張麗媛 王立恒 王麗莉 董佩佩 劉和真 趙艷艷*

1(大連醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，大連116044) 2(大連醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，大連 116044)3(大連市第二人民醫(yī)院骨科康復(fù)中心，大連 116001)

1 引 言

蛋白質(zhì)的糖基化是最重要的翻譯后修飾之一，其在細(xì)胞表面識別、免疫應(yīng)答、蛋白質(zhì)折疊、轉(zhuǎn)運、神經(jīng)傳導(dǎo)等生物轉(zhuǎn)化過程中都起著重要的作用[1]。因此，糖蛋白質(zhì)組學(xué)研究在生物學(xué)和臨床應(yīng)用中都具有重要的地位[2,3]。然而，糖蛋白在生物樣品中豐度較低，在質(zhì)譜檢測時易被其它非糖蛋白抑制，因此需發(fā)展高效的糖肽/糖蛋白的分離富集方法，以提高糖肽/糖蛋白的鑒定效率[4，5]。

目前，糖肽/糖蛋白的分離富集方法主要有凝集素親和法[6]、肼化學(xué)法[7]、親水相互作用法[8]、硼親和色譜法[9]和體積排阻法[10]等，這些方法各有優(yōu)缺點。其中硼親和色譜法富集糖肽/糖蛋白，是通過調(diào)節(jié)溶液的pH值使得硼酸親和材料上的硼酸基團與糖分子的1,2-順式二羥基產(chǎn)生可逆結(jié)合，堿性條件下結(jié)合，酸性條件下解離，上樣富集條件的pH值對糖肽/糖蛋白的保留起到重要作用[11]。硼親和色譜法具有顯著的優(yōu)勢，如操作簡單、富集無偏向性和重現(xiàn)性好等。新型硼酸親和材料的開發(fā)作為硼親和色譜法的核心領(lǐng)域，引起研究者極大關(guān)注?，F(xiàn)有的方法多在提高糖蛋白/糖肽富集選擇性的同時，兼顧生物相容性，合成操作簡便。

點擊化學(xué)反應(yīng)具有選擇性高、轉(zhuǎn)化率高、條件溫和等特點，在諸多領(lǐng)域得到了廣泛的發(fā)展與應(yīng)用[12～14]。目前應(yīng)用最多的點擊化學(xué)反應(yīng)是疊氮-炔基加成反應(yīng)(CuAAC)[15]。然而，CuAAC反應(yīng)使用Cu作為催化劑，殘留的重金屬Cu會帶來生物毒性，限制了其的應(yīng)用。無銅催化的“點擊化學(xué)”巰基-烯基加成反應(yīng)[16,17]不僅操作簡單、反應(yīng)高效，而且避免了CuAAC反應(yīng)由重金屬Cu帶來生物毒性的問題，生物相容性好，適用于硼酸親和材料的制備。Zhang等[18]采用巰基-烯基點擊化學(xué)法合成了一種硼酸親和作用的磁性納米顆粒材料; 楊帆等[19]采用同樣的合成方法合成了一種有機-無機雜化硼酸親和整體柱，并用于糖蛋白的選擇性富集，分離選擇性較好。 相比較巰基-烯基的點擊化學(xué)反應(yīng)，基于巰基-炔基的反應(yīng)的功能基團鍵合量更高。然而，目前沒有采用基于巰基-炔基點擊化學(xué)法合成硼酸親和材料的報道。硼酸親和材料的基質(zhì)有聚合物整體柱[19,20]、納米顆粒[21,22]、磁珠[18]、金屬氧化物[23]等。相比其它類型基質(zhì)，硅膠是高效液相色譜載體最常用的基質(zhì)類型，具有更為實用的應(yīng)用價值，在大規(guī)模糖蛋白質(zhì)組學(xué)中的應(yīng)用研究前景較好。因此，開發(fā)生物相容性好、鍵合量高、制備方法簡便的硅膠基質(zhì)硼酸親和材料十分必要。

本研究基于巰基-炔基無銅催化的“點擊”化學(xué)反應(yīng)，將4-巰基苯硼酸鍵合到炔基修飾的硅膠表面。制備了一種以硅膠為基質(zhì)的新型硼酸功能化材料(Thiol-yne boronic acid functionalized material, TYBA)，利用紅外光譜對材料進行表征，確定鍵合反應(yīng)成功。在優(yōu)化條件的基礎(chǔ)上，以HRP、IgG、RNaseB和BSA為研究對象，分別考察材料對糖肽和糖蛋白的富集選擇性, 并將TYBA材料應(yīng)用于實際人血清樣品中糖蛋白的選擇性富集。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Ultraflex III MALDI-TOF/TOF MS 質(zhì)譜儀(德國Bruker 公司); SDS 凝膠電泳槽(北京市六一儀器廠)。

炔基硅膠(實驗室自制); 2,2′-偶氮二異丁腈、4-巰基苯硼酸、NH4HCO3、甲酸(分析純，北京百靈威公司); 冰醋酸、甲醇、乙醇(化學(xué)純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司); 乙腈(質(zhì)譜級，德國Darmstadt公司); 辣根過氧化物酶(HRP)、核糖核酸酶B(RNaseB)、牛血清白蛋白(BSA)、免疫球蛋白G(IgG)、二硫蘇糖醇(DTT)、碘乙酰胺(IAA)，2,5-二羥基苯甲酸(2,5-DHB)、尿素(美國Sigma公司); 胰蛋白酶(Madison, WI, 美國); 正常人血清(北京索萊寶科技有限公司); 考馬斯亮藍(lán)(Coomassie brilliant blue R-250，北京索萊寶科技有限公司)。

2.2 巰基-炔基硼酸功能化材料(TYBA)的制備

巰基-炔基硼酸功能化材料的合成反應(yīng)如圖1所示，操作過程如下：稱取16 mg偶氮二異丁腈(AIBN)加入到含有4-巰基苯硼酸(0.38 g)的甲醇(5 mL)溶液中，然后通過干燥的漏斗向攪拌的反應(yīng)物中加入0.5 g炔基硅膠(實驗室自制，制備方法參照文獻(xiàn)[24])，在氮氣保護下，65℃持續(xù)攪拌反應(yīng)24 h。 反應(yīng)體系冷卻至室溫后，將得到的材料用砂芯漏斗過濾，分別用甲醇和去離子水各洗滌3次，在50℃干燥過夜，即得巰基-炔基硼酸功能化材料(TYBA材料)。

圖1 巰基-炔基硼酸功能化材料合成線路圖Fig.1 Synthesis route of thiol-yne boronic acid functionalized material (TYBA)

2.3 糖肽富集

2.3.1蛋白質(zhì)酶解稱取0.5 mg HRP，溶于100 μL 含有8 mol/L尿素的50 mmol/L NH4HCO3緩沖溶液中, 56℃反應(yīng)10 min。加入20 mL 100 mmol/L DTT溶液, 56℃反應(yīng)1 h。冷卻至室溫后，將5 μL 50 mmol/L IAA溶液加入到混合物中，并常溫避光孵化30 min。將5 mmol/L NH4HCO3溶液與胰蛋白酶以質(zhì)量比40∶1混合，并在37℃中孵化16 h。所得溶液冷卻至室溫后，于-80℃保存?zhèn)溆谩Ｌ请母患玫腎gG、RNaseB和BSA的酶解物均用此方法酶解。

2.3.2標(biāo)準(zhǔn)糖蛋白酶解物的富集稱取2 mg TYBA材料，加入200 μL 80% ACN溶液，使其成為均勻的混懸液(10 mg/mL)。取50 μL 混懸液與酶解物混合，加入200 μL 80% ACN-氨水溶液(pH 11)，室溫下渦旋孵化1 h，10000 r/min離心5 min后，棄上清液; 重復(fù)加液洗滌1次。再加入200 μL 50% ACN-1% FA溶液洗脫，10000 r/min離心5 min后，上清液冷凍干燥。 加2 μL基質(zhì)溶液(25 mg/mL DHB, 70% ACN-1% FA)溶解后，進行MALDI-TOF MS 分析，設(shè)置線性正離子模式及延遲離子提取方法，延遲時間為90 ns，提取電壓為20 kV，每個質(zhì)譜圖由30個激光點的結(jié)果加和得到。HRP、RNaseB、IgG的酶解物均用此方法富集。

2.3.3糖蛋白與非糖蛋白酶解液混合物的富集研究對象為HRP-BSA(1∶10，n/n)的酶解液混合物。取50 μL TYBA材料混懸液與酶解液混合物混合，加入200 μL 80% ACN-氨水溶液(pH=11)，室溫下渦旋孵育1 h，10000 r/min離心5 min后，棄上清液; 重復(fù)加液洗滌1次。加入200 μL 50% ACN-1% FA溶液洗脫，10000 r/min離心5 min后，取上清液冷凍干燥。 加2 μL 基質(zhì)溶液溶解，進行基質(zhì)輔助激光解吸-飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS) 分析。所有比例除特別注明外，均為體積比。

2.4 糖蛋白富集

2.4.1糖蛋白與非糖蛋白混合物的富集取3個分別裝有50 μL TYBA材料混懸液的EP管，依次加入HRP-BSA(1∶1、1∶10、1∶20，n/n)的蛋白混合溶液進行分析。分別加入200 μL 80% ACN-氨水(pH=11)，室溫下渦旋孵育1 h，10000 r/min離心5 min后，棄上清液。再加入200 μL 50% ACN-1% FA 溶液洗脫，10000 r/min離心5 min，將所得的洗脫液冷凍干燥，然后進行SDS-PAGE蛋白凝膠電泳。 IgG、RNase B與BSA混合物中的糖蛋白均用此方法富集。

2.4.2多種糖蛋白與非糖蛋白混合物的富集取50 μL TYBA材料混懸液，等摩爾依次加入HRP、IgG、RNaseB和BSA的蛋白溶液混合，再加入200 μL 80% ACN-氨水溶液(pH=11)，室溫下渦旋孵化1 h，10000 r/min離心5 min后，棄去上清液，重復(fù)加液洗滌1次。加入200 μL的50% ACN-1% FA 溶液洗脫，10000 r/min離心5 min，將所得洗脫液冷凍干燥，然后進行SDS-PAGE凝膠電泳。

2.4.3血清樣品中糖蛋白的富集取50 μL TYBA材料混懸液與5 μL的正常人血清混合，加入200 μL 80% ACN-氨水溶液(pH=11)，室溫下渦旋孵化1 h，10000 r/min離心5 min后，棄上清液，重復(fù)洗滌1次。再加入200 μL 50% ACN/-1% FA溶液洗脫，室溫下渦旋孵化1 h，10000 r/min離心5 min，將所得洗脫液冷凍干燥，然后進行SDS-PAGE蛋白凝膠電泳。

3 結(jié)果與討論

3.1 TYBA材料的表征

基于巰基-炔基的“點擊”化學(xué)法反應(yīng)過程如圖1所示，4-巰基苯硼酸在氮氣保護條件下，以偶氮二異丁腈作為催化劑，鍵合到炔基硅膠表面。

圖2 炔基硅膠(a)和TYBA材料(b)的紅外圖譜Fig.2 Fourier transform-infrared (FT-IR) spectra of (a) alkynyl silicone and (b) TYBA

3.2 TYBA材料用于糖肽富集

3.2.1標(biāo)準(zhǔn)糖蛋白酶解物的富集選取兩種標(biāo)準(zhǔn)糖蛋白HRP和IgG的胰蛋白酶酶解物作為研究對象，考察所合成的TYBA材料的糖肽富集選擇性。首先對TYBA材料的糖肽富集條件進行了優(yōu)化，硼酸基團可在堿性條件下與糖肽上的糖基結(jié)合，在酸性條件下解離。此外，硼酸上的羥基能夠提供氫鍵作用力，因此條件優(yōu)化過程中同時考慮硼酸親和作用力和氫鍵作用力的特點。優(yōu)化后的上樣和孵育條件為高有機相堿性條件，洗脫條件為低有機相酸性條件。

采用MALDI-TOF-MS檢測糖肽。以標(biāo)準(zhǔn)糖蛋白HRP和IgG的酶解液為分析對象，考察材料的糖肽富集選擇性，結(jié)果如圖3所示，富集前，HRP酶解液中只檢測到5個糖肽信號(m/z3146、3354、3672、3896、4986，圖3A); 經(jīng)TYBA材料富集后，不僅檢測到了11個糖肽信號(m/z1843、2001、2531、3146、3208、3322、3354、3672、3896、4057、4986，糖肽信息見表1)，糖肽信號強度得到較大程度增強，而且去除了大部分非糖肽雜質(zhì)的干擾(圖3B)。富集前，在IgG酶解液中只檢測到3個微弱的糖肽信號(m/z2286、2602、2764，圖3C)，而經(jīng)TYBA材料富集后，檢測到了8個糖肽信號(m/z2286、2602、2635、2764、2797、2927、2967、3000，圖3D，糖肽信息見表2)，糖肽信號強度得到較大程度增強，并且去除了大部分非糖肽雜質(zhì)的干擾。TYBA材料從HRP酶解液中富集的糖肽數(shù)量與文獻(xiàn)報道的其它材料富集結(jié)果有一定差距[20]，這是因為TYBA材料采用的是苯硼酸功能基團，其對于糖肽富集選擇性弱于文獻(xiàn)中所采用的苯并硼氧醇功能基團[25]。盡管如此，所制備的TYBA材料具有較好的糖肽富集選擇性，對于HRP和IgG的蛋白酶解液的具有明確的富集效果。整個制備過程未采用重金屬，生物相容性好，操作簡便，這是TYBA材料作為糖肽選擇性富集材料的優(yōu)勢。

圖3 MALDI-TOF MS 分析胰酶水解糖蛋白圖譜：(A)HRP富集前; (B)HRP富集后; (C)IgG富集前; (D)IgG富集后(圖中標(biāo)注m/z數(shù)值均為本研究鑒定出的糖肽信號，未標(biāo)注m/z數(shù)值的信號均為非糖肽信號)Fig.3 Matrix assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) analysis of tryptic digestion of glycoproteins: (A) direct analysis of horseradish peroxidase (HRP); (B) HRP after enrichment; (C) direct analysis of immunoglobulin (IgG); (D) IgG after enrichment. Glycopeptide signals are all marked with m/z, non-glycopeptide signals are not marked with m/z

3.2.2糖蛋白與非糖蛋白酶解物混合物的富集為了進一步驗證TYBA材料在非糖肽干擾情況下對糖肽的富集選擇性，本研究對HRP-BSA(1∶10，n/n)酶解液混合物進行富集。質(zhì)譜檢測結(jié)果如圖4所示，富集前從HRP-BSA(1∶10，n/n)酶解液混合物中只檢測到2個糖肽信號(m/z3354、3672, 圖4A)，存在高信號強度的非糖肽雜質(zhì)峰的干擾; 而酶解液混合物經(jīng)材料富集后，不僅去除了大部分非糖肽雜質(zhì)的干擾，還得到了8個高強度的糖肽信號(m/z1843、2531、2851、3146、3354、3672、3896、4986, 圖4B)。結(jié)果表明，TYBA材料在大量非糖肽干擾情況下仍具有較好的糖肽富集選擇性與富集效果。

3.3 TYBA材料用于糖蛋白的富集

3.3.1糖蛋白富集選擇性考察選擇HRP、IgG、RNaseB作為標(biāo)準(zhǔn)糖蛋白的研究對象，考察TYBA材料對糖蛋白的富集選擇性。3種標(biāo)準(zhǔn)糖蛋白結(jié)構(gòu)各有特點，糖型、糖鏈長度和親水性大小均有差異。其中HRP中性糖和氨基糖約占18%，主要有甘露糖、木糖和阿拉伯糖等; IgG是血清中免疫球蛋白的主要成分，主要含有中性糖; RNaseB是一種帶有甘露糖糖鏈的糖蛋白。

表1 經(jīng)TYBA材料富集后鑒定到的HRP酶解物中糖肽信息(糖肽結(jié)構(gòu)信息來源于文獻(xiàn)報道[26])

Table 1 Information of glycosylated peptides in HRP after TYBA enrichment (Structure information is from literature[26])

糖肽Glycopeptide糖鏈結(jié)構(gòu)Glycochain structure氨基酸序列Amino acid sequence富集前Beforeenrichment富集后Afterenrichmentm/z 1843Man3GlcNAc2Fuc1Xyl1NVGLNR√m/z 2001Man4GlcNAc2Fuc1Xyl1NVGLNR√m/z 2531FucGlcNAcSFANSTQTFFNAFVEAMDR√m/z 3146[Hex]3[HexNAc]2[Fuc]1[Xyl]1GLCPLNGNLSALVDFDLR.Oxide√√m/z 3208[Hex]3[HexNAc]2[Xyl]1SFANSTQTFFNAFVEAMDR√m/z 3322[Hex]3[HexNAc]2[Fuc]1[Xyl]1QLTPTFYDNSCPNVSNIVR√m/z 3354[Hex]3[HexNAc]2[Fuc]1[Xyl]1SFANSTQTFFNAFVEAMDR√√m/z 3672[Hex]3[HexNAc]2[Fuc]1[Xyl]1GLIQSDQELFSSPNATDTIPLVR√√m/z 3896[Hex]3[HexNAc]2[Fuc]1[Xyl]1LHFHDCFVNGCI)ASILLDNTTSFR√√m/z 4057[Hex]3[HexNAc]2[Xyl]1QLTPTFYDNSC(AAVESACPR)PNVSNIVR-H2O√m/z 4986[Hex]3[HexNAc]2[Fuc]1[Xyl]1LYN#FSNTGLPDPTLNTTYLQTLR√√

表2 經(jīng)TYBA材料富集后IgG酶解物中糖肽信息(糖肽結(jié)構(gòu)信息來源于文獻(xiàn)報道[26])

Table 2 Information of glycosylated peptides in IgG after TYBA enrichment (Structure information is from literature[26])

糖肽Glycopeptide糖鏈結(jié)構(gòu)Glycochain structure氨基酸序列Amino acid sequence富集前Beforeenrichment富集后Afterenrichmentm/z 2286[Hex]3[HexNAc]3EEQYNSTYR√√m/z 2602[Hex]3[HexNAc]4[Fuc]1EEQFNSTFR√√m/z 2635[Hex]3[HexNAc]4[Fuc]1EEQYNSTYR√m/z 2764[Hex]4[HexNAc]4[Fuc]1EEQFNSTFR√√m/z 2797[Hex]4[HexNAc]4[Fuc]1EEQYNSTYR√m/z 2927[Hex]5[HexNAc]4[Fuc]1EEQFNSTFR√m/z 2967[Hex]4[Hex7NAc]5[Fuc]1EEQFNSTFR√m/z 3000[Hex]4[HexNAc]5[Fuc]1EEQYNSTYR√

圖4 HRP-BSA(1∶10，n/n)富集前(A)和富集后(B)的MALDI-TOF MS 分析圖譜(圖中標(biāo)注m/z數(shù)值均為本研究鑒定出的糖肽信號，未標(biāo)注m/z數(shù)值的信號均為非糖肽信號)Fig.4 MALDI-TOF MS spectra of tryptic digest of HRP-bovine serum albumin (BSA)(1∶10，n/n). (A) Direct analysis; (B) after enrichment. Glycopeptide signals are all marked with m/z, non-glycopeptide signals are not marked with m/z

3種糖蛋白分別與BSA按照1∶1、1∶10、1∶20的摩爾比混合上樣，將洗脫液冷凍干燥，進行SDS-PAGE凝膠電泳分離，結(jié)果如圖5所示。圖5A為HRP的蛋白混合物富集結(jié)果，其中2、4、6分別為富集前HRP與BSA以1∶ 1、1∶ 10、1∶ 20的摩爾比混合物的條帶，3、5、7為富集后混合物的條帶。與富集前相比，TYBA材料富集不僅去除了大量非糖蛋白BSA，而且完全保留了糖蛋白HRP。圖5B為IgG的蛋白混合物富集結(jié)果，其中2、4、6分別為富集前IgG與BSA以1∶1、1∶10、1∶20的摩爾比混合物條帶，3、5、7為富集后混合物的條帶，經(jīng)過富集，不僅去除了非糖蛋白BSA，而且完全保留了糖蛋白IgG。圖5C為RNase B的蛋白混合物富集結(jié)果，其中2、4、6分別為RNase B與BSA以1∶1、1∶10、1∶20的摩爾比混合物富集前的條帶，3、5、7為混合物富集后的條帶，經(jīng)過富集，不僅去除了非糖蛋白BSA，而且完全保留了糖蛋白RNase B。以上結(jié)果表明，TYBA材料對糖蛋白具有較好的選擇性和富集效果。

圖5 HRP、IgG、RNase B分別與BSA以不同比例混合分離富集的SDS-PAGE凝膠電泳圖：(A)1. Marker; 2. HRP∶BSA=1∶1富集前; 3. HRP∶BSA=1∶1富集后; 4. HRP∶BSA=1∶10富集前; 5. HRP∶BSA=1∶10富集后; 6. HRP∶BSA=1∶20富集前; 7. HRP∶BSA=1∶20富集后。(B)1.Marker; 2. IgG∶BSA=1∶1富集前; 3. IgG∶BSA=1∶1富集后; 4. IgG∶BSA=1∶10富集前; 5. IgG∶BSA=1∶10富集后; 6. IgG∶BSA=1∶20富集前; 7. IgG∶BSA=1∶20富集后。(C)1. Marker; 2. RNaseB∶BSA=1∶1富集前; 3. RNase B∶BSA=1∶1富集后; 4.RNase B∶BSA=1∶10富集前; 5. RNase B∶BSA=1∶10富集后; 6. RNase B∶BSA=1∶20富集前; 7. RNaseB∶BSA=1∶20富集后Fig.5 Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) analysis of enrichment of glycoproteins. (A) 1. Marker; 2. HRP∶BSA=1∶1; 3. HRP∶BSA=1∶1 after enrichment; 4. HRP∶BSA=1∶10; 5 HRP∶BSA=1∶10.after enrichment; 6. HRP∶BSA=1∶20; 7. HRP∶BSA=1∶20 after enrichment. (B) 1. Marker; 2. IgG∶BSA=1∶1; 3. IgG∶BSA=1∶1 after enrichment; 4.IgG∶BSA=1∶10; 5. IgG∶BSA=1∶1 after enrichment 0; 6. IgG∶BSA=1∶20; 7. IgG∶BSA=1∶20 after enrichment. (C) 1. Marker; 2. RNaseB∶BSA=1∶1; 3. RNase B∶BSA=1∶1 after enrichment; 4. RNase B∶BSA=1∶10; 5. RNase B∶BSA=1∶10 after enrichment 6. RNase B∶BSA=1∶20; 7. RNaseB∶BSA=1∶20 after enrichment

3.3.2多種糖蛋白與非糖蛋白混合物的富集效果為了進一步驗證本材料同時富集多種糖蛋白的選擇性，將此材料應(yīng)用于多種糖蛋白與非糖蛋白混合物的富集。將HRP、IgG、RNaseB、BSA按照等摩爾比混合上樣，洗脫液冷凍干燥后進行SDS-PAGE凝膠電泳分離。如圖6所示，與富集前相比，TYBA材料富集去除了非糖蛋白BSA的干擾，3種糖蛋白均得到保留，進一步表明本材料用于富集糖蛋白具有較好的選擇性和富集效果。

3.3.3實際樣品中糖蛋白的富集效果人血清中主要含有轉(zhuǎn)鐵蛋白(Trf)、血清白蛋白(HSA)和免疫球蛋白G(IgG)等，其中Trf、IgG為糖蛋白，HSA為非糖蛋白。將TYBA材料用于正常人血清中糖蛋白的富集，富集前后的SDS-PAGE凝膠電泳結(jié)果如圖7所示，血清樣品在富集前所含蛋白大部分為HSA，含量明顯高于Trf和IgG; 經(jīng)TYBA富集后, 不僅去除了血清中的一些雜質(zhì)蛋白的條帶，非糖蛋白HSA得到較明顯的去除，而且糖蛋白Trf和IgG得到了很大程度上的保留。與文獻(xiàn)[25]相比，本方法顯著提高了糖蛋白HSA的去除效果，表明此材料用于人血清中糖蛋白富集，具有高效性和選擇性。

4 結(jié) 論

設(shè)計并制備了一種基于巰基-炔基點擊化學(xué)反應(yīng)的新型苯硼酸功能化TYBA材料，并將其應(yīng)用于標(biāo)準(zhǔn)和實際樣品中糖蛋白和糖肽的選擇性富集。結(jié)果表明，對標(biāo)準(zhǔn)糖蛋白及其酶解產(chǎn)物中的糖肽，以及人血清樣品中的糖蛋白，TYBA材料均展現(xiàn)出優(yōu)良的富集特異性，具有良好的實際應(yīng)用前景。

圖6 HRP、IgG、RNase B與BSA混合分離富集的SDS-PAGE凝膠電泳圖Fig.6 SDS-PAGE analysis of the material applied on the enrichment of glycoproteinsLane 1, Marker; Lane 2, HRP∶IgG∶RNase B∶BSA=1∶1∶1∶1; Lane 3, HRP∶IgG∶RNaseB∶BSA=1∶1∶1∶1 after enrichment

圖7 人血清中糖蛋白分離富集的SDS-PAGE凝膠電泳圖譜1. Marker; 2. 人血清; 3. 人血清富集后Fig.7 SDS-PAGE analysis of the material appled in the enrichment of human serum1.Marker; 2.human serum; 3. human serum after enrichment