董曉春

H7N9禽流感自2013年在中國(guó)華東地區(qū)被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，已經(jīng)在人群中出現(xiàn)了5次疫情：其中從疫情開始到第5次疫情結(jié)束，全球共報(bào)告人感染H7N9禽流感實(shí)驗(yàn)室確診病例1 567 例［1］。其中從2016 年10月—2017年9月的第5次疫情報(bào)告的感染人數(shù)和死亡人數(shù)均遠(yuǎn)超過(guò)前4 波疫情，引起了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注［2］。特別是從第5 次疫情的患者中分離到了高致病性的H7N9禽流感病毒（HPAI H7N9），鑒于既往人感染H7N9 禽流感后的嚴(yán)重程度，HPAI H7N9禽流感病毒的出現(xiàn)可能會(huì)造成更大的危害［3］。近期多國(guó)的學(xué)者也對(duì)HPAI H7N9 禽流感的流行病學(xué)、分子生物學(xué)等方面進(jìn)行了廣泛的研究。本文綜合相關(guān)研究對(duì)HPAI H7N9 禽流感病毒各方面生物學(xué)研究進(jìn)展做一綜述。

1 H7N9禽流感病毒的進(jìn)化

1.1 基本特征 在中國(guó)首次發(fā)現(xiàn)的新的H7N9禽流感病毒屬于正黏病毒科甲型流感病毒屬。甲型流感病毒根據(jù)其表面糖蛋白血凝素（haemagglutinin，HA）和神經(jīng)氨酸酶（neuraminidase，NA）抗原性的不同可分為多個(gè)亞型，H7N9屬于其中一個(gè)亞型。根據(jù)基因測(cè)序結(jié)果，2013年新出現(xiàn)的H7N9禽流感病毒HA基因與浙江鴨群的H7N3 亞型（A/duck/Zhejiang/12/2011）高度同源，NA 基因與韓國(guó)水鳥中的H7N9（A/wild bird/Korea/ A14/2011）同源，內(nèi)部的6 個(gè)基因（PB2、PB1、PA、NP、M、NS）分別來(lái)自中國(guó)東南部（上海、浙江）的家禽以及北京地區(qū)的禽鳥的兩種H9N2亞型［4］。

由于人類上呼吸道組織和氣管主要含有唾液酸α-2，6 型受體，α-2，3 型受體多見于禽類呼吸道表面。而禽流感病毒通常與禽類的唾液酸α-2，3受體結(jié)合。2013 年新發(fā)現(xiàn)的H7N9 禽流感病毒的HA 基因在G186V、Q226L 和T160A 等位點(diǎn)發(fā)生氨基酸替換，這些突變使其可以同時(shí)結(jié)合人類的唾液酸α-2，6受體和禽類的α-2，3受體，從而獲得了感染人類的能力［5-6］。禽流感病毒是根據(jù)其對(duì)禽類致病性的強(qiáng)弱可分為高致病性和低致病性，由于2013年出現(xiàn)的H7N9 禽流感病毒對(duì)禽類來(lái)說(shuō)致病比較溫和，且在HA蛋白的裂解位點(diǎn)周圍只存在單個(gè)堿性氨基酸，未觀察到與高致病性禽流感相似的氨基酸序列，因此被認(rèn)定為低致病性的禽流感病毒［7］。

1.2 病毒進(jìn)化與高致病性演變 中國(guó)低致病性H7N9 禽流感病毒分離株的核酸序列分析表明病毒可分為長(zhǎng)三角分支及珠三角分支兩種體系株，長(zhǎng)江三角洲地區(qū)被認(rèn)為是2013年開始出現(xiàn)的H7N9禽流感疫情的源頭［8］。同年8 月廣東分離的1 株病毒株（A/Guangdong/1/2013）與之前測(cè)序的長(zhǎng)三角H7N9病毒株相比，其NS和NP基因與當(dāng)?shù)亓餍械腍9N2亞型禽流感病毒更為接近，被稱為珠三角分支。后者系從前者進(jìn)化而來(lái)，兩者在傳播力和致病性上無(wú)明顯區(qū)別［9］。第2、3次疫情（2013年10月—2015年9月）以長(zhǎng)三角和珠三角為源頭向其他地區(qū)輻射，從華東逐漸向華南地區(qū)轉(zhuǎn)移，在此過(guò)程中產(chǎn)生了重組H7N9病毒，新的H7N9 變異體含有內(nèi)部基因片段PB1、PB2、NP和NS與當(dāng)?shù)厍蓊愌h(huán)H9N2菌株密切相關(guān)。而新的變異也引起了H7N9 禽流感病毒在抗原性、耐藥性方面出現(xiàn)一些變化［10］。與前3次疫情中分離的病毒相比，第4 次疫情中分離到的H7N9 毒株在HA 和NA 基因中的突變較少，在病毒聚合酶基因中鑒定出哺乳動(dòng)物適應(yīng)的遺傳標(biāo)記的頻率與前3次疫情保持一致［11］。

從第5 次疫情開始到2016 年12 月分離的病毒株的基因特征與前4 次疫情中分離的病毒相似，屬于低致病性禽流感病毒（LPAI H7N9），直到2017 年廣東省疾病預(yù)防控制中心對(duì)分離到的毒株A/Guangdong/Th008/2017 和A/Guangdong/Th005/2017進(jìn)行了基因測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)在該2株病毒的HA鏈接肽位置發(fā)生了基因插入性突變，HA蛋白水解切割位點(diǎn)HA1 和HA2 連接區(qū)域獲得4 個(gè)氨基酸（KRTA）的插入突變，此類基因引起病毒對(duì)家禽毒力的增強(qiáng)，提示經(jīng)過(guò)4 年的進(jìn)化和突變，中國(guó)已出現(xiàn)HPAI H7N9禽流感病毒［12］。Xiang 等［13］從第5 次疫情中共發(fā)現(xiàn)有69 個(gè)HA 基因插入4 種類型的HPAI 序列，分別是-PKGKRIAR/GLF-、-PKGKRTAR/GLF-、-PKRKRAAR/GLF-、-PKRKRTAR/GLF-。這些HPAI H7N9病毒的HA序列在核苷酸水平上比LPAI具有較高的遺傳同源性。同時(shí)，HPAI和LPAI H7N9病毒的NA 和6 個(gè)內(nèi)部基因在核苷酸水平上表現(xiàn)出相似性。

2 高致病性H7N9禽流感病毒

2.1 HPAI H7N9 病例流行病學(xué)特征 截至2018 年8 月，全球共報(bào)告32 例人感染HPAI H7N9 病例，這32例病例來(lái)自我國(guó)臺(tái)灣地區(qū)（該病例曾前往廣東）、廣西、廣東、湖南、陜西、河北、河南、福建、云南省，其中廣西壯族自治區(qū)報(bào)告的病例最多，其次為廣東省。所有病例發(fā)病日期均在2017 年10 月之前［14］。Zhou等［15］對(duì)廣西、湖南、廣東的8例HPAI H7N9病例臨床特征分析發(fā)現(xiàn)，8例患者中位年齡57歲（28～71歲），男4例（50%）；大多數(shù)（75%）病例患者生活在農(nóng)村地區(qū)，并且在發(fā)病10 d 內(nèi)全部接觸家禽。8 例患者發(fā)病到入院時(shí)間為2.5 d（0～5 d），均接受奧司他韋治療，發(fā)病到用藥為4 d（1～8 d）。4例患者發(fā)病后平均6.5 d（5～44 d）死亡，4 例痊愈，平均住院29 d（21～52 d）。與LPAI 病例特征比較發(fā)現(xiàn)，HPAI 患者更多生活在農(nóng)村地區(qū)（88%vs.47%），發(fā)病前曾接觸病禽或死禽（50%vs.16%），發(fā)病到住院時(shí)間較短（2.5 dvs.5 d）。在年齡、性別、基礎(chǔ)慢性病患病率、發(fā)病至抗病毒治療的中位時(shí)間、接受奧司他韋治療、重癥監(jiān)護(hù)病房入院或機(jī)械通氣的患者比例方面無(wú)顯著性差異。盡管HPAI 患者從發(fā)病到死亡的中位時(shí)間較LPAI 患者短（6.5 dvs.13 d），總體病例死亡率高于LPAI患者（50%vs.37%），但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。廣東省對(duì)本省的9 例HPAI H7N9 病例與LPAI 病例特征做了比較，兩者在性別、年齡、臨床表現(xiàn)方面并無(wú)差異，兩者活禽市場(chǎng)接觸史的比例也基本相似。但HPAI 病例接觸活禽或死禽的比例均高于LPAI 病例，HPAI 病例在后院飼養(yǎng)家禽比例明顯高于LPAI病例（77.8%vs.29.4%）。同時(shí)HPAI 患者從入院到出院的時(shí)間較LPAI患者顯著延長(zhǎng)。在死亡患者中，更多的HPAI 患者從住院到死亡的持續(xù)時(shí)間大于21 d（HPAI：3/5；LPAI：2/22）［16］。

2.2 變異來(lái)源 為追溯HPAI H7N9共同的起源，中國(guó)的學(xué)者對(duì)25株人感染的HPAI H7N9與14株禽源HPAI H7N9 病毒做了全基因測(cè)序；結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有的HPAI H7N9 病毒都可以歸類為單個(gè)基因簇，被稱為HPAI H7N9 簇。而HPAI H7N9 簇完全歸類為長(zhǎng)江三角洲譜系。通過(guò)共祖時(shí)間（TMRCA）分析發(fā)現(xiàn)，HPAI H7N9 的H7 基因來(lái)源時(shí)間估計(jì)為2016 年5 月下旬。所有的禽和人的HPAI H7N9 病毒分離株均來(lái)源于廣東省分離的LPAI H7N9病毒。廣東省可能是LPAI H7N9 病毒獲得4 個(gè)氨基酸插入并突變?yōu)镠PAI H7N9病毒的關(guān)鍵地區(qū)。HPAI H7N9譜系中觀察到的幾個(gè)亞群，包括來(lái)自廣西、湖南、陜西和內(nèi)蒙古等地區(qū)的HPAI H7N9病毒均被歸類為廣東亞群，表明該亞群的HPAI H7N9病毒可能來(lái)源于廣東省，隨后傳播到其他地區(qū)［17］。Su 等［18］對(duì)全球共享禽流感數(shù)據(jù)倡議組織（GISAID）的數(shù)據(jù)庫(kù)和核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)（Genbank）中第5 次疫情中出現(xiàn)的HAPI H7N9病毒序列分析，同樣發(fā)現(xiàn)所有的HPAI H7N9序列均來(lái)自珠江三角洲地區(qū)，表明這個(gè)地區(qū)最有可能是這種病毒的來(lái)源。我國(guó)臺(tái)灣地區(qū)分離的A/Taiwan/1/2017（H7N9）的HA 和NA 基因與大陸地區(qū)分離的病毒同屬于長(zhǎng)三角分支。它的6個(gè)內(nèi)部基因中，PB1和M 基因與A/Anhui/1/2013 疫苗株及2016、2017 年新近從江蘇省、浙江省、福建省和廣東省分離的病毒位于同一個(gè)分支，聚類分析則顯示其PB2、PA 和NS 基因與早期的H7N9 亞型歸為一類，與2016—2017 年新近的病毒無(wú)關(guān)［19］。

2.3 突變情況 對(duì)廣東HPAI H7N9 分離株A/Guangdong/17SF003/2016 和A/Guangdong/17SF006/2017 測(cè)序發(fā)現(xiàn)，HA 蛋白的226L 變回為226Q，這一突變與LPAI H7N9的Q226L突變相反。既往研究證明Q226L突變可提高病毒對(duì)哺乳動(dòng)物唾液酸受體的結(jié)合能力［20］。2 株HPAI H7N9 病毒與典型的LPAI H7N9病毒相比，除具有雙重受體α-2，6和α-2，3結(jié)合特性以外與α-2，3 受體的親和力明顯增加。與LPAI H7N9 病毒不同，HPAI H7N9 病毒在胰蛋白酶存在或不存在時(shí)具有相似的復(fù)制能力，表明其胰蛋白酶獨(dú)立特性［21］。從臺(tái)灣毒株的分析結(jié)果看，HA中未發(fā)現(xiàn)Q226L/I 和G228S 這2 個(gè)與人類受體高親和力結(jié)合的突變，但有S138A、T160A 和G186V 共3 個(gè)突變，與病毒與人類受體的結(jié)合能力有關(guān)；PB2蛋白中有E627K 的替換，與病毒的復(fù)制能力增加有關(guān)；PB1-F2 蛋白有90 個(gè)氨基酸，NS1 蛋白中存在P42S和D92E的替換，都可能使H7N9對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的毒力增強(qiáng)［19］。另外，Yang 等［17］同時(shí)對(duì)28 株人感染HPAI H7N9分離株與21株禽源HPAI H7N9分離株做基因測(cè)序，結(jié)果顯示所有21 株禽源毒株和25/28 株人源毒株分別發(fā)生G186V 和L226Q 的替換，L226Q 替換雖減弱了病毒與哺乳動(dòng)物唾液受體的結(jié)合能力，但研究發(fā)現(xiàn)HA蛋白中G186V單獨(dú)存在也可增加病毒與受體的親和力［6］。在28 株人源毒株的PB2 蛋白中，分別出現(xiàn)T271A、Q591K替換各1株，E627K替換14株，D701N替換4株，這些置換與小鼠聚合酶活性增加或毒力增強(qiáng)有關(guān)。但在禽源HPAI H7N9 中未檢測(cè)到這樣的突變。而此類突變通常在禽流感病毒傳播到哺乳動(dòng)物宿主時(shí)常被觀察到［22-23］。

2.4 抗原性分析 為了研究HPAI 和LPAI H7N9病毒之間的抗原性差異，Zhu 等［21］使用雪貂抗血清對(duì)A/anhui/1/2013（野生型）、A/anhui/1/2013（反向遺傳株）和A/shanghai/2/2013（野生型）進(jìn)行雪貂抗血清測(cè)定?？乖治霰砻?，除A/hunan／06948／2017 和A/anhui/60933/2016之外，所有的LPAI H7N9病毒與H7N9疫苗株A/anhui/1/2013（野生型或反向遺傳株）或A/shanghai/2/2013 的雪貂抗血清反應(yīng)良好。然而，HPAI H7N9（A/Guangdong/17SF003/2016 和A/Guangdong/17SF006/2017）對(duì)LPAI H7N9疫苗株的抗血清表現(xiàn)出低或無(wú)反應(yīng)性。

2.5 對(duì)動(dòng)物的致病力 聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織統(tǒng)計(jì)，截至2018年9月5日，全球共從動(dòng)物或外環(huán)境中檢出58 株HPAI H7N9，其中46 株來(lái)自雞、2 株來(lái)自鴨、10株來(lái)自環(huán)境標(biāo)本［24］。HPAI H7N9的致病性方面，中、美、日三國(guó)聯(lián)合研究發(fā)現(xiàn)，以HPAI H7N9 毒株A/Guangdong/17SF003/2016（GD/3）為研究材料，分析其在不同小鼠、雪貂和食蟹猴等動(dòng)物模型上的致病力和傳播力，以GD/3 為骨架，構(gòu)建了2 株攜帶NA R294K 耐藥性突變的重組病毒，分別命名為rGD/3-NA294R 和GD/3-NA294K，以及LPAI H7N9（A/anhui/1/2013），與其他兩株病毒相比，HPAI H7N9（GD/3）和藥物敏感毒株（rGD/3-NA294R）對(duì)小鼠和雪貂的致病力更強(qiáng)，4 株病毒在雪貂動(dòng)物模型上通過(guò)空氣飛沫傳播的能力差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示HPAI H7N9 病毒相對(duì)于LPAI H7N9 病毒來(lái)說(shuō)，傳播力沒(méi)有改變。耐藥毒株（rGD/3-NA294K）在細(xì)胞和動(dòng)物組織的復(fù)制能力要低于對(duì)應(yīng)的敏感病毒［25］。Shi 等［26］發(fā)現(xiàn)分離得到的HPAI H7N9 在48 h 內(nèi)使雞100%死亡，靜脈致死系數(shù)為3，從生物學(xué)上證明對(duì)雞具有高致病性；HPAI H7N9感染小鼠或雪貂后，致病性同LAPI H7N9 病毒類似，但臨床癥狀較輕；HPAI H7N9 病毒感染雪貂后，在雪貂體內(nèi)復(fù)制一代后可獲得適應(yīng)哺乳動(dòng)物關(guān)鍵突變，PB2基因627 位突變?yōu)镵或701位突變?yōu)镹，突變后的毒株對(duì)小鼠的致病力增加萬(wàn)倍以上，可引起雪貂嚴(yán)重發(fā)病、死亡。HA和PB2基因的聯(lián)合突變?cè)鰪?qiáng)了對(duì)哺乳動(dòng)物的致病性［26］。

2.6 耐藥與治療藥物 既往對(duì)LPAI 的研究發(fā)現(xiàn)，NA 的神經(jīng)氨酸酶抑制劑的耐藥位點(diǎn)突變包括：E119V、R292K、R152K 和A246T。這4 個(gè)耐藥突變均在人感染LPAI H7N9 中檢測(cè)到［8，27］。對(duì)禽類研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)野鴨暴露于低濃度的奧司他韋時(shí)，發(fā)生了I222T位點(diǎn)的突變，從而獲得一定的耐藥性［28］。對(duì)于HPAI H7N9，廣東省對(duì)2 株HPAI H7N9（A /Guangdong/Th008/2017和A/Guangdong/Th005/2017）測(cè)序發(fā)現(xiàn)，A/Guangdong/Th008/2017 的PB2 未發(fā)現(xiàn)突變，但發(fā)現(xiàn)經(jīng)奧司他韋治療后NA 中出現(xiàn)耐藥性突變R292K。據(jù)報(bào)道，在NA 蛋白中具有R292K 突變的H7N9病毒對(duì)多種基于神經(jīng)氨酸酶抑制劑的藥物具有耐藥性［29］。A/Guangdong/Th005/2017PB2 有2個(gè)突變K526R和E627K，但未發(fā)現(xiàn)NA 具有對(duì)奧司他韋的抗性［12］。綜合禽源和人源HPAI H7N9 對(duì)比發(fā)現(xiàn)［17］，禽源高致病性毒株NA 蛋白未發(fā)生R292K突變，提示禽源毒株尚未產(chǎn)生對(duì)NA抑制劑類藥物的耐藥性；而同期人源部分毒株發(fā)生了R292K 突變。在2 株人源病毒分離物中發(fā)現(xiàn)NA 蛋白突變E119V和H274Y，既往報(bào)道這2 個(gè)突變也與病毒的耐藥性有關(guān)［30-31］。在禽源病毒中同樣沒(méi)有檢測(cè)到以上的替換。所有取樣的HPAI H7N9毒株，不論人或禽源所有分離株的M2 蛋白均發(fā)生了S31N 變異，表明毒株對(duì)金剛乙胺的敏感性降低。

鑒于HPAI H7N9 對(duì)傳統(tǒng)的抗流感藥物出現(xiàn)不同程度的耐藥，一些新型的藥物也被運(yùn)用于H7N9的治療。香港的研究者發(fā)現(xiàn)一種新藥，名為DAS181（FludaseTM）。與奧司他韋等神經(jīng)氨酸酶抑制劑類藥物不同，DAS181 的主要成分是唾液酸酶融合蛋白，其作用的對(duì)象是細(xì)胞本身，使宿主細(xì)胞表面的唾液酸受體失去活性，流感病毒就無(wú)法與受體結(jié)合，也就無(wú)法附著細(xì)胞。由于DAS181不直接作用于病毒，不容易出現(xiàn)病毒耐藥性問(wèn)題。DAS181在鼠、MDCK細(xì)胞、分化的人類上呼吸道組織以及支氣管組織上的試驗(yàn)取得了良好的療效［32］。利巴韋林作為具有良好特性的廣譜核苷酸抑制劑，可以通過(guò)RNA聚合酶停止病毒RNA 和mRNA 的合成和加帽。無(wú)論通過(guò)體內(nèi)還是體外試驗(yàn)證實(shí)利巴韋林對(duì)神經(jīng)氨酸酶抑制劑有抗藥性的H7N9病毒感染有良好的效果［33］。美國(guó)的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)一種新型的天然Ⅰ型干擾素，稱之為“Alferon N”，該藥物曾被用作嚴(yán)重急性呼吸綜合征（SARS）的治療，該研究通過(guò)體內(nèi)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，對(duì)于神經(jīng)氨酸酶抑制劑耐藥株與不耐藥株，Alferon N均能有效抑制H7N9病毒的復(fù)制［34］。另外一種藥物被稱為VIS410，是一種靶向甲型流感病毒株的單克隆抗體，該藥物可以通過(guò)結(jié)合血細(xì)胞凝集素來(lái)防止流感病毒與宿主細(xì)胞融合，從而終止病毒的復(fù)制，達(dá)到清除病毒治療流感的目的。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該藥物能有效降低試驗(yàn)小鼠的病死率以及肺內(nèi)的H7N9病毒載量［35］。

2.7 疫苗 針對(duì)2013 年新出現(xiàn)的H7N9 禽流感病毒，世界衛(wèi)生組織（WHO）采用首次分離得到的2 株H7N9 禽流感毒株A/Anhui/1/2013 和A/Shanghai/2/2013作為疫苗候選株的母株［36］，目前已有禽用疫苗已在中國(guó)大陸地區(qū)開展免疫接種，如重組禽流感病毒（H5+H7）二價(jià)滅活疫苗（H5N1 Re-8 株H7N9-Re1 株）已在南方地區(qū)推廣，并取得了良好的效果［37］。另外多種人用疫苗已在臨床試驗(yàn)階段，其中分為幾個(gè)類型，如經(jīng)反向遺傳技術(shù)改造的禽流感病毒滅活疫苗，包括雞胚生產(chǎn)和細(xì)胞生產(chǎn)的滅活疫苗［38-39］，基因工程活載體疫苗包括新城疫、桿狀病毒等為載體表達(dá)的重組疫苗，基于禽流感病毒HA 蛋白的DNA 疫苗等［40-42］。鑒于第5 次疫情中的H7N9高致病性突變株，且對(duì)LPAI H7N9 疫苗株抗原性出現(xiàn)改變，WHO 在2017 增加HPAI 毒株A/Guangdong/17SF003/2016 為候選母株［43］，中國(guó)流感中心的研究人員利用反向遺傳技術(shù)（reverse genetics RG），以A/Puerto Rico/8/34 內(nèi)部基因?yàn)楣羌?，以A/Guangdong/17SF003/2016為模板，構(gòu)建了HPAI H7N9疫苗候選株RG-SF003，為下一步HPAI H7N9 疫苗的生產(chǎn)提供基礎(chǔ)［44］。

3 小結(jié)

第5次疫情中出現(xiàn)的HPAI H7N9禽流感病毒在基本流行病學(xué)特征雖未出現(xiàn)明顯變化，但農(nóng)村病例、職業(yè)人群病例增多，同時(shí)病毒對(duì)動(dòng)物的致病性增強(qiáng)。在抗原性和耐藥性方面發(fā)生了一定變化。因此，通過(guò)對(duì)家禽、環(huán)境和人群的持續(xù)監(jiān)測(cè)，進(jìn)一步研究HPAI H7N9 禽流感病毒的流行病學(xué)特征，加快新型抗病毒藥物和疫苗的研發(fā)等，對(duì)HPAI H7N9疫情的預(yù)防和控制具有重要意義。