數(shù)達(dá)到4.9×1011cfu/g。

3 結(jié)論

經(jīng)過(guò)篩選得出唾液鏈球菌固體培養(yǎng)最優(yōu)的條件是：酪蛋白胨2 g，牛肉膏2 g，酵母膏1 g，葡萄糖1 g，乙酸鈉1 g，檸檬酸二胺0.4 g，吐溫-80 0.2 g，磷酸氫二鉀0.4 g，硫酸鎂0.04 g，硫酸錳0.001 g，碳酸鈣4 g，瓊脂3 g，蒸餾水200 mL，pH 7.2，溫度37 ℃下在CO2的體積分?jǐn)?shù)為5%培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。但由于配制MRS培養(yǎng)基較為復(fù)雜，需要按順序加入無(wú)機(jī)鹽，在工業(yè)生產(chǎn)中，采用普通唾液鏈球菌培養(yǎng)基條件（牛肉膏4 g，蛋白胨2 g，淀粉4 g，瓊脂3 g，蒸餾水200 mL，pH 7.2）是工業(yè)生產(chǎn)中較好的選擇。

最優(yōu)的液體培養(yǎng)條件為：乳糖7 g，蔗糖3.5 g，葡萄糖3.5 g，胰蛋白胨14 g，大豆蛋白胨7 g，酵母提取物7 g，磷酸氫二鉀/磷酸二氫鉀0.02 mol/L，硫酸鎂200 mg/L，硫酸錳100 mg/L，氯化鈣60 mg/L，VitB1 10 mg/L，蒸餾水1 L的比例配制液體培養(yǎng)基，pH7.2，溫度37℃下在含有5%的CO2的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。此外從圖1中可以看出，唾液鏈球菌在培養(yǎng)4 h左右進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，12 h左右進(jìn)入平臺(tái)期。要收集唾液鏈球菌可以選擇在12 h左右進(jìn)行收集，這為工業(yè)生產(chǎn)提供了有效的信息。