張書(shū)婉,吳 爽,徐 蓓,黃君華

(1西安市兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科,西安 710003;2西安醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院;*通訊作者,E-mail:huangjunhua1985@163.com)

EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)是一種雙鏈DNA病毒,在人群中有很高的感染率,感染人體后定植于口咽部上皮細(xì)胞并以環(huán)狀DNA的形式游離于血漿中。傳染性單核細(xì)胞增多癥(infectious mononucleosis,IM),簡(jiǎn)稱“傳單”,是由EBV引起的兒童原發(fā)性急性或亞急性傳染病[1],發(fā)病率高,癥狀不典型,常造成誤診。EBV在IM不同時(shí)期表達(dá)不同抗原,不同機(jī)體對(duì)抗原應(yīng)答出不同類型的抗體,所產(chǎn)生的抗體主要有針對(duì)病毒衣殼抗原(VCA)的IgM和IgG(VCA-IgM/VCA-IgG)、抗EBV早期抗原的抗體(EBEA-IgG)和抗EBV核抗原的抗體(EBNA-IgG),這導(dǎo)致IM抗體模式復(fù)雜多樣。目前對(duì)IM實(shí)驗(yàn)室確診主要依靠EBV抗體檢測(cè)和外周血異型淋巴細(xì)胞[2],而在不同抗體模式下血漿中EBV檢出率和載量是何種情況報(bào)道較少。本研究納入267例診斷為IM的患兒為研究對(duì)象,通過(guò)EBV抗體檢測(cè)結(jié)果將其分為不同模式并定量檢測(cè)血漿病毒核酸,以探討實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)EBV的敏感性及血漿EBV檢出率和載量與抗體模式的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

選取2016-01～2017-12西安市兒童醫(yī)院收治的267例診斷為IM的患兒為研究對(duì)象,其中男158例,女109例,年齡11個(gè)月至9歲,平均年齡(3.1±1.2)歲。267例患兒中252例為實(shí)驗(yàn)室確診,15例為臨床診斷,確定標(biāo)準(zhǔn)參照中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科學(xué)分會(huì)感染學(xué)組、全國(guó)兒童EB病毒感染協(xié)作組《兒童主要非腫瘤性EB病毒感染相關(guān)疾病的診斷和治療原則建議》[2]。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集與處理 嚴(yán)格無(wú)菌操作采集每位患兒的外周靜脈血3 ml于EDTA-K2抗凝管,充分混勻后進(jìn)行外周血異型淋巴細(xì)胞檢測(cè);然后將血液標(biāo)本1 200×g離心10 min分離血漿,每份標(biāo)本的血漿分裝至兩支無(wú)菌Eppendorf管中4 ℃暫存,其中一份用于抗體檢測(cè),一份用于核酸檢測(cè)。

1.2.2 EBV抗體檢測(cè) 用ELISA(德國(guó)歐蒙公司)檢測(cè)VCA-IgM,VCA-IgG,EBEA-IgG和EBNA-IgG,嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作。標(biāo)本吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值>1.0判斷為陽(yáng)性。

1.2.3 病毒核酸FQ-PCR EBV核酸擴(kuò)增試劑盒來(lái)自中山達(dá)安基因股份有限公司,應(yīng)用ABI 7300熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。EBV-DNA>500 拷貝數(shù)/ml判讀為陽(yáng)性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

EBV核酸和VCA-IgM檢測(cè)陽(yáng)性率的比較應(yīng)用配對(duì)資料的χ2檢驗(yàn);不同抗體模式下EBV核酸檢出率的比較采用多樣本率行×列χ2檢驗(yàn)Fisher確切概率法;正態(tài)性檢驗(yàn)應(yīng)用Kolmogorov-Smirov(K-S)檢驗(yàn),經(jīng)檢驗(yàn)EBV核酸載量不服從正態(tài)分布;EBV核酸載量的比較選擇多個(gè)獨(dú)立樣本組間Kruskal-WallisH檢驗(yàn);應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件,P<0.01為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EBV核酸和VCA-IgM檢測(cè)結(jié)果

IM實(shí)驗(yàn)室診斷最重要的檢測(cè)項(xiàng)目為VCA-IgM,因此本研究比較了EBV核酸和VCA-IgM檢測(cè)陽(yáng)性率。EBV核酸定量檢測(cè)(EBV-DNA>500拷貝數(shù)/ml)陽(yáng)性率為89.9%(240/267),高于VCA-IgM的陽(yáng)性率83.2%(222/267),二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.88,P=0.009,見(jiàn)表1)。

表1 267例IM樣本EBV核酸與VCA-IgM檢測(cè)結(jié)果比較Table 1 Comparison of positive results of 267 IM samples between EBV-DNA assay and VCA-IgM assay

2.2 不同抗體模式下血漿EBV核酸檢出率和載量情況

267例IM患兒均進(jìn)行了4種抗體(VCA-IgM,VCA-IgG,EBEA-IgG,EBNA-IgG)檢測(cè),根據(jù)《兒童主要非腫瘤性EB病毒感染相關(guān)疾病的診斷和治療原則建議》[2],所有納入病例的抗核抗體(EBNA-IgG)均為陰性。其中有15例標(biāo)本4項(xiàng)抗體檢測(cè)均為陰性,但外周血異型淋巴細(xì)胞≥10%,結(jié)合臨床指標(biāo)確定為“臨床診斷病例”。其他252例均為“實(shí)驗(yàn)室確診病例”。兒童IM最常見(jiàn)的抗體模式為“VCA-IgM和VCA-IgG陽(yáng)性”(32.2%)和“VCA-IgM,VCA-IgG和EBEA-IgG陽(yáng)性”(27.7%),表明主要為早期和急性感染。

不同抗體模式下血漿EBV-DNA檢出率的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=9.52,P>0.01),但DNA載量的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=27.71,P<0.01),急性感染(VCA-IgM,VCA-IgG和EBEA-IgG陽(yáng)性)時(shí)血漿EB病毒載量高于其他感染狀態(tài)(見(jiàn)表2)。

3 討論

EB病毒在人群中感染率非常高,約90%以上的成人血液中可檢出抗EBV抗體[3],且初次感染后EBV可將病毒基因組整合到B淋巴細(xì)胞中建立潛伏感染,因此在無(wú)癥狀人群的單個(gè)核細(xì)胞中可檢出EBV核酸,但血漿病毒DNA為陰性。兒童傳染性單核細(xì)胞增多癥(IM)是由EB病毒引起的原發(fā)性感染,屬于初次感染EBV,該疾病呈自限性,大多預(yù)后良好,但如不及時(shí)診治可能發(fā)生噬血淋巴組織細(xì)胞增生癥等嚴(yán)重并發(fā)癥。IM的實(shí)驗(yàn)室確診主要依靠EBV抗體檢測(cè)且以VCA-IgM最為重要[4],但EBV感染后血清學(xué)反應(yīng)復(fù)雜多樣[5],給IM的診斷造成一定難度。應(yīng)用FQ-PCR定量檢測(cè)EBV核酸的方法以其靈敏度高、特異性強(qiáng)、簡(jiǎn)便快速等優(yōu)點(diǎn),成為臨床檢測(cè)EBV的有力工具。雖然DNA檢測(cè)的敏感度高于抗體檢測(cè),但由于不同實(shí)驗(yàn)室的操作標(biāo)準(zhǔn)不同等原因,至今仍不是IM確診的指標(biāo)之一。本研究納入267例診斷為IM的患兒為研究對(duì)象,定量檢測(cè)其血漿中的EBV核酸,以探究IM不同抗體模式下血漿病毒DNA的情況,為DNA檢測(cè)在診斷IM中的應(yīng)用提供依據(jù)。

EB病毒核酸檢測(cè)的標(biāo)本來(lái)源有外周血單個(gè)核細(xì)胞和血漿兩種,對(duì)于IM來(lái)說(shuō)血漿標(biāo)本更合適[6],因此本研究以血漿為標(biāo)本類型。在EBV的4種抗體中,以VCA-IgM的敏感度最高[7],與血漿EBV DNA的一致性高[8]。本研究將血漿EBV-DNA和VCA-IgM 的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較,可見(jiàn)核酸檢測(cè)陽(yáng)性率為89.9%,VCA-IgM陽(yáng)性率83.2%,二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),說(shuō)明FQ-PCR較ELISA敏感度高,這與相關(guān)研究結(jié)論一致[7,9-11],可見(jiàn)核酸檢測(cè)可提高IM診斷的準(zhǔn)確性,有利于EBV感染的早發(fā)現(xiàn)早治療。劉春梅等[9]研究表明熒光定量PCR能夠反映患兒體內(nèi)病毒復(fù)制情況,對(duì)病情評(píng)估、預(yù)后和監(jiān)測(cè)具有重要意義。

表2 IM不同抗體模式下血漿EBV-DNA的檢出率和載量Table 2 The EBV detection rate and viral loading in different antibody patterns

本研究267例IM樣本共有6種抗體模式,其中“VCA-IgM,VCA-IgG陽(yáng)性”所占比例最高,為32.2%,其次為“VCA-IgM,VCA-IgG,EBEA-IgG陽(yáng)性”和“VCA-IgM陽(yáng)性”,說(shuō)明本院收治病例以早期感染和急性感染為主。不同抗體模式下血漿EBV-DNA檢出率的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.01),但DNA載量的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),急性感染(VCA-IgM,VCA-IgG和EBEA-IgG陽(yáng)性)時(shí)血漿EB病毒載量高于其他感染狀態(tài)。Bauer等[12]研究顯示IM患者EBV核酸載量與病程呈負(fù)相關(guān),蔡勉珊等[13]的研究認(rèn)為兒童外周血單個(gè)核細(xì)胞EBV核酸載量檢測(cè)有助于病情評(píng)估并可預(yù)測(cè)患兒的臨床轉(zhuǎn)歸,因此動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)血漿EBV核酸載量可為IM的診斷、治療、預(yù)后及轉(zhuǎn)歸提供依據(jù),但在疾病治療過(guò)程中如何根據(jù)核酸定量結(jié)果進(jìn)行判斷仍需進(jìn)一步探討。

綜上所述,血漿EBV-DNA定量檢測(cè)較抗體檢測(cè)有更高的靈敏度,二者結(jié)合能更好地診斷IM;患兒EBV初次感染后抗體模式多樣,主要表現(xiàn)為“VCA-IgM和VCA-IgG陽(yáng)性”和“VCA-IgM,VCA-IgG和EBEA-IgG陽(yáng)性”;不同抗體模式下血漿EBV-DNA檢出率無(wú)差異但核酸載量不同,急性感染時(shí)病毒載量較高。