毛常麗，張鳳良，李小琴，楊 湉，倪書邦，吳 裕

（云南省熱帶作物科學(xué)研究所，云南景洪666100）

單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）主要是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。SNP技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于基因分型、分子系統(tǒng)學(xué)和譜系地理學(xué)的研究，其能真實的反映基因組DNA上的遺傳信息，進而比較全面地揭示基因組的復(fù)雜性和多樣性，因此在生命科學(xué)研究中扮演了十分重要的角色。

橡膠樹的規(guī)?；N植和天然橡膠生產(chǎn)已取得了長足的發(fā)展，橡膠樹種質(zhì)資源的收集、保存和研究成為天然橡膠生產(chǎn)國的重要任務(wù)。在橡膠樹研究中，現(xiàn)已克隆得到與橡膠合成有關(guān)的蛋白和酶基因，如HMG-CoA還原酶基因、FPS基因、REF 基因、SRPP 基因等。W.Pootakham［1］等 用高通量454測序儀對橡膠樹的5883個假定位點進行測序，最終得到10條較好的SNP標記（已在NCBI登記），但如何用這些標記對橡膠樹種質(zhì)資源進行評價還未見報道。本研究以NCBI報道的橡膠樹HbCBF1、HbSNP12基因序列為基礎(chǔ)設(shè)計特異引物，利用PCR及測序技術(shù)，選擇抗寒性較強和較弱的兩組橡膠樹為材料，對其在抗性相對的兩組材料中的堿基差異進行分析，為選擇適用于橡膠樹種質(zhì)資源評價的SNP標記引物奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

實驗用的橡膠樹葉片采自于農(nóng)業(yè)部景洪橡膠樹種質(zhì)資源圃。將抗寒性強和抗寒性弱的兩組橡膠樹變色期葉片采集后于變色硅膠干燥保存。本研究的實驗材料信息見表1。

表1 用于擴增HbSNP12、HbCBF1基因的橡膠樹種質(zhì)資源信息

1.2 方法

選擇NCBI中已經(jīng)登記的橡膠樹HbCBF1（GI:66269670）及HbSNP12（GI:363901081）基因序列，用Primer Premier 5.0設(shè)計特異引物。用Trizol法提取材料RNA后進行反轉(zhuǎn)錄，得到DNA第一鏈，再對所選材料的HbCBF1及HbSNP12兩基因進行PCR擴增及測序后，用ClustalW軟件比對兩組實驗材料得到的堿基序列差異性，如有差異，將堿基序列翻譯為氨基酸序列，探明是否在氨基酸序列上存在差異。

1.2.1 引物設(shè)計

PCR引物根據(jù)在NCBI中已經(jīng)有報道的橡膠樹HbCBF1、HbSNP12基因序列的保守區(qū)域設(shè)計，引物設(shè)計軟件為Primer Premier 5.0。設(shè)計的特異引物如下:

HbCBF1基因上游引物:ATGGATGTTTTCYCTCAMTWYCTG；下游引物:TYATATWGAAAARCTCCAKAAWGACA（700 bp）。

HbSNP12基因上游引物:GTTGATCCTGAAGGAAAGGGC；下游引物:CAACACCCTGTCAACCAAGTTG （756 bp）。

1.2.2 RNA提取、cDNA第一鏈合成及PCR反應(yīng)

采 用 Trizol法 提 取 RNA。 用 TaKa-Ra RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以cDNA為模板進行PCR擴增，擴增體系為 25 mL:10×Dream Taq Buffer 2 μL，dNTP（25 mM）0.5 μL，dNTP Mixture（各2.5 mM）2.5 μL，上游引物（10 μM）1 μL，下游引物（10 μM）1 μL，TaKaRa Taq（5 U/μL）0.2 μL，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 1 μL，滅 菌 蒸 餾 水 16.8 μL，PCR 程 序:94℃ ，預(yù) 變 性5 min；94℃ 變 性 30 s，57℃ 退 火 30 s，72℃ 延 伸45 s，32個循環(huán)；72℃延伸 7 min。PCR 產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.3 PCR產(chǎn)物的純化

將上述PCR產(chǎn)物中700 bp左右的條帶割膠，使用北京百泰克生物技術(shù)公司生產(chǎn)的凝膠回收試劑盒過柱回收?；厥粘绦蛞罁?jù)試劑盒提供方法進行。

1.2.4 測序及序列分析

將純化好的產(chǎn)物送上海生工生物技術(shù)公司進行測序后，在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行BLAST搜索，確定所測的序列為HbCBF1、HbSNP12基因。序列采用DNAStar、ClustalW等軟件進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA提取效果

用Trizol法提取以上材料的RNA。提取RNA后，1.5%瓊脂糖，1×TAE電泳緩沖液，紫外透射光下觀察并拍照，效果如圖1。

2.2 PCR結(jié)果

將所有材料RNA反轉(zhuǎn)錄后用所設(shè)計的兩對引物進行PCR擴增，擴增后的瓊脂糖電泳效果如圖2。從圖中可以看出，在700 bp左右有一條很亮的條帶，將該條帶純化后進行測序，所測得的序列Blast比對后，確定為HbSNP12、HbCBF1兩基因序列。

2.3 橡 膠 樹 HbCBF1、Hb-SNP12基因序列測序結(jié)果

將純化后的產(chǎn)物進行測序，并對序列進行分析，得到Hb-SNP12及HbCBF1基因序列長度分別為700 bp、756 bp。

HbSNP12基因在抗寒性差異較大的10份橡膠樹種質(zhì)中，抗寒性相差較大的兩組材料在105 bp、538 bp處分別為A/T及A/C間的顛換，將堿基序列轉(zhuǎn)換為氨基酸序列后進行比對，得到同樣的結(jié)果，即在35位氨基酸處抗寒性強的種質(zhì)為組氨酸，抗寒性弱的種質(zhì)為谷氨酰胺，180位氨基酸處抗寒性強的種質(zhì)為蘇氨酸，抗寒性弱的種質(zhì)為脯氨酸。

HbCBF1基因在抗寒性差異較大的10份橡膠樹種質(zhì)中，抗寒性相差較大的兩組材料在92 bp、387 bp處分別為A/C間的顛換及A/G間的轉(zhuǎn)換，將堿基序列轉(zhuǎn)換為氨基酸序列后進行比對，得到結(jié)果為:在31位氨基酸處抗寒性強的種質(zhì)為蘇氨酸，抗寒性弱的種質(zhì)為天冬氨酸，在129位氨基酸處抗寒性強的種質(zhì)為丙氨酸，抗寒性弱的種質(zhì)為甘氨酸。

3 討論

我國推廣種植的橡膠樹遺傳基礎(chǔ)狹窄，即使是在表型上存在差異，但其遺傳變異依然很?。?］。一直以來，橡膠樹育種工作者致力于提高橡膠樹的抗寒性，以擴大橡膠樹種植面積，但多集中在傳統(tǒng)的新品種選育及區(qū)域性試種上，用分子生物學(xué)手段開展抗寒性選擇的很少。程漢等克隆了橡膠樹抗寒性相關(guān)的基因—HbCBF1基因［3］，為橡膠樹抗寒性的分子篩選奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)于CBF1基因，在山葡萄中已經(jīng)克隆并對其功能進行了分析，證實與抗寒性相關(guān)［4］，將茶樹中的CBF1基因克隆到煙草中，證實其與抗寒性相關(guān)［5］；NCBI中報道了橡膠樹HbSNP12基因，該基因經(jīng)BLAST后，和甜橙、蓖麻、白楊的S-腺苷甲硫氨酸脫酸酶基因（SAMC）的序列一致度達到100%，在小麥水分脅迫［6］、抗旱節(jié)水［7］，甘蔗抗寒、抗旱［8］，棉花抗寒性［9］等多種生物代謝中均有研究，其在生物體所有細胞的代謝中均起重要作用，參與了體內(nèi)100多種不同的甲基轉(zhuǎn)移酶催化反應(yīng)。從本研究結(jié)果可以看出，雖然選擇的實驗材料為抗性相差較大的種質(zhì)，但是測得的堿基變異很小，只存在兩個堿基的差異，將堿基序列翻譯成氨基酸序列進行比對，同樣得到的是抗性相差大的種質(zhì)，其氨基酸發(fā)生了變化，該結(jié)果為橡膠樹的SNP標記篩選提供依據(jù)，為橡膠樹抗寒性的早期篩選奠定基礎(chǔ)。

本研究發(fā)現(xiàn)，在橡膠樹中存在少量的多態(tài)性位點，而且在參試的兩組有抗性差異種質(zhì)中存在差異，但這種差異是否是引起表型變異的真正原因，還需要后續(xù)實驗進行驗證。