田?，?，單 雷，李新國，郭 峰，張智猛，孟靜靜，萬書波，彭振英*

(1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心/山東省作物遺傳改良與生態(tài)生理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250100；2.山東省花生研究所，山東 青島 266100； 3.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，山東 濟(jì)南 250100)

花生是我國重要的油料作物之一，在國民食用油供給中具有舉足輕重的地位[1-2]。植物體以甘油三磷酸為骨架、以脂肪酸為底物通過不同的代謝途徑合成三酰甘油(triacylgycerol，TAG)，最終以油體形式貯藏在種子中，成為植物油的主要成分。過去研究認(rèn)為，TAG主要是由二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶(diacylglycerol acyltransferase, DGAT)催化完成的，二酰甘油 (diacylglycerol, DAG) 和脂酰 CoA在DGAT的催化下合成TAG，DGAT是TAG合成的限速酶，這一途徑被稱為Kennedy途徑[3-4]，該途徑依賴脂酰-CoA。后來研究發(fā)現(xiàn)植物從DAG到TAG的合成還有另外的途徑，這是一種不依賴脂酰-CoA的合成途徑，即PDAT(phospholipids:diacylglycerol acyltransferase，PDAT)途徑，PDAT催化DAG和磷脂合成TAG與溶血磷脂[5]。

PDAT活性最早是由Dahlqvist等人在向日葵(Helianthusannuus)、蓖麻(Ricinuscommunis)、還陽參屬植物(Crepispalaestina)的微粒體中發(fā)現(xiàn)的[6]。隨后他們在釀酒酵母中也發(fā)現(xiàn)了PDAT活性，并鑒定了第一條PDAT基因，該基因與人類卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶(lecithin-cholesterol acyltransferase，LCAT，EC 2.3.1.43)具有較高的相似性，并證實(shí)其在酵母TAG合成中具有重要作用[5, 7]。Fan等人認(rèn)為PDAT和DGAT在TAG合成中功能存在部分冗余，且對于種子和花粉發(fā)育是必需的。同時(shí)，他們用擬南芥tgd1-1突變體證明PDAT1在營養(yǎng)組織TAG生物合成中是必需的，在此背景下破壞PDAT導(dǎo)致葉片發(fā)育嚴(yán)重遲緩，配子體缺陷甚至細(xì)胞過早死亡[8]。PDAT對底物的特異性在不同物種是存在差異的，對擬南芥AtPDAT1功能研究顯示，該基因可以催化不同鏈長(C10-C22)以及不同飽和程度的?；w合成TAG，尤其是對含有多雙鍵、羥化酰基和環(huán)氧化的?；w具有較高的偏好性[9]。在蓖麻中，Kim等發(fā)現(xiàn)RcoPDAT1-2具有與類似FAH12的功能，參與蓖麻油酸向TAG轉(zhuǎn)化，被認(rèn)為是蓖麻特異性基因。將該基因轉(zhuǎn)化擬南芥顯著提高了擬南芥種子中羥基脂肪酸的積累量，高達(dá)25%[10]。

在真核生物中，可變剪切(alternative splicing，AS)是一種重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制[11]，隨著新一代測序技術(shù)以及多種組學(xué)的交叉應(yīng)用，越來越多的AS基因被發(fā)現(xiàn)[12-14]。在擬南芥中60%多外顯子基因具有AS現(xiàn)象；在番茄幼苗、花和發(fā)育幼果等組織中59.3%的基因發(fā)生了AS[15]，水稻33%的基因具有這種情況[16-17]。雖然在不同物種中發(fā)生AS的基因數(shù)量與剪接類型各不相同，但它們在植物生長發(fā)育以及應(yīng)對各種逆境脅迫中都具有重要作用。Zheng等(2017)研究了AhDGAT1基因7種可變剪接體，并分別在缺陷酵母H1426中驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)除AhDGAT1.2和AhDGAT1.4的C-末端截短沒有DGAT酶活性外，其余五個(gè)較長的AhDGAT1變體表現(xiàn)出很高的酰基轉(zhuǎn)移酶活性并且能夠互補(bǔ)該菌株表型[18]。

到目前為止，在花生中對該基因的研究還未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究利用生物信息學(xué)方法在全基因組水平對AhPDAT基因家族的進(jìn)化關(guān)系、表達(dá)模式和可變剪接等方面進(jìn)行了系統(tǒng)分析，為進(jìn)一步深入研究該家族的功能奠定了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 基因檢索

從TAIR數(shù)據(jù)庫中下載2個(gè)已知的擬南芥PDAT基因(AT5G13640，AT3G44830)為探針，通過 BLAST 搜索花生、大豆、苜蓿等10個(gè)物種的PDAT同源基因。從花生數(shù)據(jù)庫Peanutbase[1](https://www.peanutbase.org/)中下載基因組與蛋白數(shù)據(jù)，利用SeqHunter1.0，E-value<1.0e-15本地Blast，搜索AhPDAT基因。文中涉及的大豆、苜蓿其他植物的PDAT基因的相關(guān)序列來自Phytozome(http://phytozome.jgi.doe.gov/)數(shù)據(jù)庫。同時(shí)，將序列利用在線網(wǎng)站Pfam Search(http://pfam.xfam.org/search)進(jìn)行家族鑒定分析，預(yù)測的蛋白包含卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶功能結(jié)構(gòu)域(PF02450)即為PDAT蛋白。

1.2 AhPDATs基因結(jié)構(gòu)分析

將AhPDATs的基因組序列和CDS利用在線網(wǎng)站Gene Structure Display Server(GSDS, http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)繪制外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)圖[19]。

1.3 AhPDATs序列特征與蛋白特性

運(yùn)用BioXM2.6分析AhPDATs蛋白的理化性質(zhì)；運(yùn)用TMHMM(www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)[20]在線分析分析跨膜結(jié)構(gòu)域；運(yùn)用CELLO v.2.5(http://cello.life.nctu.edu.tw/)在線軟件預(yù)測亞細(xì)胞定位情況；運(yùn)用SignalP4.1Server (http://www.cbs.dtu.dk /services/SignalP)在線預(yù)測信號肽。

1.4 AhPDATs系統(tǒng)進(jìn)化與保守基序分析

為了研究花生與其他物種PDATs的進(jìn)化關(guān)系，以釀酒酵母PDAT蛋白(NM_001183185)為外類群，選取1.1中獲得的10個(gè)物種(蓖麻、菜豆、大豆、可可、棉花、苜蓿、擬南芥、亞麻、楊樹、花生)中氨基酸數(shù)目大于500的37個(gè)PDATs蛋白序列，利用Clustal X進(jìn)行多重比對，并運(yùn)用 MEGA6.0軟件中的鄰接法(neighbor-joining，NJ)對構(gòu)建進(jìn)化樹，設(shè)定泊松校正法計(jì)算進(jìn)化距離，Bootstrap值設(shè)為1000[21]。同時(shí)，運(yùn)用MEME[22](http://meme.nbcr.net/meme/cgi-bin/meme.cgi)在線分析PDAT 蛋白的保守基序信息，最大基序檢索值設(shè)為10，并利用TBtools工具導(dǎo)出圖片。

1.5 AhPDATs表達(dá)模式分析

為研究AhPDATs基因的時(shí)空表達(dá)模式，根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)(NCBI: PRJNA354652)中AhPDATs的FPKM值，利用HemI軟件繪制其在根、葉、種子組織的表達(dá)模式圖。轉(zhuǎn)錄組所測組織為花生的根(Root)、葉(Leaf)、果針入土30 d(Seed1)和50 d(Seed2)。

1.6 可變剪接分析

結(jié)合花生基因組(https://www.peanutbase.org/)和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(NCBI: PRJNA354652)，用ASTALAVISTA program (http://genome.crg.es/astalavista/)分析其可變剪接情況。本研究涉及到5種AS事件，分別為：轉(zhuǎn)錄起始位置可變剪切(transcription start site，TSS)、轉(zhuǎn)錄終止位置可變剪接(transcription terminal site，TTS)、外顯子跳躍(exon skipping，ES)、內(nèi)含子滯留(intron retention，IR)、可變外顯子 5'或3'端剪切(alternative exon 5' or 3'ends，AE)[23]。

2 結(jié)果與分析

2.1 AhPDATs基因家族的鑒定

通過Blast和Pfam鑒定，最終從花生數(shù)據(jù)庫共檢索到17個(gè)AhPDATs基因(表1)，它們不均勻地分布在9條染色體上，其中A基因組中10條，B基因組中7條。Aradu.S9XBY和Araip.I19GZ、Aradu.AQ5JR和Araip.HH1X5、Araip.18K24和Aradu.4X75W、Aradu.UA9D8和Araip.WVH6X為4對同源基因，位于3對染色體上，其中Aradu.AQ5JR和Aradu.4X75W、Araip.18K24和Araip.HH1X5分別位于Aradu.A03和Araip.B03染色體上。

AhPDATs編碼蛋白的氨基酸個(gè)數(shù)介于88～742之間，其中Araip.8M2BC編碼最短，僅88個(gè)氨基酸，分子量為9.72 kD，序列不完整；Aradu.S9XBY編碼最長，共742個(gè)氨基酸，分子量為83.76 kD。等電點(diǎn)的變化幅度比較大(表1)，其中8個(gè)成員為酸性蛋白，9個(gè)為堿性蛋白，最小的是Araip.8M2BC，為4.37；最大的為Aradu.AQ5JR，達(dá)到9.6。

2.2 AhPDATs跨膜結(jié)構(gòu)和亞細(xì)胞定位分析

利用TMHMM在線工具對17個(gè)AhPDATs進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果表明，僅有Araip.I19GZ、Araip.18K24、Aradu.S9XBY三個(gè)蛋白具有跨膜結(jié)構(gòu)(見表1)，其N端位于膜內(nèi)，C端位于膜外。亞細(xì)胞定位分析發(fā)現(xiàn)，Aradu.UA9D8、Araip.WVH6X、Araip.8M2BC定位于葉綠體；Aradu.S9XBY、Araip.I19GZ、Aradu.ELK98定位在線粒體；Aradu.43KMV和Aradu.AQ5JR定位于質(zhì)膜；Aradu.EJC3Z、Aradu.8Y8QZ、Araip.WT4S8定位于細(xì)胞外；其余均定位于細(xì)胞質(zhì)中。此外，SignalP 在線分析顯示，僅Aradu.4X75W存在信號肽(見表1)。

表1 AhPDATs家族基因的基本信息

2.3 AhPDATs的基因結(jié)構(gòu)分析

外顯子—內(nèi)含子結(jié)構(gòu)分析，顯示AhPDAT家族基因的外顯子數(shù)目變化幅度較大(見圖1)，從2至8不等，其中Araip.8M2BC和Araip.HH1X5的外顯子個(gè)數(shù)最少，僅有2個(gè)外顯子；Aradu.43KMV比較特殊，全長僅有350 aa，但外顯子個(gè)數(shù)最多，共8個(gè)。同源基因之間基因結(jié)構(gòu)以及內(nèi)含子相位高度保守，外顯子個(gè)數(shù)介于6～8之間，其中Aradu.S9XBY與Araip.I19GZ外顯子個(gè)數(shù)基本一致，內(nèi)含子相位差異較大；Aradu.4X75W較Araip.18K24多了一個(gè)外顯子和一個(gè)內(nèi)含子，其余部分無差異。此外，編碼蛋白序列較短(< 500 aa)的AhPDAT基因內(nèi)含子長度差異較大，保守性低，具體原因有待深入研究。

2.4 AhPDATs系統(tǒng)進(jìn)化與保守基序分析

在17個(gè)AhPDAT中，僅有Aradu.S9XBY、Araip.I19GZ、Araip.18K24、Aradu.4X75W、Aradu.UA9D8和Araip.WVH6X可編碼完整的蛋白，因此選用此6個(gè)蛋白用于系統(tǒng)進(jìn)化分析。

圖1 AhPDATs的基因結(jié)構(gòu)分析 Fig.1 Gene structure analysis of AhPDAT genes

圖2 花生及其他植物PDAT的系統(tǒng)進(jìn)化與保守基序分析Fig.2 Phylogenetic relationships and conserved motifs analysis of PDAT from peanut and other plants 注： A：系統(tǒng)進(jìn)化樹(Phylogenetic tree)； B：保守基序(Conserved motifs)。

以釀酒酵母PDAT為外類群，利用鄰近法初步分析AhPDAT與擬南芥、大豆、蒺藜苜蓿等雙子葉植物31個(gè)PDATs蛋白的進(jìn)化關(guān)系(圖2)。結(jié)果表明，除釀酒酵母(紅色字體標(biāo)注)外，雙子葉植物進(jìn)化成了I、II、III、IV、V五條獨(dú)立分支，在進(jìn)化樹末端共形成9對旁系同源基因，其中6個(gè)AhPDAT(綠色字體標(biāo)注)分布在I、II亞組，形成3對旁系同源基因。等位基因Aradu.UA9D8和Araip.WVH6X位于I亞組，與蒺藜苜蓿PDAT進(jìn)化關(guān)系較近；Araip.18K24和Aradu.4X75W、Aradu.S9XBY和Araip.I19GZ被分在II亞組，與菜豆(Phvul.003G133000.1.p)、大豆(Glyma.13G108100.1.p和Glyma.17G051300.1.p)關(guān)系密切。III、IV、V亞組成員數(shù)分別為4、1、10，其中Gorai.004G284600.1單獨(dú)組成IV亞組。另外，保守基序分析結(jié)果顯示，各亞組之間基序組成與分布高度保守，除釀酒酵母NM_001183185、Aradu.UA9D8和Araip.WVH6X沒有Motif10外，其余均含有10個(gè)保守基序。

2.5 AhPDATs表達(dá)模式分析

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對AhPDATs進(jìn)行表達(dá)模式分析，結(jié)果顯示Aradu.S9XBY、Araip.I19GZ、Araip.WVH6X、Aradu.UA9D8和Aradu.AQ5JR在所有組織均有表達(dá)，其中Araip.WVH6X在葉中表達(dá)量最高，而Aradu.AQ5JR在葉中表達(dá)最低；Araip.WVH6X、Aradu.S9XBY、Araip.I19GZ和Aradu.UA9D8在根與葉中的表達(dá)量大于種子，其中Araip.WVH6X在葉中表達(dá)量最高；其余12個(gè)基因在四個(gè)組織中表達(dá)量都較低。這些基因在花生不同組織以及種子不同發(fā)育階段呈現(xiàn)不同的表達(dá)模式，預(yù)示它們功能也隨之有所差異。整體而言，AhPDATs在根和葉中的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于種子中，顯示出它們發(fā)揮作用的地方主要是在根和葉中，而對于種子中TAG的合成所起作用相對較小。

圖3 AhPDATs的表達(dá)模式分析 Fig.3 Expression pattern analysis of AhPDATs

2.6 AhPDATs可變剪接分析

基于RNA-Seq數(shù)據(jù)，統(tǒng)計(jì)并分析AhPDATs的AS情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)17個(gè)AhPDAT基因中有5個(gè)具有可變剪接體，約占29.41%，其中AE是最多的AS形式，共18個(gè)，其次為TSS，有17個(gè)。Aradu.S9XBY、Aradu.AQ5JR在四個(gè)組織中均發(fā)現(xiàn)了不同的AS形式，而且Aradu.S9XBY的可變剪接體最多，高達(dá)12個(gè)，其中最多的剪接形式為AE，其次為TTS。根據(jù)各組織中AS的分布，發(fā)現(xiàn)種子中AS的數(shù)目以及剪接形式最多，其次為葉，根中最少，僅Aradu.S9XBY在根中存在可變剪接體，主要形式為AE(表2)。AhPDAT基因家族在不同組織以及不同發(fā)育階段產(chǎn)生了不同的可變剪接體，預(yù)示AS對其功能具有重要的調(diào)節(jié)作用。

表2 AhPDATs的可變剪接分析

3 討 論

PDAT的功能同DGAT一樣，都是催化TAG合成的最后一步反應(yīng)，雖然目前對于PGAT的研究遠(yuǎn)遠(yuǎn)滯后于DGAT，但也取得了一些進(jìn)展。研究發(fā)現(xiàn)，PDAT不僅具有TAG合成的功能[24-25]，還在非生物脅迫中也具有重要作用[26-27]。Fan 等研究發(fā)現(xiàn)PDAT1在介導(dǎo)TAG合成中起關(guān)鍵作用，進(jìn)而保護(hù)植物快速生長組織中FFA誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡[8]。在擬南芥中PDAT1介導(dǎo)的TAG積累增加了植株耐熱性，與野生型幼苗相比，pdat1突變體幼苗對嚴(yán)重?zé)崦{迫更敏感，同時(shí)幼苗存活率顯著降低。在綠藻中研究表明，在缺氮脅迫下有助于MiPDAT將膜脂向TAG轉(zhuǎn)化。以上研究說明PDAT在植物生長發(fā)育以及應(yīng)對外界環(huán)境變化中具有重要作用[24,27]。通過對17個(gè)AhPDATs基因的表達(dá)模式分析表明，AhPDATs主要在根和葉中表達(dá)，可見它在種子TAG合成中所起的作用相對較小，花生種子中TAG的合成主要是由AhDGAT催化完成的，而AhPDAT在根和葉發(fā)育及其應(yīng)對環(huán)境變化中具有重要作用。這與Fan等人報(bào)道是一致的，F(xiàn)an等人認(rèn)為PDAT對葉中TAG的合成具有重要作用，過表達(dá)PADT可以顯著提高葉片中脂肪酸和TAG的含量[8]。

研究表明大部分植物PDAT具有6個(gè)外顯子[28-29]，而萊茵衣藻PDAT具有15個(gè)外顯子[30]，微胞藻PDAT僅有1個(gè)外顯子[29]。本實(shí)驗(yàn)對AhPDAT的基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行了初步分析，AhPDATs外顯子數(shù)目(2～8個(gè)不等)以及內(nèi)含子相位存在一定差異，但是有三對等位基因能夠編碼完整蛋白，它們多數(shù)有6個(gè)外顯子。Aradu.43KMV比較特殊，有8個(gè)外顯子。將Aradu.43KMV在NCBI中nr數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行blast比對，結(jié)果表明其編碼蛋白C-端完整，含有PDAT家族的保守結(jié)構(gòu)域，與其他完整PDAT序列相比中間有一些片段缺失，可能是由于預(yù)測基因序列不準(zhǔn)確所致，因此有關(guān)該基因真實(shí)的基因結(jié)構(gòu)需要進(jìn)一步用實(shí)驗(yàn)證實(shí)。其余一些外顯子數(shù)目較少的AhPDAT基因大多是由于序列不完整所致。植物PDAT的保守結(jié)構(gòu)域位于序列的中后部，其N-端序列保守性較差，因此預(yù)測其N-端序列是很困難的，需要進(jìn)一步用RACE方法進(jìn)行驗(yàn)證。

研究證明，植物PDAT通常位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和質(zhì)體中發(fā)揮作用[8]，蓖麻PDAT位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上[31]，缺刻緣綠藻PDAT則位于質(zhì)膜上[27]。本研究分析結(jié)果顯示，AhPDATs不僅可以定位于葉綠體和質(zhì)膜上，還可以定位于線粒體和細(xì)胞質(zhì)上，甚至作為分泌蛋白定位于細(xì)胞外。這種復(fù)雜的定位形式反應(yīng)了AhPDAT功能的多樣性。Simpsona等人報(bào)道，蠟果楊梅的果實(shí)表面覆蓋一層厚厚的臘質(zhì)，其中富含TAG，而且這些TAG是在細(xì)胞外合成的，因此推測催化TAG合成的?；D(zhuǎn)移酶應(yīng)該是位于細(xì)胞外的；Simpsona又對其進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄譜分析，結(jié)果表明DGAT2和DGAT3、PDAT1、GPAT以及LPAAT3均具有很高的表達(dá)水平，顯示出這些基因在蠟果楊梅果實(shí)蠟質(zhì)層TAG合成中的重要作用[32]。部分AhPDAT具有信號肽定位于細(xì)胞外，也許和花生表皮臘質(zhì)形成有關(guān)。

進(jìn)化分析顯示，AhPDATs與苜蓿、菜豆聚為一枝，親緣關(guān)系較近。同時(shí)，在進(jìn)化樹末端發(fā)現(xiàn)形成3對花生特異性旁系同源基因，胡利宗等在分析大豆PDAT基因的進(jìn)化關(guān)系時(shí)也發(fā)現(xiàn)了這種現(xiàn)象[28]，說明這些旁系同源基因是特定物種分化后形成的基因重復(fù)事件。保守基序結(jié)果顯示，只有Aradu.UA9D8和Araip.WVH6X和釀酒酵母(NM_001183185)一樣，不含有Motif10，推測可能是由于花生基因組注釋不完善，沒有正確預(yù)測這兩個(gè)蛋白的C-端序列。

利用二代測序數(shù)據(jù)對AhPDAT家族基因進(jìn)行AS分析，發(fā)現(xiàn)約29.41%的基因存在AS現(xiàn)象，這與水稻中具有AS基因的比例基本一致，而擬南芥有61%的基因具有AS情況，這說明雖然可變剪接現(xiàn)象是普遍存在的，但不同物種中，以至于同一物種的不同基因家族之間的比例還是有很大差異的，原因可能是不同物種間基因結(jié)構(gòu)以及外界環(huán)境存在差異造成的[15-16,33]。AhPDAT不同剪接異構(gòu)體組織表達(dá)差異明顯，表明植物AS現(xiàn)象會因組織差異和外界環(huán)境不同而變化。例如水稻中的OsIM基因在正常條件下可以形成OsIM1和OsIM2兩個(gè)可變剪接體，在鹽脅迫下，耐鹽品種中OsIM1表達(dá)水平提升，而OsIM2的含量顯著下降，這些研究為我們今后進(jìn)一步探究AhPDAT不同剪接異構(gòu)體的功能分工提供了很好的思路[16]。