周意，盧金清，陳尊岱，孟佳敏，肖宇碩

(湖北中醫(yī)藥大學(xué)/湖北省藥用植物研發(fā)中心，湖北 武漢 430065)

金錢(qián)草LysimachiachristinaeHance為報(bào)春花科珍珠菜屬的多年生草本藥用植物；廣金錢(qián)草為豆科植物廣金錢(qián)草Desmodiumstyracifolium(Osb.)Merr.的干燥地上部分，異名馬蹄草、落地金錢(qián)[1-2]。金錢(qián)草和廣金錢(qián)草均有利濕退黃，利尿通淋之效，為中醫(yī)治療結(jié)石常用藥，但臨床用藥亦有區(qū)別，各有側(cè)重[3]。金錢(qián)草主要含黃酮類(lèi)、酚類(lèi)、內(nèi)酯類(lèi)、甾醇類(lèi)、鞣制、揮發(fā)油等化學(xué)成分；廣金錢(qián)草主要含黃酮類(lèi)、生物堿類(lèi)、萜類(lèi)、甾醇類(lèi)、酚酸類(lèi)、揮發(fā)油等化學(xué)成分[4-5]。近年來(lái)市售金錢(qián)草常有偽品混入或混用的情況，多由金錢(qián)草和廣金錢(qián)草同名異物所致[6]，影響金錢(qián)草應(yīng)有療效的發(fā)揮，因此，區(qū)分二者十分必要。目前主要依據(jù)性狀、顯微和理化特征對(duì)金錢(qián)草和廣金錢(qián)草加以區(qū)分，也有采用薄層鑒別和ITS2序列鑒別[7]，這些方法各有局限。頂空固相微萃取技術(shù)集取樣、萃取、濃縮和進(jìn)樣于一體，具有操作簡(jiǎn)便快捷、無(wú)需溶劑、取樣量少等特點(diǎn)，在中藥材真?zhèn)舞b別上有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[8]。目前有關(guān)金錢(qián)草和廣金錢(qián)草揮發(fā)性成分的研究報(bào)道較少，本實(shí)驗(yàn)首次采用頂空固相微萃取法結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)(HS-SPME-GC-MS)對(duì)金錢(qián)草和廣金錢(qián)草的揮發(fā)性成分進(jìn)行分析，為金錢(qián)草和廣金錢(qián)草藥材的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和藥理藥效研究奠定基礎(chǔ)，并通過(guò)比較二者揮發(fā)性成分之間的差異，為快速鑒別金錢(qián)草和廣金錢(qián)草提供新思路。

1 儀器和材料

1.1 儀器

Agilent 6890/5973氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)Hewlett-Packard公司)；C-MAG HS-4磁力加熱攪拌器(德國(guó)IKA公司)；手動(dòng)固相微萃取進(jìn)樣器(美國(guó)Supelco公司)；頂空瓶(15 mL)；65 μm聚二甲基硅氧烷-二乙烯基苯(PDMS/DVB)萃取頭及100 μm聚二甲基硅氧烷(PDMS)萃取頭(美國(guó)Supelco公司)；ALC-210.2型電子天平(北京賽多利斯天平有限公司)。

1.2 藥材

金錢(qián)草和廣金錢(qián)草購(gòu)于湖北強(qiáng)康中藥飲片有限公司，經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)張秀橋教授鑒定分別為報(bào)春花科植物過(guò)路黃LysimachiachristinaeHance的干燥全草和豆科植物廣金錢(qián)草Desmodiumstyracifolium(Osb.)Merr.的干燥地上部分。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 GC-MS色譜與質(zhì)譜條件

色譜柱：HP-5MS石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；升溫程序：從50 ℃開(kāi)始，先以10 ℃·min-1升溫至90 ℃，再以2 ℃·min-1升溫至106 ℃，然后以10 ℃·min-1升溫至120 ℃，最后以8 ℃·min-1升溫至215 ℃；載氣：高純度He(99.999%)，柱流速：0.8 mL·min-1，進(jìn)樣口溫度：230 ℃；EI源；離子源溫度：230 ℃；電離電壓：70 eV；四級(jí)桿溫度：150 ℃；掃描質(zhì)量范圍：35～550 m/z。

2.2 頂空固相微萃取條件的優(yōu)化

選取影響萃取效果的萃取頭種類(lèi)、樣品用量、萃取溫度、萃取時(shí)間、平衡時(shí)間、解吸附時(shí)間為考察因素，通過(guò)單因素試驗(yàn)，以物質(zhì)出峰總峰面積為考察指標(biāo)，確定最佳萃取條件。

2.2.1 萃取頭的選擇 本實(shí)驗(yàn)采用65 μm PDMS/DVB、100 μm PDMS兩種不同類(lèi)型的萃取頭分別對(duì)金錢(qián)草樣品進(jìn)行萃取，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析。經(jīng)比較后顯示，65 μm PDMS/DVB萃取頭吸附得到的金錢(qián)草易揮發(fā)性成分有效峰個(gè)數(shù)和總峰面積明顯大于100 μm PDMS萃取頭，故選用65 μm PDMS/DVB萃取頭。

2.2.2 樣品用量的選擇 由圖1可知，當(dāng)樣品用量≥0.5 g時(shí)，萃取頭吸附量已基本達(dá)到飽和，故選擇0.5 g為最佳樣品用量。

圖1 樣品用量-總峰面積折線圖

2.2.3 萃取溫度的選擇 由圖2可知，當(dāng)萃取溫度為110 ℃時(shí)，總峰面積達(dá)到最大，隨著溫度的繼續(xù)升高，吸附量逐漸下降，可能是由于溫度過(guò)高，揮發(fā)性物質(zhì)不穩(wěn)定，發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，故選取110 ℃為最佳萃取溫度。

圖2 萃取溫度-總峰面積折線圖

2.2.4 萃取時(shí)間的選擇 由圖3可知，當(dāng)萃取時(shí)間為15 min時(shí)，總峰面積達(dá)到最大，隨著萃取時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng)，總峰面積有所下降，可能是由于萃取時(shí)間延長(zhǎng)導(dǎo)致萃取頭固有成分的流失，萃取能力下降，故選取15 min為最佳萃取時(shí)間。

2.2.5 平衡時(shí)間的選擇 由圖4可知，當(dāng)平衡時(shí)間為15 min時(shí)，總峰面積達(dá)到最大，萃取金錢(qián)草揮發(fā)性物質(zhì)的效果最佳，故選取15 min為最佳平衡時(shí)間。

圖3 萃取時(shí)間-總峰面積折線圖

圖4 平衡時(shí)間-總峰面積折線圖

2.2.6 解吸附時(shí)間的選擇 由圖5可知，當(dāng)解吸附時(shí)間為3 min時(shí)，總峰面積達(dá)到最大，隨著解吸附時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng)，總峰面積呈下降趨勢(shì)，可能是由于解吸附時(shí)間延長(zhǎng)，一些揮發(fā)性物質(zhì)在高溫條件下易分解，故選取3 min為最佳解吸附時(shí)間。

綜合單因素考察結(jié)果，確定頂空固相微萃取的最佳實(shí)驗(yàn)條件為：金錢(qián)草粗粉0.5 g，置于15 mL頂空瓶中，插入經(jīng)老化的裝有65 μm PDMS/DVB萃取頭的手動(dòng)進(jìn)樣器，在110 ℃下平衡15 min后，再壓縮手柄伸出萃取頭萃取15 min，取出，立即插入氣相色譜儀進(jìn)樣口(溫度230 ℃)解析3 min，不分流進(jìn)樣。廣金錢(qián)草條件同上。

圖5 解吸附時(shí)間-總峰面積折線圖

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)化學(xué)工作站數(shù)據(jù)處理及用面積歸一化法從各總離子流圖中計(jì)算各組分相對(duì)百分含量，按各峰的質(zhì)譜圖經(jīng) NIST質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，并結(jié)合相對(duì)保留時(shí)間，確定各個(gè)組分。從金錢(qián)草中檢測(cè)出26個(gè)峰，鑒定出22種成分，占總揮發(fā)性成分的90.38%；從廣金錢(qián)草中檢測(cè)出17個(gè)峰，鑒定出11種成分，占總揮發(fā)性成分的79.33%。具體結(jié)果見(jiàn)圖6、圖7以及表1。

圖6 金錢(qián)草揮發(fā)性成分總離子流圖

圖7 廣金錢(qián)草揮發(fā)性成分總離子流圖

峰號(hào)保留時(shí)間/min化合物名稱(chēng)分子式相對(duì)百分含量(%)金錢(qián)草廣金錢(qián)草12.01Methylcyclopropanemethanol 1-甲基環(huán)丙烷甲醇C5H10O1.69—22.8Hexanal 己醛C6H12O2.114.0733.4Leaf aldehyde 青葉醛C6H10O1.582.7843.98Heptanal 庚醛C7H14O2.40—54.81trans-2-Heptenal (E)-2-庚烯醛C7H12O2.53—64.811-Hexyn-3-ol 己炔醇C6H10O—2.6375.151-Decen-3-one 1-癸烯-3-酮C10H18O1.26—85.151-Octen-3-one 1-辛烯-3-酮C8H14O—2.9395.28Methylheptenone 甲基庚烯酮C8H14O5.33—105.382-Pentylfuran 2-戊基呋喃C9H14O2.73—115.58trans,trans-2,4-Heptadienal反式-2,4-庚二烯醛C7H10O5.87—126.82(E)-2-Octenal 反-2-辛烯醛C8H14O3.33—137.186-Methyl-1-heptanol 6-甲基-1-庚醇C8H18O4.07—147.97Nonanal 壬醛C9H18O17.7024.921511.09Dodecane 十二烷C12H263.755.911611.36Decanal 癸醛C10H20O5.165.831714.5Tridecane 十三烷C13H289.4520.221816.44Copaene α-蒎烯C15H244.68—1916.9Tetradecane 十四烷C14H302.50—2017.13Tetradecanal 肉豆蔻醛C14H28O2.81—2117.41l-Caryophyllene 1-石竹烯C15H243.653.132218Geranylacetone 香葉基丙酮C13H22O1.472.542318.731-Pentadecene 十五烯C15H30—4.372419.42l-Calamenene l-菖蒲烯C15H221.81—2520.613,11-Tetradecadien-1-ol 3,11-十四碳二烯-1-醇C14H26O4.5—

注：“—”表示成分不存在于該植物中。

4 討論

研究結(jié)果顯示，金錢(qián)草和廣金錢(qián)草揮發(fā)性成分種類(lèi)和含量均有一定差異。從金錢(qián)草中檢測(cè)出26個(gè)峰，鑒定出22種成分，占總揮發(fā)性成分的90.38%，主要為醛類(lèi)(43.49%)、烷烴類(lèi)(15.70%)、醇類(lèi)(10.26%)及烯類(lèi)(10.14%)成分，其中，含量最高的為壬醛，占揮發(fā)性成分的17.70%，其次主要為十三烷(9.45%)、癸醛(5.16%)、α-蒎烯(4.68%)、1-石竹烯(3.65%)等；從廣金錢(qián)草中檢測(cè)出17個(gè)峰，鑒定出11種成分，占總揮發(fā)性成分的79.33%，主要為醛類(lèi)(37.60%)及烷烴類(lèi)(26.13%)成分，其中，含量最高的為壬醛，占揮發(fā)性成分的24.92%，其次主要為十三烷(20.22%)、十二烷(5.91%)、癸醛(5.83%)、己醛(4.07%)等。金錢(qián)草和廣金錢(qián)草含共有成分8種(己醛、青葉醛、壬醛、十二烷、癸醛、十三烷、1-石竹烯和香葉基丙酮)，分別占總揮發(fā)性成分的44.87%和69.40%。金錢(qián)草和廣金錢(qián)草揮發(fā)性成分差異明顯，容易區(qū)分，本實(shí)驗(yàn)可為快速鑒別金錢(qián)草和廣金錢(qián)草提供新思路。

壬醛天然存在于德國(guó)玫瑰、橙花油、錫蘭桂皮油等精油中，是精油發(fā)揮抗菌作用的重要物質(zhì)基礎(chǔ)[9]；癸醛天然存在于玫瑰油、檸檬草油、胡荽子油、柑桔油、鳶尾根油、橙花油等中，具有良好的抑菌作用[10]；α-蒎烯天然存在于400多種精油中，具有鎮(zhèn)咳、祛痰、抗炎、抗真菌、抗腫瘤等作用[11-12]；1-石竹烯天然存在于丁香油、丁香莖油、錫蘭桂皮油、肉桂葉油、薰衣草油、百里香油、胡椒油、甘椒油等精油中，具有鎮(zhèn)靜中樞神經(jīng)、保護(hù)胃黏膜、抗菌抗炎、鎮(zhèn)咳祛痰、抗焦慮作用[13]。金錢(qián)草和廣金錢(qián)草中的這些揮發(fā)性成分不僅能為二者的藥理作用提供支撐，還能為其進(jìn)一步研究提供物質(zhì)基礎(chǔ)。