李冰玲,劉艷華,李炎鑫,史喜菊,劉全國(guó),徐立偉

(北京檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心,北京 朝陽(yáng) 100026)

口蹄疫(Foot-and-mouth disease,FMD)與水皰性口炎(Vesicular stomatitis,VS)在臨床癥狀上十分相似,無法通過臨床診斷進(jìn)行區(qū)分,因此用實(shí)驗(yàn)室方法對(duì)兩種疾病進(jìn)行鑒別診斷和病毒分型就變得十分重要。此外,動(dòng)物可能由于易感性較低或者獲得部分免疫導(dǎo)致無癥狀或癥狀不明顯,因此需要建立多種檢測(cè)方法以對(duì)臨床病例進(jìn)行確診,鑒別感染后康復(fù)動(dòng)物以及無明顯臨床癥狀的病例。實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)亦可確保對(duì)疾病的及時(shí)介入和對(duì)疫情的有效防控,而通過病毒分型能夠確定傳播途徑以及選擇合適的疫苗株。實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果也是國(guó)家制定持續(xù)的監(jiān)測(cè)計(jì)劃以快速識(shí)別疫病的入侵、進(jìn)行運(yùn)輸控制以及實(shí)施根除計(jì)劃以切斷傳播途徑的依據(jù)。本文主要介紹幾種國(guó)際上常用的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法及研究進(jìn)展。

1 基于形態(tài)學(xué)的鑒別

可依據(jù)微核糖核酸屬的口蹄疫病毒和彈狀病毒屬的水皰性口炎病毒在形態(tài)學(xué)上的不同,通過電子顯微鏡對(duì)大量存在于水皰液和水皰上皮中的病毒粒子進(jìn)行鑒別。

2 病毒分離

FMD病毒首選的易感細(xì)胞為牛胸腺原始細(xì)胞,豬、綿羊或小牛腎原始細(xì)胞,其他的比較敏感的細(xì)胞系如BHK-21和IB-RS-2也可用來進(jìn)行病毒培養(yǎng),但是在檢測(cè)低劑量感染時(shí)其敏感性不如上述原始細(xì)胞。VS病毒可采用Vero、BHK-21和IB-RS-2細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。待培養(yǎng)物上形成細(xì)胞病變后,收集培養(yǎng)液即可以進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)或者逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)?？蛇M(jìn)行病毒分離的樣品范圍很廣,包括水皰上皮,食道-咽部分泌液(OP液),奶和血清[1]。

VSV也可以通過接種雞胚進(jìn)行分離。將病毒接種到8～10日齡的雞胚尿囊膜中使其復(fù)制,再進(jìn)行病毒分離。除酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法外,也可以采用病毒中和試驗(yàn)對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)物或接種雞胚進(jìn)行檢測(cè),但該方法比較繁瑣且費(fèi)時(shí)較長(zhǎng),且前提是可以獲得NJ型和IND型的陽(yáng)性血清[2]。

3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)

ELISA檢測(cè)FMD抗原可檢測(cè)來自水皰的樣品,以及通過細(xì)胞或組織培養(yǎng)進(jìn)行擴(kuò)增后的其他部位的樣品。常用于檢測(cè)FMDV抗體的阻斷ELISA和競(jìng)爭(zhēng)ELISA,都是采用型特異性多克隆抗體或單克隆抗體,便捷快速,敏感性高,并且無需活病毒和細(xì)胞培養(yǎng)。感染FMDV后血清中會(huì)迅速產(chǎn)生抗體,ELISA方法可以通過對(duì)幾種抗體(IgM,結(jié)構(gòu)蛋白(Structural protein,SP)抗體,非結(jié)構(gòu)蛋白(Nonstructural protein,NSP)抗體的聯(lián)合檢測(cè)估計(jì)個(gè)體或群體的感染程度和感染時(shí)間。近幾年建立起的IgA檢測(cè)方法可檢測(cè)正在進(jìn)行的病毒復(fù)制,可分辨出康復(fù)期動(dòng)物是否是病毒攜帶者,并且可以區(qū)分感染和疫苗接種。近年來關(guān)于ELISA方法檢測(cè)FMDV的研究很多,在抗原檢測(cè)方面,Morioka等(2014)報(bào)道了一種新型的直接 ELISA,其表現(xiàn)優(yōu)于傳統(tǒng)的間接ELISA[3]。在抗體檢測(cè)方面,有采用重組抗原代替病毒抗原的研究報(bào)道[4];Chen等(2013)建立了非結(jié)構(gòu)蛋白抗體的化學(xué)發(fā)光試驗(yàn)[5]。

ELISA方法也可用于檢測(cè)動(dòng)物血清中的VSV抗體。用印第安納血清型的3種亞型的代表毒株制備的兔或者豚鼠多價(jià)抗血清,可以鑒別出水皰性口炎病毒印第安納血清型的所有毒株。而對(duì)水皰性口炎新澤西血清型的鑒別則需要兔或者豚鼠的單克隆抗體[2]。用競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法檢測(cè)VSV抗體,單克隆抗體作為競(jìng)爭(zhēng)抗體比多價(jià)抗血清具有更好的特異性,且檢測(cè)結(jié)果也更具有一致性[6]。

4 補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)(Complement fixation test,CFT)

CFT可用于檢測(cè)FMD和VS。但與CFT方法相比,ELISA方法更具有優(yōu)越性。在大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室,ELISA已經(jīng)替代CFT,因?yàn)镋LISA更加敏感和特異,并且不受前補(bǔ)體因子和抗補(bǔ)體因子的影響。在不可獲得ELISA試驗(yàn)所需試劑的時(shí)候,可以采用CFT。CFT也可被用來對(duì)早期產(chǎn)生的抗體進(jìn)行定量,主要是IgM抗體。CFT適用的檢測(cè)樣品包括水皰上皮懸液、水皰液或細(xì)胞培養(yǎng)物上清液,但其敏感性不適合于OP樣品或血清的直接檢測(cè)[1-2]。

5 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Reverse transcriptionpolymerase chain reaction,RT-PCR)

RT-PCR方法是OIE推薦的用于FMD臨床病例確診的方法之一,也可用于VS臨床病例的確診。與普通RT-PCR相比,實(shí)時(shí)熒光RT-PCR更適合大批量的樣品檢測(cè);而與病毒分離方法相比,該方法敏感性更高,但不能檢測(cè)出病毒是否具有感染性。

該方法可檢測(cè)的FMD樣品包括上皮、奶、血清和OP液中的病毒基因組片段[1]。Vangrysperre和De Clercq(1996)建立了用型特異性引物對(duì)FMDV進(jìn)行分型的RT-PCR方法[7]。目前在很多實(shí)驗(yàn)室廣泛應(yīng)用的是更加便捷的一步法實(shí)時(shí)熒光PCR。

RT-PCR適用的VS樣品包括組織、水皰液和病毒培養(yǎng)物,該方法僅用于出現(xiàn)VS臨床癥狀的病例的診斷,并不是對(duì)VS進(jìn)行篩查的常規(guī)方法。該方法的陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果有診斷意義,陰性結(jié)果并不代表動(dòng)物未感染,而可能是由于感染階段、感染程度、樣品狀態(tài)等原因?qū)е碌臋z測(cè)結(jié)果陰性。

由于多重RT-PCR方法具有敏感、快速的特點(diǎn),并且該方法可對(duì)不同的病毒、同種病毒的不同血清型進(jìn)行區(qū)分,目前已成為國(guó)內(nèi)外相關(guān)實(shí)驗(yàn)室的研究熱點(diǎn)。William C.(2009)和Kate Hole(2010)分別建立了可以區(qū)分水皰性口炎NJ型和IND型病毒的多重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR[8-9]。Jovita Fernandez(2007)建立了可以區(qū)別診斷口蹄疫、豬水皰病和水皰性口炎的三重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR[10]。

6 試紙條方法(Lateral flow devices,LFDs)

試紙條方法適用的檢測(cè)樣品有水皰上皮懸液、水皰液或細(xì)胞培養(yǎng)物上清液,但是其敏感性不足以用于OP樣品或血清的直接檢測(cè)。

目前已經(jīng)有一些商品化的檢測(cè)FMDV病原的試紙條,也有可以檢測(cè)和區(qū)分FMDV的O型、A型和Asia-1型的試紙條。盡管試紙條方法尚未經(jīng)過OIE的方法確認(rèn)程序,但該方法簡(jiǎn)便、快速,便于田間檢測(cè),其應(yīng)用將使那些實(shí)驗(yàn)室資源不足的國(guó)家受益匪淺。試紙條方法還可以將FMDV病原以一種干燥、無風(fēng)險(xiǎn)的狀態(tài)運(yùn)輸?shù)綄?shí)驗(yàn)室,用于核酸擴(kuò)增、測(cè)序和病毒復(fù)蘇等,以進(jìn)行進(jìn)一步的診斷。

Ferris等(2012)采用單克隆抗體C1和F25VSVNJ-45分別建立了檢測(cè)水皰性口炎IND型和NJ型的試紙條方法,該試紙條可以檢出VSVIND-1亞型和 VSV-NJ亞型,但不與 VSV-IND-2和VSV-IND-3亞型反應(yīng),也不與口蹄疫病毒和豬水皰病病毒反應(yīng)[11]。

7 逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Reverse transcriptionloop mediated isothermal amplification,RT-LAMP)

RT-LAMP方法的建立是分子診斷技術(shù)的重大進(jìn)展。RT-LAMP快速、簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì),其敏感性和特異性與RT-PCR相當(dāng),且可在便攜式設(shè)備上進(jìn)行,方便田間快速診斷。目前已有多個(gè)實(shí)驗(yàn)室建立了檢測(cè)FMDV單個(gè)或多個(gè)血清型的RT-LAMP方法。Fowler等(2016)建立了檢測(cè)VSV-NJ型病毒的RT-LAMP方法[12]。

8 其他方法

使用特異性引物,然后用擴(kuò)增出的病毒RNA產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序,就可以得到該毒株的序列信息。測(cè)序方法不僅可以測(cè)出主要感染毒株的核酸序列,也可以測(cè)出樣品中少量變異株的核酸序列。對(duì)核酸序列的測(cè)定可以了解宿主內(nèi)病毒的進(jìn)化和選擇過程,從而進(jìn)一步了解FMDV在宿主體內(nèi)的動(dòng)態(tài),并可以在疫病爆發(fā)時(shí)迅速找到匹配的疫苗。Logan等(2014)建立了一種對(duì)FMDV全基因組的實(shí)驗(yàn)室大規(guī)模測(cè)序方法[13]。

使用適當(dāng)標(biāo)記的引物,RT-PCR和RT-LAMP的產(chǎn)物可以用試紙條方法來檢測(cè)。有研究表明,FMDV氣體樣品和上皮懸液樣品都可以用RT-LAMP/LFDs聯(lián)合方法檢出,該聯(lián)合方法靈敏度非常高,且不需要進(jìn)行前期的RNA提取,進(jìn)一步簡(jiǎn)化了試紙條檢測(cè)方法的流程[3]。

紅外熱成像是利用口蹄疫的急性熱性的發(fā)病特點(diǎn),篩選出可疑動(dòng)物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室診斷,適用于不同環(huán)境下的健康或患病動(dòng)物群體的田間篩選。但該方法的結(jié)果是非特異性的,需要進(jìn)行進(jìn)一步的診斷。

酶聯(lián)免疫電轉(zhuǎn)印(Enzyme-linked immunoelectrotransfer blot,EITB)方法作為一種檢測(cè)FMD的血清學(xué)檢測(cè)方法在OIE診斷手冊(cè)中也有描述。該方法用重組非結(jié)構(gòu)蛋白3A,3B,2C,3D和3ABC來檢測(cè)待檢血清,在南美作為疫情監(jiān)測(cè)中的確診方法[1]。

9 展望

沒有有效的檢測(cè)方法就談不上對(duì)疫病的有效控制。應(yīng)根據(jù)不同目的選擇合適的檢測(cè)方法。同一方法在應(yīng)用于不同目的時(shí),對(duì)結(jié)果的解釋也可能會(huì)不同。不同方法的結(jié)合使用可以提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

口蹄疫和水皰性口炎的檢測(cè)技術(shù)還在不斷的進(jìn)步中,不斷發(fā)展的分子生物學(xué)方法和基因檢測(cè)技術(shù),以及新的分析方法都將有益于檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展。目前一些檢測(cè)方法的費(fèi)用、易操作性和生物安全方面的需求使一些實(shí)驗(yàn)室無法開展更多的檢測(cè)技術(shù)。國(guó)內(nèi)由于缺乏水皰性口炎的血清學(xué)診斷試劑,免疫學(xué)診斷方法的建立和應(yīng)用也受到很大制約。因此,在資源不足的實(shí)驗(yàn)室建立簡(jiǎn)便經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)方法應(yīng)該是目前的首要任務(wù)。對(duì)簡(jiǎn)便有效的試紙條方法、敏感快速的RT-PCR方法和更加簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)的RT-LAMP方法的進(jìn)一步發(fā)展和完善,將是口蹄疫和水皰性口炎檢測(cè)方法研究的重要方向。