鮑 和，張昌龍，蘇婭萍，高 陽，張海龍 *

(1.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥學(xué)部，西安 710004；2.西安交通大學(xué)藥學(xué)院，西安 710061)

心腦血管疾病是人類健康的第一大殺手，而高脂血癥是動脈粥樣硬化和冠心病發(fā)病的最危險(xiǎn)因素[1]。高脂血癥的發(fā)病機(jī)制和降脂藥物的作用機(jī)制需要深入研究，建立和選擇理想的高脂血癥動物模型是開展相關(guān)實(shí)驗(yàn)、研究脂質(zhì)代謝紊亂的關(guān)鍵?，F(xiàn)已在大鼠、小鼠、豚鼠、金黃地鼠、家兔、小型豬、犬、禽類和靈長類等實(shí)驗(yàn)動物上建立了高脂血癥模型[2-5]。小鼠因其價(jià)格便宜、進(jìn)食量小、給藥量小、造模成本低、灌胃或采樣方便、容易操作等優(yōu)點(diǎn)成為一種重要的高脂血癥動物模型。

高脂血癥動物模型主要有先天性、轉(zhuǎn)基因和飲食或化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)3種[6]。前2種由于價(jià)格昂貴和來源限制，不能廣泛應(yīng)用，飲食或化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)應(yīng)用最為廣泛，主要包括兩類，一類是利用高脂飼料喂飼或灌胃一段時(shí)間后形成的；另一類是利用化學(xué)試劑通過靜脈或腹腔注射一次性形成的。高脂飼料長期喂飼產(chǎn)生的高脂血癥與人類長期食用高熱量食物產(chǎn)生的高脂血癥十分接近，因此這種動物模型是較為理想的降脂新藥篩選的模型。

1 儀器與材料

1.1儀器 Multifuge X1R離心機(jī)(德國Heraeus公司)；渦旋混合儀，組織勻漿機(jī)(德國IKA公司)；Synergy HT酶標(biāo)儀(美國Bio-Tek儀器有限公司)；精密天平(瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司)。

1.2試藥 膽固醇，膽酸鈉(平頂山市慧生源生物制品有限公司)；蔗糖及阿拉伯膠(天津市褔晨化學(xué)試劑廠)；豬油(實(shí)驗(yàn)室自制)；非諾貝特片(上海信誼萬象藥業(yè)股份有限公司)；三酰甘油、總膽固醇和葡萄糖試劑盒(北京北化康泰臨床試劑有限公司)。

1.3動物 昆明種小鼠，體質(zhì)量為18～22 g；C57BL/6小鼠，體質(zhì)量為18～20 g。均為雄性，SPF級，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部動物實(shí)驗(yàn)中心提供。

2 方法

2.1高脂飼料配方(質(zhì)量分?jǐn)?shù))及給藥方案 高脂飼料1：蔗糖(10%)、豬油(15%)、膽固醇(2%)、膽酸鈉(0.2%)和基礎(chǔ)飼料(72.8%)[6]；高脂飼料2：蔗糖(10%)、豬油(15%)和基礎(chǔ)飼料(75%)；高脂飼料3：蔗糖(50%)、豬油(20%)和基礎(chǔ)飼料(30%)；高脂飼料4：蔗糖(10%)、豬油(45%)和基礎(chǔ)飼料(45%)。先將蔗糖用適量溫水溶解，再用此溫?zé)岬恼崽撬芤簩⒇i油溶解，與基礎(chǔ)飼料和其他成分充分?jǐn)嚢杌靹蚝笾瞥芍睆綖? cm的圓柱，烘干備用。用4種飼料分別喂飼小鼠2～8周，每天記錄體質(zhì)量和進(jìn)食量。

2.2實(shí)驗(yàn)及分組 實(shí)驗(yàn)一：30只雄性昆明種小鼠，體質(zhì)量為18～22 g，隨機(jī)分成3組，每組10只，正常組喂飼普通飼料,對照組喂飼高脂飼料1，陽性對照組喂飼高脂飼料1和非諾貝特。喂飼4周后，每日灌胃，給予正常組小鼠蒸餾水，對照組50 g·L-1的阿拉伯膠溶液，陽性對照組給予非諾貝特(100 mg·kg-1)，連續(xù)4周，每日稱定體質(zhì)量，計(jì)算進(jìn)食量。在第8周結(jié)束時(shí)，乙醚麻醉狀態(tài)下眼眶取血，離心，測血漿總膽固醇和三酰甘油的水平；解剖小鼠，取附睪、副腎、腸系膜處脂肪和肝臟，分別稱定質(zhì)量，計(jì)算肝臟指數(shù)=(肝質(zhì)量÷體質(zhì)量)×100%。精密稱取100 mg肝臟，加入3 mL蒸餾水，勻漿后測定其中三酰甘油和總膽固醇的含量。

實(shí)驗(yàn)二：20只雄性昆明種小鼠，體質(zhì)量為18～22 g，隨機(jī)分成2組，每組10只。正常組喂飼高脂飼料1，模型組喂飼高脂飼料2，4周后，按照實(shí)驗(yàn)一項(xiàng)下方法測定血漿及肝臟中三酰甘油和總膽固醇的水平，考察膽固醇和膽酸鈉的有無對血脂和肝臟中脂肪含量的影響。

實(shí)驗(yàn)三：20只雄性C57BL/6小鼠，體質(zhì)量為18～20 g，隨機(jī)分成2組，每組10只。正常組喂飼普通飼料，模型組喂飼高脂飼料1，4周后，按照實(shí)驗(yàn)一項(xiàng)下方法測定血漿中三酰甘油和總膽固醇的水平，考察同一種高脂飼料對不同種系小鼠高脂血癥成模的區(qū)別。

實(shí)驗(yàn)四：20只雄性C57BL/6小鼠，體質(zhì)量為18～20 g，隨機(jī)分成2組，每組10只。正常組喂飼普通飼料，模型組喂飼高脂飼料1，4周后，模型組中的小鼠恢復(fù)普通飼料喂飼1周，按照實(shí)驗(yàn)一項(xiàng)下方法測定血漿中三酰甘油和總膽固醇的水平，考察已成高脂血癥模型的持久性，即高脂血癥小鼠在恢復(fù)普通飼料喂飼后總膽固醇和三酰甘油水平是否可逆。

(3)為與國際礦產(chǎn)資源資產(chǎn)評估規(guī)范接軌，SME成立了SME評估標(biāo)準(zhǔn)委員會，積極參與國際評估規(guī)范的商討。

實(shí)驗(yàn)五：30只雄性C57BL/6小鼠，體質(zhì)量為18～20 g，隨機(jī)分成3組，每組10只。正常組喂飼普通飼料，模型1組喂飼高脂飼料3，模型2組喂飼高脂飼料4，4周后，按照實(shí)驗(yàn)一項(xiàng)下方法測定血漿中三酰甘油和總膽固醇的水平，考察以高糖為主的高脂飼料3和豬油為主的高脂飼料4對高脂血癥成模的影響。

2.3血清脂質(zhì)的測定 動物禁食12 h后，用乙醚麻醉，眼眶取血，以12 000 r·min-1離心5 min，及時(shí)分離出血清，按照試劑盒方法測定血清中的三酰甘油、總膽固醇或血糖水平。

2.4肝臟組織勻漿及脂質(zhì)的測定 精密稱取小鼠肝臟組織100.0 mg，置于裝有3 mL蒸餾水的離心管中，用組織勻漿機(jī)充分勻漿后，按照試劑盒方法測定肝組織勻漿液中三酰甘油和總膽固醇的水平。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1高脂飼料1對昆明種小鼠體質(zhì)量、進(jìn)食量、血脂及內(nèi)臟脂肪含量的影響 見圖1。由圖1可知，實(shí)驗(yàn)結(jié)果各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與正常組比較，高脂飼料并沒有使小鼠的體質(zhì)量明顯增加，相反，模型組小鼠的體質(zhì)量一直比正常組小鼠體質(zhì)量增加的少。陽性對照組的情況與模型組類似。這可能是由于該高脂飼料口感和味道不好，使小鼠進(jìn)食量減少所致，從第1周后，模型組和陽性對照組小鼠的進(jìn)食量明顯比正常組減少(P<0.01)，前3周模型組和陽性對照組小鼠的進(jìn)食量在逐漸降低，從第4周開始又逐漸增多，但整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間喂飼高脂飼料的小鼠的進(jìn)食量均比正常組少，見圖2。

圖1高脂飼料1對昆明種小鼠體質(zhì)量的影響

圖2高脂飼料1對昆明種小鼠進(jìn)食量的影響

注：與正常組比較*P<0.01。

Note：*P<0.01 vs normal group.

高脂飼料1對昆明種小鼠血脂和血糖的影響見表1。由表1可知，長期喂飼高脂飼料1能使模型組中的昆明種小鼠的血漿總膽固醇值顯著升高(1 892±83 mg·L-1vs 691±32 mg·L-1，P<0.01)，成功建立了小鼠高膽固醇血癥模型。但這種高脂飼料不但沒能升高模型組中昆明種小鼠的血漿三酰甘油水平，反而大大降低了其水平，降低幅度達(dá)到54.6% (1 125±116 mg·L-1vs 2 061±138 mg·L-1，P<0.01)，這表明該高脂飲食能夠抑制小鼠體內(nèi)三酰甘油的合成，給予非諾貝特的陽性對照組小鼠血漿中三酰甘油值更低，這說明除了該高脂飲食抑制了小鼠血漿三酰甘油的合成外，非諾貝特還進(jìn)一步降低了血漿三酰甘油水平。

同時(shí)，高脂飲食對血糖的影響不大(822±51 mg·L-1vs 982±63 mg·L-1)，但給予非諾貝特的陽性對照組小鼠血糖值與模型組比較有輕度升高，這是該藥的不良反應(yīng)引起的。

高脂飼料1對昆明種小鼠肝臟脂肪的影響：與正常組比較，模型組小鼠肝臟總膽固醇和三酰甘油的水平均升高(總膽固醇:667±75 mg·L-1vs 141±7 mg·L-1，三酰甘油:1 524±139 mg·L-1vs 533±51 mg·L-1，P<0.01)，而給予非諾貝特的陽性對照組小鼠肝臟總膽固醇和三酰甘油水平與模型組比較顯著降低(總膽固醇:332±36 mg·L-1vs 667±75 mg·L-1，三酰甘油：969±58 mg·L-1vs 1 524±139 mg·L-1，P<0.01)，但仍沒有恢復(fù)到正常組小鼠的水平。這說明此種高脂飼料能夠引起肝臟脂肪升高，同時(shí)非諾貝特發(fā)揮了降脂作用，改善了脂肪肝的程度。

表1高脂飼料1對昆明種小鼠血脂和血糖的影響

項(xiàng)目正常組/mg·L-1模型組/mg·L-1陽性對照組/mg·L-1血漿三酰甘油2 061±1381 125±116?661±55?#血漿總膽固醇691±321 892±83?965±56?#血漿葡萄糖982±63822±511 147±32#

注：與正常組比較*P<0.01；與模型組比較#P<0.01。

高脂飼料1對昆明種小鼠內(nèi)臟脂肪和肝質(zhì)量的影響見表2。由表2可知，該高脂飼料未顯著增加昆明種小鼠的內(nèi)臟脂肪含量，也未增加肝質(zhì)量。但值得指出的是，非諾貝特明顯增加了小鼠的肝質(zhì)量，這是該藥的一個(gè)明確的不良反應(yīng)。

表2高脂飼料1對昆明種小鼠內(nèi)臟脂肪和肝質(zhì)量的影響

組別體質(zhì)量/g脂肪質(zhì)量/g附睪副腎腸系膜內(nèi)臟脂肪總質(zhì)量/g肝質(zhì)量/g肝臟指數(shù)/%正常組35.0±0.50.54±0.040.21±0.020.71±0.031.46±0.071.92±0.065.50±0.13模型組31.0±3.20.47±0.060.23±0.030.59±0.071.28±0.051.79±0.205.41±0.57陽性對照組35.0±0.60.52±0.030.24±0.020.60±0.021.36±0.073.29±0.15?#9.37±0.32?#

注：與正常組比較*P<0.01;與模型組比較#P<0.01。

盡管該種配方的高脂飼料沒有明顯改變昆明種小鼠的體質(zhì)量和內(nèi)臟脂肪含量，卻明顯增加了肝臟的脂質(zhì)含量，模型組小鼠肝臟與正常組小鼠相比明顯呈現(xiàn)灰白色，這是脂肪肝的標(biāo)志。

3.2膽固醇和膽酸鈉對昆明種小鼠血脂和肝臟脂肪的影響 實(shí)驗(yàn)表明，高脂飼料1使昆明種小鼠的血漿三酰甘油值不升反降，考察配方中加入和不加入膽固醇和膽酸鈉對小鼠血漿和肝臟脂肪的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，膽固醇和膽酸鈉對小鼠肝臟總膽固醇和三酰甘油含量影響均較大，喂飼加入膽固醇和膽酸鈉的高脂飼料1的小鼠比喂飼不加入膽固醇和膽酸鈉的高脂飼料2的小鼠肝臟總膽固醇值高5.9倍 (1 073±394 mg·L-1vs 182±7 mg·L-1，P<0.01)，三酰甘油值高1.6倍 (2 834±253 mg·L-1vs 1 751±301 mg·L-1，P<0.01)；同時(shí)，膽固醇和膽酸鈉的有無對小鼠血漿總膽固醇值影響不大(1 495±74 mg·L-1vs 1 613±69 mg·L-1)，與血漿三酰甘油值呈負(fù)相關(guān)，即飼料中含有膽固醇和膽酸鈉能使小鼠血漿三酰甘油值顯著降低(610±32 mg·L-1vs 2 273±145 mg·L-1，P<0.01)。

3.3小鼠種系對高脂血癥成模的影響 考察另一種C57BL/6小鼠，結(jié)果表明，C57BL/6小鼠的情況與昆明種小鼠類似，高脂飼料1能使C57BL/6小鼠血漿總膽固醇值顯著升高(987±48 mg·L-1vs 495±18 mg·L-1，P<0.01)，卻同樣使血漿三酰甘油值不升反降(697±50 mg·L-1vs 1 141±97 mg·L-1，P<0.01)。說明這2個(gè)種系的小鼠均無法使用該種高脂飼料成功升高血漿三酰甘油水平。

3.4高脂飲食誘導(dǎo)C57BL/6小鼠高脂模型的恢復(fù)(7 d) C57BL/6小鼠用高脂飼料1連續(xù)喂飼4周后，恢復(fù)正常飲食1周，結(jié)果血漿總膽固醇值下降較快，恢復(fù)接近正常小鼠水平(644±24 mg·L-1vs 543±10 mg·L-1，P<0.01)。同時(shí)，血漿三酰甘油值也不再受到抑制，恢復(fù)到正常小鼠水平(1 103±127 mg·L-1vs 1 043±21 mg·L-1)。說明通過高脂飲食喂飼建立高脂血癥模型后，高血脂狀態(tài)可以恢復(fù)。

3.5以高糖和高脂為主的飼料對C57BL/6小鼠高脂血癥的影響 見表3。由表3可知，以高糖為主的飼料同樣能使血漿總膽固醇升高，并降低血漿三酰甘油的水平，增加飼料中豬油的含量至45%也得到了類似的結(jié)果。另外，此2種配方的飼料對小鼠血糖無明顯影響，說明不同配方的高脂飼料(增加脂肪的含量或以高糖為主)對高脂血癥成模的影響不大。

表3高脂飼料3和4對C57BL/6小鼠總膽固醇和三酰甘油的影響

項(xiàng)目正常組高脂飼料3高脂飼料4血漿總膽固醇438±5694±37??893±65??血漿三酰甘油1 089±49550±37??948±61?血漿葡萄糖897±53915±51902±36

注：與正常組比較*P<0.05，**P<0.01。

4 討論

小鼠是一種重要的高脂血癥動物模型，盡管小鼠內(nèi)源性膽固醇的合成量和血漿清除率高于人類很多倍，且小鼠血漿中不含CETP，與人類差異較大[7]，但小鼠模型給藥量小，這對于含量較低、制備困難的天然產(chǎn)物的降脂活性研究來說具有獨(dú)特的優(yōu)勢。而橄欖油灌胃或75%蛋黃乳劑腹腔注射造成的急性高脂血癥動物模型，與人類長期食用高脂高熱量飲食所形成的高脂血癥有較大差異；高脂飼料長期喂飼產(chǎn)生的高脂血癥持續(xù)時(shí)間相對較長，與人類的高脂血癥形成過程類似，是一種較好的造模方法。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用高脂飼料1喂飼8周后血漿總膽固醇水平顯著增加，還增加了肝臟中總膽固醇和三酰甘油的含量，降低了血漿三酰甘油的水平。由于高脂飼料含有較多豬油，飼料性質(zhì)發(fā)生改變，口味較重，小鼠進(jìn)食量減少，這可能是造成其體質(zhì)量與正常組比較沒有明顯增加的原因。小鼠內(nèi)源性膽固醇的合成量和血漿清除率遠(yuǎn)高于人類，從而減少肝臟合成膽固醇，增加膽汁酸的生成和排泄，抑制血脂的升高[8]。另外，小鼠機(jī)體缺乏膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，血清中70%的總膽固醇都以HDL-C的形式存在，也不易形成動脈硬化[9]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，高脂飼料1能夠建立昆明種小鼠的高膽固醇血癥和脂肪肝，卻不能建立高三酰甘油血癥模型，這可能由于外源性膽固醇的大量攝入抑制了小鼠內(nèi)源性三酰甘油合成，或同時(shí)抑制了三酰甘油從肝臟向血液的釋放。同時(shí)小鼠體內(nèi)存在一種抑制血漿三酰甘油升高的機(jī)制，因?yàn)楹^高比例豬油而不含膽固醇和膽酸鈉的高脂飼料也未能造成小鼠血漿三酰甘油的升高。這一結(jié)果與灌胃高脂乳劑不能建立小鼠高三酰甘油血癥類似[10]。

影響高脂血癥成模的因素有動物種系、性別、年齡、高脂飼料配方和喂飼方式等。一般來說，雄性比雌性更易成模，穩(wěn)定[11]，因此本研究中均采用雄性小鼠。本實(shí)驗(yàn)中采用昆明種小鼠和C57BL/6小鼠2種，結(jié)果表明二者之間并無顯著性差異。高脂飼料主要由基礎(chǔ)飼料、膽固醇和豬油等按照一定比例配制而成，有時(shí)可用蛋黃粉代替膽固醇。其中，豬油和膽固醇是必不可少的[12]，二者在飼料中含量的變化將會影響造模效果。一般是豬油和膽固醇含量越高，造模效果越好。為增強(qiáng)造模效果，還可加入能促進(jìn)膽固醇吸收的膽酸鹽或抑制甲狀腺功能的甲基/丙基硫氧嘧啶等物質(zhì)。但抗甲狀腺素分泌類藥物易造成模型動物肝臟及淋巴結(jié)損傷，增加模型動物死亡率，不符合正常血脂代謝過程，建議少用或不用[8]。張智等[13]對比了含膽鹽和不含膽鹽的2種高脂飼料對大鼠造模效果的影響，發(fā)現(xiàn)含膽鹽的高脂飼料明顯優(yōu)于不含膽鹽的高脂飼料，因?yàn)槟扄}能促進(jìn)膽固醇與脂肪的吸收，使動物迅速形成高脂血癥。研究結(jié)果表明，高脂飼料中膽固醇和膽酸鈉的有無對肝臟中膽固醇和三酰甘油的含量有重要影響，且呈正相關(guān)，但對血漿膽固醇水平的影響不大，同時(shí)與血漿三酰甘油的水平呈負(fù)相關(guān)，即膽固醇和膽酸鈉的存在會極大地降低血漿三酰甘油的水平。因此，要造成單純的小鼠高膽固醇血癥，高脂飼料中添加膽固醇和膽酸鈉并不是必須的，與前人在大鼠上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果明顯不同[13]。

長期灌胃高脂乳劑能形成高脂血癥，盡管該方法在保證個(gè)體間高脂乳劑攝入量的統(tǒng)一方面彌補(bǔ)了飼喂法造成的模型動物之間指標(biāo)的均一性較差的不足，但此方法使動物處于長期應(yīng)激狀態(tài)，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性[2]。因此采用高脂飼料喂飼法讓動物自由攝食更接近人類患高脂血癥的過程，取得的結(jié)果也更準(zhǔn)確。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，利用近交系的C57BL/6小鼠個(gè)體間差異很小，且造成小鼠高膽固醇血癥后恢復(fù)正常飲食1周，高膽固醇血癥雖有降低，但與正常組比較依然偏高。同時(shí)，低三酰甘油血癥有所恢復(fù)，說明實(shí)驗(yàn)中所采用的高脂飲食對小鼠血漿中三酰甘油有抑制作用。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，使用高糖為主的飼料喂飼C57BL/6小鼠4周并不能造成小鼠內(nèi)源性高三酰甘油血癥，與高脂飼料1相同，極大地抑制了血漿中三酰甘油的水平(550±37 mg·L-1vs 1 089±49 mg·L-1，P<0.01)；同時(shí)，該配方高脂飼料升高血漿膽固醇的幅度也不大(約1.6倍)，因此以高糖為主的高脂飼料并不適合造成小鼠高脂血癥模型。這與加糖的脂肪乳長期灌胃也不能形成高三酰甘油血癥的結(jié)果一致[14]。

研究表明，采用含有一定比例豬油的高脂飼料長期喂飼能夠成功建立小鼠高膽固醇血癥模型，但不能建立高三酰甘油血癥模型，如想同時(shí)建立小鼠高膽固醇血癥和脂肪肝模型，高脂飼料中添加膽固醇和膽酸鈉是必須的。因此，要篩選主要降低膽固醇的天然產(chǎn)物可選擇小鼠高膽固醇血癥模型。

研究表明，用以豬油或高糖為主要配方的高脂飲食無法成功誘導(dǎo)昆明種小鼠或C57BL/6小鼠成為高三酰甘油血癥模型。