熊強(qiáng)強(qiáng)，魏雪嬌，施 翔，方加海，陳小榮，賀浩華

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/作物生理生態(tài)與遺傳育種教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/江西省超級(jí)稻工程技術(shù)研究中心/雙季稻現(xiàn)代化生產(chǎn)協(xié)同中心，江西南昌330045)

植物在生長(zhǎng)發(fā)育過程中會(huì)受到各種不利的生物和非生物因素的影響，已經(jīng)成為制約植物生長(zhǎng)發(fā)育、影響植物產(chǎn)量和質(zhì)量的關(guān)鍵因素，如病蟲侵害、水分脅迫、溫度(高、低溫)脅迫和鹽脅迫等。植物感受到這些逆境信號(hào)通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)相關(guān)抗逆基因、蛋白的表達(dá)[1-3]，調(diào)整自身的狀態(tài)來適應(yīng)不利環(huán)境，最終以代謝產(chǎn)物形式響應(yīng)環(huán)境變化和遺傳修飾，生物體的表型是代謝物水平最終的表現(xiàn)[4-5]。當(dāng)前，單純研究某一層次生物分子(基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白組或代謝組等)的變化，如通過Gene ontology(GO)分析基因、蛋白功能及相互作用網(wǎng)絡(luò)，或通過Metabo-Analyst分析小分子代謝產(chǎn)物的相互關(guān)系并找尋生物標(biāo)志物等，已經(jīng)很難滿足系統(tǒng)生物學(xué)越來越高的研究期望。因此，綜合多組學(xué)數(shù)據(jù)對(duì)生物過程從基因、轉(zhuǎn)錄、蛋白和代謝水平全面的深入的闡釋已成為研究的熱點(diǎn)，從而更好的對(duì)生物系統(tǒng)進(jìn)行全面了解[6-8]。

組學(xué)(omics)技術(shù)是隨著系統(tǒng)生物學(xué)的發(fā)展而迅速發(fā)展起來的，它的運(yùn)用為系統(tǒng)生物學(xué)提供了大量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和先進(jìn)的技術(shù)方法，并且對(duì)系統(tǒng)生物學(xué)的發(fā)展提供了較為新穎的研究思路，大大加速了系統(tǒng)生物學(xué)的發(fā)展腳步。系統(tǒng)生物學(xué)(systems biology)是研究一個(gè)生物系統(tǒng)中所有組成成分的構(gòu)成，以及在特定條件下這些組分間的相互關(guān)系的學(xué)科，整合分析生物系統(tǒng)在生物或非生物等相關(guān)因素的干擾下一定時(shí)間內(nèi)的動(dòng)力學(xué)過程及其規(guī)律[9-11]。多層組學(xué)是一個(gè)由左至右、由上而下的系統(tǒng)整合過程，即在深入研究基因、RNA、蛋白質(zhì)和代謝產(chǎn)物上的一種系統(tǒng)分析和分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的整合(圖1)，同時(shí)結(jié)合GO功能分析、代謝通路富集、分子互作等生物功能分析，系統(tǒng)全面地解析生物分子功能和調(diào)控機(jī)制。不同分子層次的組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行整合分析一方面可以相互驗(yàn)證，另一方面也有助于相互補(bǔ)充、拓展認(rèn)識(shí)。

圖1 多層組學(xué)分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)Fig.1 Multi-omics molecular regulatory network

近年來，以基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)為代表的組學(xué)分析方法正逐步在植物逆境脅迫及新品種培育上應(yīng)用，國(guó)內(nèi)外研究人員均取得了許多突破性的研究成果。本文較為詳細(xì)地介紹了基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和和代謝組學(xué)聯(lián)合分析在植物響應(yīng)逆境脅迫、基因功能研究及輔助育種中的最新應(yīng)用和研究成果，并總結(jié)和評(píng)述了多層組學(xué)整合分析的未來發(fā)展趨勢(shì)。

1 多層組學(xué)簡(jiǎn)介

多層組學(xué)主要包括基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)。通過對(duì)基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白組和代謝組數(shù)據(jù)進(jìn)行整合分析，可獲得相關(guān)變化信息，富集和追索到變化最大、最集中的通路，然后對(duì)基因到RNA、蛋白質(zhì)，再到代謝小分子，進(jìn)而對(duì)整體變化物質(zhì)分子進(jìn)行綜合分析，包括原始通路的分析及新通路的構(gòu)建，反映出組織器官功能和代謝狀態(tài)，從而對(duì)生物系統(tǒng)進(jìn)行全面的解讀。多層組學(xué)主要的分析內(nèi)容和方法主要包括差異基因功能分析、差異mRNA生物信息分析(GO,pathway)、差異蛋白生物信息分析(GO,pathway,PPI)和差異代謝物生物信息分析(pathway)。進(jìn)一步分析通常包括兩個(gè)方面的內(nèi)容，一是對(duì)共同關(guān)聯(lián)的pathway進(jìn)行整合分析。另一方面，是對(duì)將差異代謝物，代謝物直接相關(guān)的調(diào)控酶、基因和差異蛋白及相關(guān)代謝通路通過omicsbean或者cytoscape軟件，構(gòu)建基因、蛋白質(zhì)、代謝物、及相關(guān)代謝通路的互作網(wǎng)路圖。

基因組學(xué)(Genomics)是研究生物基因組和如何利用基因的一門學(xué)問。用于概括涉及基因作圖、測(cè)序和整個(gè)基因組功能分析的遺傳學(xué)分支?；蚪M(genome)是指細(xì)胞或生物體的一套完整的單倍體遺傳物質(zhì)，是所有不同染色體上全部基因和基因間的DNA的總和[12-13]。

轉(zhuǎn)錄組學(xué)(transcriptomics)是指某一特定生理?xiàng)l件下從RNA水平研究基因表達(dá)的情況，即生物樣本內(nèi)全部轉(zhuǎn)錄本的RNA序列的測(cè)序，是研究細(xì)胞表型和基因功能的一個(gè)重要手段[14-15]。

蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)是以蛋白質(zhì)組為研究對(duì)象，利用各種技術(shù)手段來研究蛋白質(zhì)組的一門新學(xué)科，研究細(xì)胞、組織或生物體蛋白質(zhì)組成及其變化規(guī)律的科學(xué)[16-17]。蛋白質(zhì)組(proteome)是由一個(gè)細(xì)胞、一個(gè)組織或一種生物的基因組所表達(dá)的全部相應(yīng)的蛋白質(zhì)[18]。

代謝組學(xué)(metabolomics)的概念來源于代謝組，代謝組是指某一生物或細(xì)胞在一特定生理時(shí)期內(nèi)所有的低分子量代謝產(chǎn)物，代謝組學(xué)則是對(duì)某一生物或細(xì)胞在一特定生理時(shí)期內(nèi)所有低分子量代謝產(chǎn)物同時(shí)進(jìn)行定性和定量分析的一門新學(xué)科[19-20]。

2 多層組學(xué)在植物響應(yīng)逆境脅迫中的應(yīng)用

隨著擬南芥[21]、水稻[22]、大麥[23]、小麥[24]全基因組序列的完成，加速了多層組學(xué)在植物上的研究，利用系統(tǒng)生物學(xué)方法深入研究其響應(yīng)環(huán)境變化、病蟲侵害及其生長(zhǎng)發(fā)育的機(jī)制，以適應(yīng)在逆境環(huán)境中的生存具有重大意義。本文就近年來多層組學(xué)在植物研究中的應(yīng)用進(jìn)行分類綜述(表1)。

2.1 響應(yīng)非生物脅迫

自然界普遍存在非生物脅迫因素，它們可以使植物產(chǎn)量和品質(zhì)下降。植物在感受到脅迫信號(hào)后從基因、mRNA、蛋白質(zhì)水平，最終到代謝物的差異積累來響應(yīng)脅迫，對(duì)來自不同層次的組學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，包括基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白組、代謝組以及各層次的修飾組學(xué)研究數(shù)據(jù)等，進(jìn)行整體變化物質(zhì)分子綜合分析，通過多層組學(xué)根據(jù)網(wǎng)絡(luò)協(xié)同調(diào)控邏輯對(duì)植物遭遇干旱[25-26]、鹽[27-28]、溫度[29-30]和重金屬[31]有助于闡明水稻響應(yīng)脅迫的分子機(jī)理。

Shu等[25]對(duì)干旱條件下水稻葉片轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組及代謝組進(jìn)行聯(lián)合分析，研究認(rèn)為干旱期間儲(chǔ)存物質(zhì)的能耗增加，從碳水化合物和脂肪酸到氨基酸方向的能量和物質(zhì)的轉(zhuǎn)移和利用增加。Chmielewska等[26]分析兩種基因型(敏感型、耐旱型)大麥葉片和根蛋白質(zhì)組和代謝組的數(shù)據(jù)，揭示了器官(根、葉片)的特異性變化，同時(shí)發(fā)現(xiàn)干旱敏感和耐受大麥品系響應(yīng)水分虧缺的差異性。在水稻響應(yīng)鹽脅迫研究中，Wang等[27]以水稻鹽敏感株系IR64和耐鹽PL177為材料，在外源脫落酸情況下，結(jié)合幼苗期芽和根轉(zhuǎn)錄組和代謝組數(shù)據(jù)分析，在兩種水稻基因型中，鹽脅迫條件下，許多初級(jí)代謝產(chǎn)物發(fā)生變化和器官特異性的發(fā)生，外源ABA通過選擇性的降低Na+在根部的積累，增加K+在芽的積累來提升水稻對(duì)鹽脅迫的耐性，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組和代謝組數(shù)據(jù)篩選出幾個(gè)耐鹽候選基因，為提高水稻的耐鹽性提供理論參考依據(jù)。Ye等[28]以狗牙根(Bermudagrass)為材料，研究干旱和鹽脅迫的生理，并結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)的比較分析。生理上分析，干旱和鹽脅迫下滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)積累，活性氧簇(ROS)水平和抗氧化酶活性發(fā)生了較大的變化；組學(xué)結(jié)果分析，鑒定了77個(gè)涉及光合作用，氧化戊糖磷酸，糖酵解和氧化還原代謝途徑的蛋白質(zhì)，其中，36個(gè)蛋白質(zhì)受到兩種處理的共同調(diào)控，而另外40個(gè)蛋白質(zhì)和13個(gè)蛋白質(zhì)分別被干旱和鹽調(diào)控。氨基酸，有機(jī)酸，糖和糖醇等37種代謝物的含量受干旱和鹽處理的調(diào)控，其中18個(gè)調(diào)控代謝物涉及碳和氨基酸代謝途徑，此研究為了解狗牙根對(duì)非生物脅迫響應(yīng)的潛在分子機(jī)制和代謝穩(wěn)態(tài)提供新的見解。Zhang等[29]以9311和日本晴為材料，結(jié)合代謝組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)處理期間代謝差異集中于抗氧化作用，而恢復(fù)期間抗寒相關(guān)代謝物的誘導(dǎo)在耐寒品種日本晴中更為活躍，衰老相關(guān)化合物僅在冷敏感品種9311中積累，揭示了水稻響應(yīng)低溫脅迫和恢復(fù)過程的代謝動(dòng)態(tài)模式及活性氧主導(dǎo)的水稻適應(yīng)低溫環(huán)境機(jī)制。Wienkoop等[30]對(duì)擬南芥在高溫脅迫下淀粉和棉子糖類物質(zhì)的代謝變化進(jìn)行的研究，闡述了高溫下擬南芥的代謝途徑以及相關(guān)酶類的活性變化。同時(shí)也表明代謝組學(xué)與其他組學(xué)相結(jié)合，能更全面地對(duì)生物現(xiàn)象進(jìn)行闡述，例如，呼吸作用、光合作用和蛋白質(zhì)合成等過程的代謝網(wǎng)絡(luò)的變化，蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)相結(jié)合可以更深入分析蛋白質(zhì)及代謝物的變化趨勢(shì)，進(jìn)而研究溫度脅迫機(jī)制。在對(duì)萊茵衣藻鎘濃度脅迫中，Jamers等[31]結(jié)合轉(zhuǎn)錄組和代謝組研究0，8.1，114.8 μmol/L鎘對(duì)萊茵衣藻生長(zhǎng)速率的影響，鎘脅迫48 h和72 h后檢測(cè)轉(zhuǎn)錄和代謝物譜發(fā)現(xiàn)，114.8 μmol/L鎘脅迫下，對(duì)萊茵衣藻生長(zhǎng)影響顯著。轉(zhuǎn)錄組中，參與氧化應(yīng)激防御機(jī)制的基因顯著增加。代謝組中，涉及谷胱甘肽合成途徑的代謝物(一種重要的抗氧化劑防御)也受到影響，鎘在轉(zhuǎn)錄水平比代謝水平影響更顯著，同時(shí)說明前者對(duì)鎘脅迫具有更高的敏感性。

表1 多層組學(xué)在植物研究中的應(yīng)用

T:轉(zhuǎn)錄組學(xué)；P:蛋白組學(xué)；M:代謝組學(xué)；L:脂質(zhì)組學(xué)

T:transcriptomics;P:proteomics;M:metabolomics;L:lipomics

2.2 響應(yīng)生物脅迫

由單基因遺傳而使植物產(chǎn)生抗性，部分已經(jīng)成功克隆并轉(zhuǎn)移到植物中以提高抗性[32]。多基因遺傳較為復(fù)雜，尚未得到很好的開發(fā)用于植物改良[33]，如水稻(Oryzasativa)稻瘟病[34]，小麥(Triticumaestivum)[35]和大麥(Hordeumvulgare)[36]鐮刀菌枯萎病、小麥白粉病[37]，馬鈴薯晚疫病(Solanumtuberosum)[38]和番茄(SolanumlycopersicumL.)中的細(xì)菌斑點(diǎn)[39]，植物響應(yīng)生物脅迫主要通過產(chǎn)生一系列生物化學(xué)物質(zhì)抵抗病原體攻擊，利用基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)用來提取系統(tǒng)信息，結(jié)合生物信息學(xué)分析揭示宿主-病原體相互作用的靶向植物抵抗生物脅迫的幾種機(jī)制[40-41]，多層組學(xué)聯(lián)合分析方法提供了可以與由單基因或多基因控制的生物脅迫抗性相關(guān)的一系列生物化學(xué)物質(zhì)的檢測(cè)。

在稻癭蚊侵染水稻組織的研究中，Agarrwal等[42]運(yùn)用轉(zhuǎn)錄組和代謝組綜合分析水稻和昆蟲互作反應(yīng)，鑒定出7 000多個(gè)差異表達(dá)基因和80個(gè)差異性代謝物，基因芯片分析碳(C)和氮(N)代謝的失調(diào)引起C/N轉(zhuǎn)變，四吡咯的合成上調(diào)和葉綠素合成及光合作用的下調(diào)，綜合結(jié)果顯示，參與脂質(zhì)過氧化(LPO)的基因表達(dá)上調(diào)，并且一個(gè)LPO標(biāo)記代謝物(壬二酸)在過敏反應(yīng)中出現(xiàn)積累，這一積累正好和昆蟲取食點(diǎn)中更多GABA(神經(jīng)遞質(zhì)和昆蟲拒食劑)積累吻合。研究揭示了宿主中無毒癭蚊(GMB1)侵?jǐn)_后的轉(zhuǎn)錄組和代謝組的廣泛重編程，這些重編程會(huì)產(chǎn)生有活性氧(比如單線態(tài)氧)的產(chǎn)生和釋放誘導(dǎo)的過敏反應(yīng)，并導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化介導(dǎo)的細(xì)胞死亡。因此，水稻施用過敏反應(yīng)作為一種手段來限制昆蟲幼蟲的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，同時(shí)積累GABA，這些都可能導(dǎo)致幼蟲死亡。為了更好的了解番茄對(duì)黃化曲葉病毒的抗性，以抗性和易感番茄為材料，Sade等[43]運(yùn)用轉(zhuǎn)錄組和代謝組相結(jié)合的方法，分析黃化曲葉病毒感染和對(duì)照1，3，7，14 d后在抗性和易感植物葉片中的代謝物的變化，揭示了抗性和易感植物之間特定代謝物水平的顯著差異性，氨基酸、多胺、酚類和吲哚類代謝物的豐度發(fā)生了實(shí)質(zhì)性改變，這些代謝物均導(dǎo)致防御化合物的合成。整合代謝組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)突出了抗性和易感植物響應(yīng)黃化曲葉病毒(包括苯丙素、色氨酸、煙酸鹽、尿素和多胺途徑)的不同調(diào)控途徑。研究表明感染后，水楊酸生物合成途徑是抗性植物中重要的防御介質(zhì)。在小麥赤霉病抗性研究中，Dhokane等[44]通過代謝組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究了攜帶抵抗型(R-RIL)和敏感型(S-RIL)等位基因(QTL-Fhb2)的重組自交系以發(fā)現(xiàn)候選基因。通過R-RIL和S-RIL代謝組分析，檢測(cè)出豐度較高的代謝產(chǎn)物有苯丙素、木質(zhì)素、甘油、脂肪酸、黃酮類、萜類化合物。通過轉(zhuǎn)錄組分析，找到了幾種受體激酶、調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、霉菌毒素的解毒和抗病相關(guān)基因。通過側(cè)翼標(biāo)記序列分析QTL-Fhb2，結(jié)合代謝組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，鑒定出確定了4-香豆酸、輔酶A生成酶、胼胝質(zhì)合成酶、堿性螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-4和肉桂醇脫氫酶為QTL-Fhb2區(qū)域內(nèi)抗性基因。從而得出結(jié)論，QTL區(qū)域上的一些基因是通過加固細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)以減少病原體在穗軸的傳播，其他一些基因通過降低脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(赤霉病毒素)的毒性以提高抗性，從而降低疾病的嚴(yán)重程度。在大豆抗蚜蟲侵害能力研究中，Brechenmacher等[45]在蚜蟲危害后48 h內(nèi)，通過轉(zhuǎn)錄組和蛋白組學(xué)技術(shù)對(duì)Rag2位點(diǎn)不同的近等基因系(NILs)進(jìn)行分析。比較Rag2和rag2株系共鑒定出3 445個(gè)蛋白，396個(gè)差異蛋白參與細(xì)胞壁代謝、糖代謝和應(yīng)激反應(yīng)。轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)抗性和敏感品系中有2 361個(gè)基因有明顯的差異調(diào)節(jié)，Rag2株系中上調(diào)表達(dá)的蛋白參與細(xì)胞壁構(gòu)建、次生代謝、激素代謝等脅迫條件下的信號(hào)傳遞和轉(zhuǎn)錄反應(yīng)等生物學(xué)過程。Rag2株系下調(diào)表達(dá)的蛋白參與光合作用和碳代謝。研究發(fā)現(xiàn)，位于Rag2位點(diǎn)上的兩個(gè)基因(一個(gè)功能未知、一個(gè)是線粒體蛋白酶)在抗性基因型材料上顯著提高，一個(gè)位于Rag2位點(diǎn)內(nèi)的假定NBS-LRR抗性基因在兩個(gè)株系間沒有差異表達(dá)，但是另一個(gè)位于Rag2位點(diǎn)邊緣的NBS-LRR基因卻出現(xiàn)差異，筆者推斷該基因可能是一個(gè)控制蚜蟲抗性的候選基因。宿主-病原體相互作用研究中利用代謝組學(xué)來了解植物的生物學(xué)功能[46]，植物育種[47]以及研究宿主與病原體的相互作用[48]已有較多報(bào)道。同時(shí)，蛋白質(zhì)組學(xué)已被廣泛用于研究宿主-病原體相互作用[49-50]。筆者著重于結(jié)合不同組學(xué)技術(shù)，解譯生物脅迫對(duì)植物響應(yīng)機(jī)制，并鑒定出可用于育種的候選基因。

2.3 基因功能研究

基因、RNA和蛋白的差異變化可能在觀察生物體表型上沒有明顯的改變，但一般會(huì)引起下游代謝物的顯著變化[4]。因此，可通過分析基因、RNA和蛋白變化前后的代謝物差異來研究基因功能，明確相關(guān)基因在轉(zhuǎn)錄和翻譯過程中的不同調(diào)控作用，從而了解基因和蛋白調(diào)節(jié)下游代謝產(chǎn)物。

小麥TaGW2-6A的編碼區(qū)等位基因變異與籽粒的寬度和重量密切相關(guān)，但遺傳機(jī)制尚不清楚。因此，為了獲得小麥籽粒發(fā)育過程中由TaGW2-6A調(diào)控的關(guān)鍵功能，Du等[51]對(duì)TaGW2-6A等位基因變異材料進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組和蛋白組分析。轉(zhuǎn)錄組結(jié)果顯示TaGW2-6A的等位變異在幾個(gè)數(shù)量級(jí)上顯著不同，每個(gè)TaGW2-6A等位變異在開花后6 d(DAA)到達(dá)第一個(gè)轉(zhuǎn)錄高峰期，但是插入TaGW2-6A等位變異到達(dá)第二個(gè)峰值時(shí)比正常類型早，即12DAA而不是20DAA。有關(guān)水稻葉片維管的脈絡(luò)發(fā)育調(diào)節(jié)中，Peng等[52]利用水稻突變體(dl2)探討葉維管形成和分化過程中的蛋白組和轉(zhuǎn)錄組變化。研究發(fā)現(xiàn)有3 172個(gè)蛋白質(zhì)和能匹配到基因的9865230個(gè)標(biāo)簽，141個(gè)蛋白質(zhì)和98個(gè)mRNA在dl2突變體和野生型之間差異表達(dá)，差異表達(dá)mRNA和差異表達(dá)的蛋白相關(guān)分析顯示在mRNA和蛋白質(zhì)之間表達(dá)相關(guān)性不高，說明轉(zhuǎn)錄和翻譯過程中有不同的調(diào)控作用。通過分析了差異表達(dá)蛋白所參與的過程和代謝途徑，發(fā)現(xiàn)一些關(guān)鍵蛋白的上調(diào)或下調(diào)證實(shí)維管束分化是一個(gè)活躍的過程。研究結(jié)果表明，葉維管系統(tǒng)的發(fā)育和生理過程是一個(gè)全面調(diào)控、復(fù)雜的過程。在利用基因組學(xué)資源鑒定番茄果實(shí)調(diào)控抗氧化物含量的候選基因研究中，Calafiore等[53]通過建立潘那利野生番茄滲入系(IL7-3)，導(dǎo)入能增加抗壞血酸和類胡蘿卜素含量的QTL，分別在果實(shí)發(fā)育的3個(gè)階段測(cè)量了IL7-3中抗壞血酸和類胡蘿卜素的含量，查找了番茄基因參考序列和最近發(fā)布的潘那利野生番茄基因參考序列，通過分析CAPS標(biāo)記，鑒定出了控制抗壞血酸積累的6個(gè)候選基因和一個(gè)控制類胡蘿卜素的候選基因，并進(jìn)行了qRT-PCR驗(yàn)證。最后，通過28個(gè)物種特異性的標(biāo)記對(duì)7個(gè)亞漸滲系進(jìn)行了基因分型，采用代謝物含量進(jìn)行評(píng)估，分析證明9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素加雙氧酶和一種L-抗壞血酸氧化酶同系物的基因的表達(dá)量顯著提高，這些基因與抗壞血酸和類胡蘿卜素的積累相關(guān)，結(jié)果表明，結(jié)合番茄遺傳、基因組資源和生物信息學(xué)工具解析控制抗壞血酸和類胡蘿卜素積累QTL的這種方法是可行的。在對(duì)擬南芥自噬相關(guān)基因(ATG)研究中，Avin-Wittenberg等[54]利用黃化的擬南芥幼苗作為缺碳的模式系統(tǒng)，結(jié)合代謝組學(xué)、脂質(zhì)組學(xué)和蛋白組學(xué)分析，缺碳條件下，atg突變株幼苗比野生型幼苗生長(zhǎng)遲緩的內(nèi)在原因，野生型和atg突變株顯著的差別表明，在碳饑餓時(shí)自噬作用對(duì)細(xì)胞代謝的整體影響和一些能量喪失，導(dǎo)致了形態(tài)學(xué)上的表型變化。多層組學(xué)數(shù)據(jù)的結(jié)合，不僅使實(shí)驗(yàn)結(jié)果得到相互驗(yàn)證，更是對(duì)研究結(jié)果的充分補(bǔ)充說明。在對(duì)不同油菜株系含油量區(qū)別研究中，Gan等[55]采用超微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)合蛋白組學(xué)和比較基因組分析研究了高含油量(55.19%)和低含油量(36.49%)的兩種油菜株系的種子油提特征及蛋白組差異，發(fā)現(xiàn)高含油量株系的油體排列更加緊密，鑒定出119個(gè)差異表達(dá)蛋白(包含32個(gè)油體蛋白)，這些蛋白主要參與與油體形成、脫水及蛋白的儲(chǔ)存和防御等生物過程。研究還發(fā)現(xiàn)了與含油量相關(guān)的QTL區(qū)間內(nèi)包含一些差異蛋白相對(duì)應(yīng)的基因。并通過在擬南芥中表達(dá)全場(chǎng)cDNA的方式對(duì)一個(gè)編碼貯藏蛋白的基因的功能進(jìn)行了深入分析。

2.4 輔助育種

隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)和代謝組學(xué)等多組學(xué)研究技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于農(nóng)學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域，同時(shí)它們之間也存在一定的關(guān)聯(lián)性。運(yùn)用相應(yīng)的技術(shù)手段對(duì)植物體內(nèi)所有基因、蛋白以及小分子代謝物進(jìn)行全面的定性定量分析，然后對(duì)不同組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，并與植物的各種重要性狀直接相關(guān)，從而為植物遺傳改良實(shí)踐提供新思路。

植物的生長(zhǎng)發(fā)育過程中會(huì)產(chǎn)生大量的代謝物，其中類黃酮、硫苷、氨基酸、維生素、酚類、萜類等代謝物與品質(zhì)、抗性等有密切的關(guān)系。類黃酮是一類廣泛分布在植物界的次生代謝產(chǎn)物，在植物的發(fā)育、花色的形成、植物微生物互作以及應(yīng)對(duì)各種生物、非生物脅迫反應(yīng)發(fā)揮重要作用。Peng等[56]對(duì)14種代表性植物中類黃酮的定性及定量分析揭示：?jiǎn)巫尤~(尤其是鴨跖草類)植物中存在大量的氧糖基黃酮，而擬南芥等大量積累氧糖基黃酮醇。同時(shí)對(duì)水稻自然群體中所檢測(cè)的黃酮代謝組數(shù)據(jù)[57-58]進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)，確定了4個(gè)控制氧糖基黃酮自然變異的位點(diǎn)。結(jié)合體外生化實(shí)驗(yàn)及對(duì)轉(zhuǎn)基因植株的代謝譜分析，鑒定出兩個(gè)主效基因：黃酮-5-氧糖基轉(zhuǎn)移酶(F5GlcT)和黃酮-7-氧糖基轉(zhuǎn)移酶(F7GlcT)。F5GlcT和F7GlcT強(qiáng)弱功能等位變異組合的分布與水稻品種在不同紫外強(qiáng)度下的地理分布顯著相關(guān)，且其超量表達(dá)均能顯著提高植株對(duì)紫外的耐受性，從而揭示了水稻氧糖基黃酮自然變異的生化基礎(chǔ)及其在紫外耐受性方面的作用，為作物遺傳改良實(shí)踐提供了新資源。結(jié)合相同的技術(shù)，對(duì)番茄育種過程中的代謝變化進(jìn)行全面解讀，對(duì)442份材料進(jìn)行代謝組分析，發(fā)現(xiàn)茄堿的自然變異受到5個(gè)主要遺傳位點(diǎn)控制，且這些位點(diǎn)在馴化及改良過程中受到強(qiáng)烈選擇。對(duì)其中效應(yīng)最大的位點(diǎn)是位于10號(hào)染色體上包含P450氧化還原酶、?；D(zhuǎn)移酶和糖基轉(zhuǎn)移酶的一個(gè)基因簇進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)糖基轉(zhuǎn)移酶(Solyc10g085230)外顯子上發(fā)現(xiàn)一個(gè)點(diǎn)突變?cè)斐商崆敖K止，顯著降低栽培番茄果實(shí)中茄堿物質(zhì)的含量。通過兩個(gè)主效的位點(diǎn)，能夠?qū)⒅饕褖A含量降低80%。Zhu等[59]研究表明粉果育種是選擇了在轉(zhuǎn)錄因子SlMYB12的啟動(dòng)子區(qū)域一個(gè)導(dǎo)致低水平轉(zhuǎn)錄的變異，從而造成粉果番茄中營(yíng)養(yǎng)因子類黃酮含量大幅下降。另外，研究還表明番茄育種過程中對(duì)果重基因的選擇及野生漸滲片段對(duì)代謝組的影響，首次揭示了育種過程中代謝組變化的“搭車效應(yīng)”。該研究通過多組學(xué)手段對(duì)育種過程進(jìn)行全景式的分析，其大數(shù)據(jù)資源也將促進(jìn)番茄營(yíng)養(yǎng)、健康品質(zhì)改良研究。水稻花器官由于類黃酮物質(zhì)的積累而顯現(xiàn)不同的顏色。Sun等[60]以穎殼著色為例，比較系統(tǒng)地從遺傳、分子、代謝、進(jìn)化等水平闡述了調(diào)控水稻著色的C-S-A基因模型，解析類黃酮著色的遺傳機(jī)制及其基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。在C-S-A 基因系統(tǒng)中，有三種類型的基因參與調(diào)控類黃酮的著色，其中C1編碼R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子，決定顏色的產(chǎn)生；S1編碼bHLH轉(zhuǎn)錄因子，發(fā)揮組織特異著色的功能；A1編碼二氫黃酮醇還原酶(DFR)，負(fù)責(zé)花青素的合成。其中，C1和A1是顏色形成的關(guān)鍵因子，共同決定了顏色能否形成以及形成何種顏色。為了解植物硫苷代謝的分子網(wǎng)絡(luò)，Chen等[61]對(duì)擬南芥中脂肪族硫苷的生物合成關(guān)鍵酶進(jìn)行RNA干擾(RNAi)，并對(duì)其中兩個(gè)RNAi的株系進(jìn)行了蛋白組學(xué)和代謝組學(xué)的綜合分析。經(jīng)過整合分析之后發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞通路過程和硫苷代謝之間的緊密分子關(guān)系，筆者結(jié)合蛋白組學(xué)和代謝組學(xué)描繪了一個(gè)新的硫苷代謝的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，從原因和結(jié)果兩個(gè)層面綜合闡述硫苷合成酶RNAi之后的系統(tǒng)變化，為進(jìn)一步了解硫苷調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，有助于后續(xù)增強(qiáng)植物抗性和質(zhì)量，并應(yīng)用于植物育種中。在對(duì)大豆蚜蟲的研究中，Brechenmacher等[45]采用抗蟲能力不同的近等基因系(NIL)材料為研究對(duì)象，應(yīng)用LC-MS/MS技術(shù)和RNA測(cè)序技術(shù)分析了不同材料受蚜蟲危害后轉(zhuǎn)錄組和蛋白組的差異，對(duì)差異表達(dá)的生物分子的功能分析較為全面的了解了大豆抗蚜蟲危害的分子機(jī)理。另外，通過與NIL位點(diǎn)的綜合分析，發(fā)現(xiàn)了一些可能與抗性相關(guān)的基因，為大豆抗蟲育種提供了新思路。在棉花抵抗黃萎病菌研究中，Gao等[62]基于蛋白組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)參與刺激代謝的一些基因，活性氧產(chǎn)生和植物激素信號(hào)通路在生理和分子方面的分析中得到確認(rèn)，相關(guān)基因的作用通過病毒誘導(dǎo)基因沉默(VIGS)進(jìn)一步被表征。研究發(fā)現(xiàn)，棉酚、油菜素內(nèi)酯和茉莉酸的產(chǎn)生足以影響對(duì)黃萎病菌的抗性，在棉花接種黃萎病菌油菜素內(nèi)酯信號(hào)被激活，并且外源油菜素內(nèi)酯的使用增強(qiáng)了棉花對(duì)黃萎病菌的抗性，以上數(shù)據(jù)得出了在分子基礎(chǔ)上棉花抵抗黃萎病菌的新見解，為棉花抗病育種提供了重大參考價(jià)值。采用相同的方法，Ning等[63]比較兩個(gè)品種以及F10重組自交系(RIL)群體在冷害脅迫下蛋白累計(jì)差異，研究發(fā)現(xiàn)，PAP6-like蛋白在小麥耐冷方面可能起重要作用。

3 展望

近幾十年來，隨著新技術(shù)的不斷涌現(xiàn)，加快了多組學(xué)研究向定量化，高通量的發(fā)展，特別是在單細(xì)胞層次研究基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)，已成為人們發(fā)現(xiàn)生命化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)和深入了解其分子機(jī)制的新方向。伴隨著生物信息學(xué)分析的個(gè)性化和多樣性，基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)，在生命科學(xué)的多個(gè)領(lǐng)域已經(jīng)取得了重大成果。從基因水平到蛋白水平以及代謝終產(chǎn)物的研究，構(gòu)建出植物響應(yīng)逆境的基因-mRNA-蛋白質(zhì)-代謝物網(wǎng)絡(luò)，更為詳實(shí)的明確植物在逆境條件下的分子機(jī)理，這些組學(xué)的聯(lián)合運(yùn)用極大地促進(jìn)科學(xué)界對(duì)生命現(xiàn)象的理解。多組學(xué)數(shù)據(jù)雖能夠得到較為完整的結(jié)果，但是在分析數(shù)據(jù)的研究過程中會(huì)忽略相關(guān)的結(jié)論，反而愈加關(guān)注差異表達(dá)的基因、mRNA、蛋白和代謝物。因此，值得強(qiáng)調(diào)的一點(diǎn)就是使用多組學(xué)分析技術(shù)會(huì)增加復(fù)雜的風(fēng)險(xiǎn)。就像樹被森林所隱藏，外界環(huán)境之間的分子相互作用會(huì)被大量的多組學(xué)數(shù)據(jù)淹沒。還有得到的分子代謝網(wǎng)絡(luò)應(yīng)進(jìn)行遺傳、細(xì)胞等水平上的驗(yàn)證。

在植物響應(yīng)逆境及輔助育種的研究中，這四大組學(xué)的基礎(chǔ)理論研究已經(jīng)取得了一些進(jìn)展，并取得了一些突破性的成果。當(dāng)然，目前組學(xué)技術(shù)在植物育種的應(yīng)用研究還處在較為初級(jí)的階段。一方面，基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和的代謝組學(xué)，在基礎(chǔ)理論研究中取得了豐碩的成果；另一方面，基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和的代謝組學(xué)應(yīng)用于植物生產(chǎn)上培育良種的實(shí)踐較少。未來應(yīng)該將組學(xué)多應(yīng)用于實(shí)踐，培育和改良新品種，特別是對(duì)于培育突破性品種?；蚓庉嬜鳛橐豁?xiàng)最有效、最便捷地“編輯”基因的技術(shù)，在作物遺傳改良上的取得了豐碩的成果[64-66]，這項(xiàng)史詩(shī)級(jí)的技術(shù)能對(duì)植物基因組進(jìn)行精準(zhǔn)的定點(diǎn)敲除、插入和替換。隨著人們對(duì)植物的抗性、品質(zhì)育種的不斷重視，組學(xué)技術(shù)和基因編輯技術(shù)聯(lián)合起來運(yùn)用對(duì)植物基因功能研究、作物遺傳改良和新品種培育未來將具有巨大的潛力。運(yùn)用組學(xué)的優(yōu)勢(shì)和科研成果可深入到醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)以及資源保存等研究領(lǐng)域，推動(dòng)基因科技成果轉(zhuǎn)化，實(shí)現(xiàn)基因科技造福人類。

4 結(jié)語

隨著各組學(xué)分析平臺(tái)的不斷革新，數(shù)據(jù)挖掘、分析工具和方法的不斷改進(jìn)，基因、蛋白和代謝物共享數(shù)據(jù)庫(kù)的建立和不斷完善，將來自不同組學(xué)的數(shù)據(jù)源進(jìn)行歸一化處理、比較分析，建立不同組間數(shù)據(jù)的關(guān)系，綜合多組學(xué)數(shù)據(jù)對(duì)生物過程從基因、轉(zhuǎn)錄、蛋白和代謝水平進(jìn)行全面的深入的闡釋，多層組學(xué)未來在植物研究中會(huì)得到更加廣泛的應(yīng)用。多層組學(xué)聯(lián)合分析將在揭示水稻響應(yīng)脅迫機(jī)制、基因功能解析及輔助育種等方面發(fā)揮越來越重要的作用。