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醉魚草果實(shí)水部位化學(xué)成分及神經(jīng)保護(hù)活性研究

2019-01-14 07:23:45許雙旺吳德玲王桐生許鳳清陳簫簫
關(guān)鍵詞:硅膠存活率粉末

張 偉,許雙旺,吳德玲*,王桐生,許鳳清,2,3,陳簫簫

1安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院;2中藥飲片制造新技術(shù)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;3安徽省高??蒲袆?chuàng)新平臺(tái)團(tuán)隊(duì)—中藥飲片產(chǎn)地加工與炮制一體化關(guān)鍵技術(shù)研究創(chuàng)新團(tuán)隊(duì);4安徽道地中藥材品質(zhì)提升協(xié)同創(chuàng)新中心,合肥230012

醉魚草果實(shí)是馬錢科醉魚草屬植物醉魚草(BuddlejalindleyanaFort.)的果實(shí)。醉魚草為多年生小灌木,廣泛分布于長(zhǎng)江以南地區(qū),傳統(tǒng)認(rèn)為其具有祛風(fēng)除濕、行氣化痰、散瘀之功效[1]。近年來(lái)通過對(duì)醉魚草全草、果實(shí)的研究發(fā)現(xiàn),醉魚草(包括果實(shí))中主要含有黃酮類,三萜類,環(huán)烯醚萜苷類等成分,而且具有抗菌殺蟲、保肝、解痙、鎮(zhèn)靜、抗氧化、利尿等生物活性[2]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)其中的部分成分具有保護(hù)腦神經(jīng)細(xì)胞,避免其受MPP+所致的損傷作用,預(yù)示其在抗帕金森病藥物的研究中具有一定的應(yīng)用前景。本文主要對(duì)安徽歙縣產(chǎn)醉魚草(B.lindleyana)果實(shí)經(jīng)石油醚、乙酸乙酯等有機(jī)溶劑萃取后的水溶性部位進(jìn)行了化學(xué)成分研究,并采用MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞模型對(duì)部分化合物的神經(jīng)保護(hù)作用進(jìn)行了活性篩選研究。

1 材料與儀器

BruckerAM-400/600 MHz型超導(dǎo)核磁共振儀(Bruker,Bremerhaven,德國(guó))。中壓制備液相色譜儀(DrFlash-S系列,上海利穗科技有限公司,分離柱為SepaFlash預(yù)裝柱:DN50×500 mm,40×400 mm,40×250 mm);高壓制備液相色譜儀(Waters 2545,美國(guó)Waters公司);SephadexLH-20(50 μm,GE公司);反相材料RP-18(50 μm,Merck公司);YMC-PackODS-A,(250 mm×20 mm,5 μm,YieldMicroelectronicsCorp.);大孔樹脂(AB-8,天津光復(fù)精細(xì)化工研究所);柱色譜硅膠(200~300目,青島海洋化工廠);薄層色譜用硅膠板(G、GF254,青島海洋化工廠);Milli-Q超純水器(美國(guó)Millipore);甲醇、乙腈為色譜純(OCEANPAK);乙醇為食用酒精;水為蒸餾水;其它試劑均為分析純(天津市大茂化學(xué)試劑廠)。

胎牛血清(德國(guó)Serana公司);胰蛋白酶(美國(guó)Sigma公司);二甲基亞颯(DMSO,BestBio貝博);噻唑藍(lán)(MTT,美國(guó)Sigma);1-甲基-4-苯基吡啶離子(MPP+,Sigma公司);潔凈工作臺(tái)(SW-CJ-1F,蘇凈安泰);5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(371直熱式,Thermo公司,美國(guó));AIRTECH倒置顯微鏡(XSP-15CE,上海立光精密儀器有限公司)。

醉魚草果實(shí)采自安徽省歙縣,經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院劉守金教授鑒定為馬錢科醉魚草(BuddlejalindleyanaFort.)的果實(shí),原植物標(biāo)本(編號(hào):AZYZYC-SX-02)存放于安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥化學(xué)教研室;人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株(SH-SY5Y細(xì)胞)由中科院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所提供。

2 提取與分離

醉魚草果實(shí)(10 kg)粉碎成粗粉后,采用乙醇-水(95∶5,50∶50)依次滲漉提取,滲漉液合并后減壓濃縮至無(wú)醇味,加入水分散,依次加入石油醚、乙酸乙酯萃取,萃取后剩的水層離心后取上清液,蒸干得到C部位(3.5 kg)。將C部位水溶解后經(jīng)AB-8大孔樹脂(600×250 mm)吸附后,以乙醇-水梯度洗脫,得到0%、30%、60%和90%乙醇洗脫部位。取大孔樹脂30%乙醇-水洗脫部位504 g以聚酰胺柱色譜(600×200 mm)分離,乙醇-水(0∶100,30∶70,60∶40,95∶5)梯度洗脫,依次得到四個(gè)洗脫流份,分別為C2-1、C2-2、C2-3、C2-4。

取C2-2(34 g),經(jīng)硅膠柱色譜(250×100 mm)吸附,使用二氯甲烷-甲醇(95∶5,90∶10,85∶15,80∶20,75∶25,50∶50,0∶100)梯度洗脫,TLC檢識(shí)合并得到流份C2-2-1和C2-2-2。對(duì)C2-2-1流份反復(fù)使用Sephadex LH-20柱色譜及ODS反相柱色譜進(jìn)行細(xì)分、純化后,得化合物1(17 mg)。C2-2-2經(jīng)反復(fù)Sephadex LH-20柱色譜、ODS反相柱色譜(甲醇-水系統(tǒng))及高壓制備液相色譜(甲醇-水系統(tǒng))處理后,得化合物2(8 mg)和3(11 mg)。

取C2-1(367 g),經(jīng)硅膠柱色譜充分吸附后,使用二氯甲烷-甲醇系統(tǒng)梯度洗脫,各流份經(jīng)TLC檢識(shí)后合并,得到C2-1-1~C2-1-6共六個(gè)部分。C2-1-1經(jīng)反復(fù)硅膠柱色譜、Sephadex LH-20柱色譜、ODS反相柱色譜處理,得化合物4(17 mg),5(24 mg),6(19 mg)。C2-1-2經(jīng)反復(fù)Sephadex LH-20柱色譜、硅膠柱色譜、ODS反相柱色譜及高壓制備液相色譜處理,得化合物7(41 mg),8(10 mg)。C2-1-4借助中壓制備色譜,利用甲醇-水(10∶90,20∶80,30∶70,40∶60,50∶50,60∶40,100∶0)梯度洗脫,得到C2-1-4-1~C2-1-4-6共6個(gè)流份,其中C2-1-4-3經(jīng)反復(fù)ODS反相柱色譜及高壓制備液相色譜純化,得化合物9(6 mg)。C2-1-3經(jīng)MCI柱色譜處理后,以甲醇-水(10∶90,15∶85,20∶80,25∶75,30∶70,100∶0)梯度洗脫,得到C2-1-3-1和C2-1-3-2兩個(gè)部位,其中C2-1-3-1經(jīng)常壓ODS反相柱色譜和高壓制備液相色譜純化,得化合物10(8 mg)。

3 結(jié)構(gòu)解析

化合物1 白色粉末(甲醇);1H NMR(600 MHz,pyridine-d5)δH:5.63(1H,d,J=11.3 Hz,H-11),6.62(1H,dd,J=10.8,2.8 Hz,H-12),4.94(1H,d,J=7.9 Hz,H-1′),5.29(1H,d,J=8.0 Hz,H-1′′),5.60(1H,d,J=7.9 Hz,H-1′′′),5.79(1H,d,J=8.2 Hz,H-1′′′′);13C NMR(150 MHz,pyridine-d5)δ:38.6(C-1),26.1(C-2),82.6(C-3),43.8(C-4),47.7(C-5),18.6(C-6),32.5(C-7),40.5(C-8),54.8(C-9),36.5(C-10),126.4(C-11),125.9(C-12),136.3(C-13),42.5(C-14),33.0(C-15),24.7(C-16),40.6(C-17),135.7(C-18),38.3(C-19),32.5(C-20),35.5(C-21),29.2(C-22),64.6(C-23),12.8(C-24),18.5(C-25),17.3(C-26),20.8(C-27),63.1(C-28),24.6(C-29),35.4(C-30),104.2(C-1′),77.2(C-2′),84.6(C-3′),77.2(C-4′),70.5(C-5′),17.2(C-6′),105.0(C-1″),74.0(C-2″),76.4(C-3″),78.3(C-4″),77.6(C-5″),61.3(C-6″),104.0(C-1′′′),75.6(C-2′′′),78.8(C-3′′′),72.8(C-4′′′),72.2(C-5′′′),63.1(C-6′′′),102.8(C-1′′′′),72.6(C-2′′′′),72.1(C-3′′′′),76.3(C-4′′′′),70.4(C-5′′′′),18.7(C-6′′′′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[3]報(bào)道基本一致,故確定化合物1為密蒙花苷C(mimengoside C)。

化合物2 黃色粉末(甲醇);1H NMR(600 MHz,DMSO-d6)δ:7.44(1H,d,J=15.6 Hz,H-7′),7.03(1H,s,H-2′),6.94(1H,d,J=8.4 Hz,H-6′),6.73(1H,d,J=8.4 Hz,H-5′),6.59(1H,s,H-2),6.58(1H,s,H-5),6.45(1H,d,J=7.8 Hz,H-6),6.27(1H,d,J=15.6 Hz,H-8′),5.09(1H,s,Rha-H-1′′′),4.27(1H,d,J=8.4 Hz,Glc-H-1″),2.66(2H,m,H-7),1.08(3H,d,J=6.0 Hz,Rha-H-6′′′);13C NMR(150 MHz,DMSO-d6)δ:129.6(C-1),116.3(C-2),144.0(C-3),145.4(C-4),115.9(C-5),120.0(C-6),35.6(C-7),70.7(C-8),125.9(C-1′),115.3(C-2′),145.1(C-3′),148.8(C-4′),116.7(C-5′),121.9(C-6′),146.0(C-7′),114.3(C-8′),166.9(C=O),103.0(C-1″),74.5(C-2″),81.3(C-3″),68.9(C-4″),74.1(C-5″),63.9(C-6″),101.0(C-1′′′),71.0(C-2′′′),71.0(C-3′′′),72.5(C-4′′′),68.5(C-5′′′),18.3(C-6′′′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[4]報(bào)道一致,故鑒定化合物2為異毛蕊花糖苷(isoacteoside)。

化合物3 黃色粉末(甲醇);1H NMR(600 MHz,DMSO-d6)δ:7.44(1H,d,J=15.6 Hz,H-7′),7.01(1H,s,H-2′),6.96(1H,d,J=8.4 Hz,H-6′),6.75(1H,d,J=7.8 Hz,H-5′),6.61(1H,s,H-2),6.48(1H,d,J=7.8 Hz,H-6),6.18(1H,d,J=16.2 Hz,H-8′),5.02(1H,s,rha-H-1′′′),4.35(1H,d,J=7.8 Hz,glc-H-1″),2.68(2H,m,H-7),0.94(3H,d,J=6.0 Hz,rha-H-6′′′);13C NMR(150 MHz,DMSO-d6)δ:129.6(C-1),116.2(C-2),144.0(C-3),145.4(C-4),115.9(C-5),120.0(C-6),35.4(C-7),70.7(C-8),125.9(C-1′),115.1(C-2′),146.0(C-3′),140(C-4′),116.7(C-5′),121.9(C-6′),148.9(C-7′),114.0(C-8′),166.1(C=O),102.7(C-1″),74.9(C-2″),79.5(C-3″),69.6(C-4″),74.9(C-5″),61.2(C-6″),101.7(C-1′′′),70.8(C-2′′′),71.0(C-3′′′),72.1(C-4′′′),69.2(C-5′′′),18.6(C-6′′′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[5]報(bào)道一致,故鑒定化合物3為毛蕊花糖苷(acteoside)。

化合物4 白色粉末(甲醇);1H NMR(600 MHz,DMSO-d6)δ:7.43(1H,s,H-6),7.41(1H,s,H-2),6.96(1H,d,J=8.4 Hz,H-2′,6′),6.82(1H,d,J=7.8 Hz,H-5),6.63(1H,d,J=8.4 Hz,H-3′,5′),3.78(3H,s,H-OCH3),3.50(2H,t,H-7′),2.55(2H,t,H-8′);13C NMR(150 MHz,DMSO-d6)δ:122.1(C-1),113.1(C-2),147.6(C-3),151.5(C-4),115.4(C-5),123.9(C-6),167.7(C-7),56.0(3-OCH3),130.09(C-1′),129.9(C-2′),115.4(C-3′),155.9(C-4′),115.4(C-5′),129.9(C-6′),63.0(C-7′),39.7(C-8′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[6]報(bào)道一致,故鑒定化合物4為4′-hydroxyphenyl ethyl vanillate。

化合物5 白色粉末(甲醇);1H NMR(400 MHz,CD3OD)δ:7.59(2H,m,H-2′,6′),6.83(1H,d,J=8.8 Hz,H-5′),6.24(1H,brd,J=6.4 Hz,H-3),5.53(1H,d,J=1.6 Hz,H-1),5.02(2H,m,H-4,6),4.68(1H,d,J=8.0 Hz,H-1-glc),3.90(3H,s,-OCH3),3.00(1H,brd,J=8.8 Hz,H-5),2.62(1H,brd,J=14.4 Hz,H-9),2.29(1H,dd,J=14.0,6.0 Hz,H-7-a),2.06(1H,dd,J=14.0,3.6 Hz,H-7-b),1.42(3H,s,H-10);13C NMR(100 MHz,CD3OD)δ:93.5(C-1),141.2(C-3),104.7(C-4),39.6(C-5),80.8(C-6),47.9(C-7),79.3(C-8),51.8(C-9),26.3(C-10),125.3(C-1′),113.8(C-2′),148.8(C-3′),153.1(C-4′),116.0(C-5′),122.9(C-6′),168.0(C=O),56.5(3′-OCH3),99.5(C-1′′),74.9(C-2′′),78.1(C-3′′),71.8(C-4′′),78.3(C-5′′),63.0(C-6′′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[7]報(bào)道基本一致,確定化合物5為6-O-香草酰筋骨草苷(6-O-vanilloylajugol)。

化合物6 白色粉末(甲醇);1H NMR(400 MHz,CD3OD)δ:6.72(2H,s,H-2,6),6.66(2H,s,H-2′,6′),4.87(1H,d,J=7.6 Hz,H-1′′),4.77(1H,d,J=3.6 Hz,H-7),4.72(1H,d,J=3.6 Hz,H-7′),4.29(2H,m,H-9β,9′β),3.92(2H,m,H-9α,9′α),3.86(6H,s,3′,5′-OCH3),3.85(6H,s,3,5-OCH3),3.14(2H,brs,H-8,8′);13C NMR(100 MHz,CD3OD)δ:133.2(C-1),104.6(C-2,6),149.4(C-3,5),136.3(C-4),87.3(C-7),55.6(C-8),72.9(C-9),135.7(C-1′),104.9(C-2′,6′),139.6(C-4′),154.5(C-3′,5′),87.7(C-7′),55.8(C-8′),73.0(C-9′),57.2(-OCH3×2,OCH3-3,5),56.9(-OCH3×2,OCH3-3′,5′),105.4(C-1′′),75.8(C-2′′),77.9(C-3′′),71.4(C-4′′),78.4(C-5′′),62.7(C-6′′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[8]報(bào)道基本一致,故確定化合物6為syringaresinol-4′-O-β-D-glucopyranoside。

化合物7 白色粉末(甲醇);1H NMR(600 MHz,CD3OD)δ:6.75(2H,s,H-2,6),6.54(1H,d,J=15.6 Hz,H-7),6.33(1H,dt,J=16.2,5.4 Hz,H-8),4.22(2H,d,J=5.4Hz,H-9),3.85(6H,s,-OCH3),4.87(1H,d,J=7.8 Hz,H-1′);13C NMR(150 MHz,CD3OD)δ:130.1(C-1),105.5(C-2,6),154.4(C-3,5),136.0(C-4),135.3(C-7),131.4(C-8),63.7(C-9),57.1(-OCH3×2,OCH3-3′,5′),105.4(C-1′),75.8(C-2′),78.5(C-3′),71.4(C-4′),77.9(C-5′),62.7(C-6′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[9,10]基本一致,故確定化合物7為刺五加苷B(eleutheroside B)。

化合物8 白色粉末(甲醇);1H NMR(600 MHz,CD3OD)δ:7.10(1H,d,J=8.4 Hz,H-5),7.07(1H,d,J=1.8 Hz,H-2),6.95(1H,dd,J=8.4,1.2 Hz,H-6),6.54(1H,d,J=16.2 Hz,H-7),6.28(1H,dt,J=15.6,6.0 Hz,H-8),4.21(2H,d,J=6.0 Hz,H-9),3.87(3H,s,-OCH3);13C NMR(150 MHz,CD3OD)δ:133.7(C-1),111.4(C-2),151.0(C-3),147.7(C-4),118.0(C-5),120.8(C-6),131.4(C-7),129.0(C-8),63.8(C-9),56.8(3-OCH3),102.8(C-1′),74.9(C-2′),77.9(C-3′),71.4(C-4′),78.3(C-5′),62.6(C-6′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]報(bào)道基本一致,確定化合物8為松柏苷(coniferin)。

化合物9 白色粉末(甲醇);1H NMR(600 MHz,CD3OD)δ:5.60(1H,d,J=10.2 Hz,H-11),6.42(1H,dd,J=10.8,3.0 Hz,H-12);13C NMR(150 MHz,CD3OD)δ:39.0(C-1),26.5(C-2),84.5(C-3),41.5(C-4),50.0(C-5),19.0(C-6),32.3(C-7),41.3(C-8),55.8(C-9),37.4(C-10),127.4(C-11),126.6(C-12),135.3(C-13),43.6(C-14),33.1(C-15),78.1(C-16),44.5(C-17),135.3(C-18),33.7(C-19),30.5(C-20),30.5(C-21),29.7(C-22),63.8(C-23),12.8(C-24),17.0(C-25),17.4(C-26),20.3(C-27),63.7(C-28),24.3(C-29),26.6(C-30),103.6(C-1′),76.4(C-2′),85.7(C-3′),72.5(C-4′),71.3(C-5′),21.0(C-6′),104.9(C-1″),76.1(C-2″),78.4(C-3″),71.5(C-4″),78.3(C-5″),62.5(C-6″),105.5(C-1′′′),75.4(C-2′′′),78.4(C-3′′′),72.8(C-4′′′),74.1(C-5′′′),63.1(C-6′′′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]報(bào)道基本一致,故確定化合物9為醉魚草皂苷Ⅳb(buddlejasaponin Ⅳb)。

化合物10 白色粉末(甲醇);1H NMR(600 MHz,DMSO-d6)δ:10.00(1H,s,H-4′′′),7.56(1H,d,J=15.6 Hz,H-β),7.53(2H,d,J=8.4Hz,H-2′′′,6′′′),6.78(2H,d,J=8.4 Hz,H-3′′′,C-5′′′),6.41(1H,dd,J=6.0,1.2Hz,H-3),6.38(1H,d,J=15.6 Hz,H-α),5.25(1H,d,J=4.8Hz,H-1),5.10(1H,d,J=4.2 Hz,H-1′′),5.05(1H,d,J=6.6 Hz,H-4),4.58(1H,d,J=7.8 Hz,H-1′),1.17(3H,d,J=6.0 Hz,H-6′′);13C NMR(150 MHz,DMSO-d6)δ:93.1(C-1),141.0(C-3),102.4(C-4),35.6(C-5),81.7(C-6),57.5(C-7),65.4(C-8),41.9(C-9),58.8(C-10),97.9(C-1′),74.0(C-2′),77.5(C-3′),70.3(C-4′),76.4(C-5′),61.4(C-6′),98.8(C-1′′),68.2(C-2′′),73.5(C-3′′),69.1(C-4′′),68.9(C-5′′),17.9(C-6′′),125.2(C-1′′′),130.3(C-2′′′),115.9(C-3′′′),159.8(C-4′′′),115.9(C-5′′′),130.3(C-6′′′),114.2(C-α),144.6(C-β),166.4(C=O)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]報(bào)道基本一致,故確定化合物10為6-O-(3″-O-p-coumaroyl-α-L-rhamnopyranosyl)catalpol。

4 化合物活性的篩選

將SH-SY5Y細(xì)胞在37 ℃、5% CO2及飽和濕度環(huán)境下培養(yǎng)與DMEM培養(yǎng)基(另加胎牛血清、青霉素、鏈霉素、胰蛋白酶),待細(xì)胞增殖至約80%時(shí)鋪板,培養(yǎng)細(xì)胞按每孔100 μL的密度種植于96孔培養(yǎng)板中。細(xì)胞于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,將各個(gè)樣品配制成4個(gè)濃度梯度(31、62、125、250 μmol/L)加到96孔培養(yǎng)板中,每個(gè)濃度梯度設(shè)6個(gè)復(fù)孔,并設(shè)置空白孔(等體積PBS)、正???不含血清的完全培養(yǎng)基)、模型孔(不含血清的完全培養(yǎng)基加入1 mmol/L的MPP+),作用1 h后加入1 mmol/L MPP+,繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,于每孔中加入20 μL的MTT(5 mg/mL),繼續(xù)培養(yǎng)4 h,吸出孔內(nèi)的培養(yǎng)液,在每孔加入150 μL的DMSO,低速振蕩10 min,酶標(biāo)儀570 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度(A)值,并計(jì)算細(xì)胞存活率。

注:與模型組比較:*P<0.05,**P<0.01。

Note:Compared with the model group:*P<0.05,**P<0.01.

通過MTT法對(duì)部分化合物給藥的細(xì)胞存活率進(jìn)行測(cè)定,與模型組相比較(見表1),所選的4個(gè)化合物對(duì)MPP+損傷的SH-SY5Y細(xì)胞均具有一定的保護(hù)作用。其中化合物1和5給藥的細(xì)胞存活率隨著給藥濃度的增大而增大;化合物6和7給藥的細(xì)胞存活率先隨著給藥濃度的增高而增大,藥物濃度達(dá)到一定濃度后,細(xì)胞存活率達(dá)到最大,進(jìn)一步增大給藥濃度,細(xì)胞存活率會(huì)有所下降。

5 結(jié)論

本研究從醉魚草果實(shí)水部位分離純化得到密蒙花苷C(1)、異毛蕊花糖苷(2)、毛蕊花糖苷(3)、4′-hydroxyphenyl ethyl vanillate(4)、6-O-香草酰筋骨草苷(5)、syringaresinol-4′-O-β-D-glucopyranoside(6)、刺五加苷B(7)、松柏苷(8)、醉魚草皂苷Ⅳb(9)、6-O-(3"-O-p-coumaroyl-α-L-rhamnopyranosyl)catalpol(10)等10個(gè)化合物,其中化合物4、6、7、8和10為首次從醉魚草屬植物中分離得到,化合物2和3為首次從醉魚草果實(shí)中分離得到;利用MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞模型對(duì)化合物1、5、6和7的神經(jīng)保護(hù)作用進(jìn)行考察,結(jié)果顯示四個(gè)化合物均能使細(xì)胞存活率顯著提高。本研究進(jìn)一步豐富了醉魚草果實(shí)中化學(xué)成分類型,為更好的開發(fā)利用醉魚草資源提供參考。

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