馬 艷，劉景根，王瑜珺

(1.上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200444；2. 中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所，受體結(jié)構(gòu)與功能重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 201203)

疼痛是患者就醫(yī)的最起始信號(hào)，其中包括炎性疼痛、神經(jīng)疼痛和癌癥晚期患者經(jīng)受的癌痛等。疼痛影響的患者甚至超過糖尿病、心血管病和腫瘤患者之和。以嗎啡為代表的μ阿片受體激動(dòng)劑是臨床治療中、重度疼痛的主要鎮(zhèn)痛藥，但此類藥物會(huì)引起用藥欣快感、耐受和呼吸抑制等副作用，存在成癮、藥物濫用和死亡的高用藥風(fēng)險(xiǎn)[1]。因此，尋找安全有效、副作用小的新型潛在鎮(zhèn)痛化合物是當(dāng)務(wù)之急。為避免μ阿片類鎮(zhèn)痛藥物介導(dǎo)的副作用，長(zhǎng)期以來κ受體激動(dòng)劑都是新型鎮(zhèn)痛藥物的一個(gè)重要研究方向。

1 以κ阿片受體為靶標(biāo)的代表藥物

κ阿片受體激動(dòng)劑可以有效緩解疼痛、治療瘙癢，而不引起成癮、呼吸抑制和便秘等嗎啡樣副作用,已獲得越來越多的關(guān)注，但是其煩躁不安、鎮(zhèn)靜和致幻等中樞副作用也限制了這類化合物的成藥可能。目前，臨床以κ阿片受體為靶標(biāo)的藥物，如噴他佐辛、納布啡、布托啡諾等均為κ/μ混合激動(dòng)藥物，κ阿片受體選擇性激動(dòng)劑只有2009年日本上市的用于尿毒癥患者止癢藥物納呋拉啡。

1.1 噴他佐辛(pentazocine)70年代發(fā)現(xiàn)的苯基嗎喃類鎮(zhèn)痛藥物，主要激動(dòng)κ阿片受體,對(duì)μ受體具有部分激動(dòng)或較弱的拮抗作用。噴他佐辛適用于中、重度鎮(zhèn)痛,具有較弱的焦慮副作用和較低的成癮性。臨床廣泛用于手術(shù)痛、慢性疼痛、癌痛等。該藥物術(shù)后鎮(zhèn)痛的不良反應(yīng)主要為惡心、嘔吐和多汗等,且發(fā)生率較低[2]。有文獻(xiàn)報(bào)道，噴他佐辛還可以用于治療其他鎮(zhèn)痛方法引起的不良反應(yīng)[3]。

1.2 納布啡(nalbuphine)納布啡是一種半合成混合型阿片受體激動(dòng)-拮抗劑,為強(qiáng)效κ阿片受體激動(dòng)劑，對(duì)δ受體無激動(dòng)作用,對(duì)μ受體具有拮抗作用，拮抗藥效是噴他佐辛的11倍,足以拮抗掉嗎啡等μ激動(dòng)劑引起的呼吸抑制。具有鎮(zhèn)痛效應(yīng)強(qiáng),呼吸抑制、惡心嘔吐、皮膚瘙癢等副作用較弱的優(yōu)點(diǎn),廣泛應(yīng)用于術(shù)后鎮(zhèn)痛、臨床麻醉等。自1965年合成以來,在國(guó)外得到廣泛應(yīng)用。2015國(guó)產(chǎn)化上市，近兩年國(guó)內(nèi)臨床應(yīng)用逐漸增多[4]。

1.3 布托啡諾(butorphanol)14-羥基嗎啡喃系列鎮(zhèn)痛藥物，是一種合成的阿片受體混合激動(dòng)拮抗劑，其體外阿片受體親和力為1 ∶4 ∶25(μ ∶δ ∶κ)，為強(qiáng)效κ阿片受體完全激動(dòng)劑，對(duì)δ受體激動(dòng)活性低，對(duì)μ受體有部分激動(dòng)作用。該藥物具有鎮(zhèn)靜作用，但成癮性低，無耐藥性，無煩躁不安、焦慮等不適感，呼吸抑制弱[5]。1992年，美國(guó)開發(fā)出布托啡諾鼻腔噴霧制劑用于緩解劇烈疼痛。

1.4 地佐辛(dezocine)阿片受體混合激動(dòng)拮抗劑，鎮(zhèn)痛作用強(qiáng)，而副作用弱。2009年，揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)在中國(guó)將地佐辛按3.1類新藥開發(fā)，獨(dú)家上市后，迅速占據(jù)國(guó)內(nèi)鎮(zhèn)痛藥物市場(chǎng)。2016年，地佐辛的銷售額在全國(guó)達(dá)到6.3億美元，占全國(guó)阿片類鎮(zhèn)痛藥市場(chǎng)的45%以上。早期研究表明，地佐辛對(duì)μ受體具有激動(dòng)作用，在動(dòng)物和人類中均能產(chǎn)生與嗎啡等效甚至更強(qiáng)的鎮(zhèn)痛作用[6]。同時(shí)，地佐辛表現(xiàn)出一定的μ拮抗活性。與μ完全激動(dòng)劑嗎啡相比，地佐辛安全性較好。根據(jù)以上資料，地佐辛被認(rèn)為是μ部分激動(dòng)劑[6]。Liu等[7]對(duì)地佐辛的分子靶點(diǎn)進(jìn)行表征，證實(shí)地佐辛為κ部分激動(dòng)劑。由于地佐辛結(jié)構(gòu)上與噴他佐辛有相關(guān)性，地佐辛最初被鑒定為κ受體激動(dòng)劑，體外功能測(cè)定表明地佐辛為κ受體拮抗劑,去甲腎上腺素和5-羥色胺重?cái)z取抑制劑。近期我們課題組結(jié)合體外功能性[35S] GTPγS實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)藥效實(shí)驗(yàn)證實(shí)，地佐辛是κ部分激動(dòng)劑和μ部分激動(dòng)劑，對(duì)μ受體的親和力高于κ受體[8]。

1.5 納呋拉啡(nalfurafine，TRK-820)Nagase等[9]于1998年發(fā)現(xiàn)新型κ受體激動(dòng)劑-納呋拉啡。Wang等[10]明確了納呋拉啡對(duì)κ阿片受體的高選擇性。納呋拉啡具有較強(qiáng)的G蛋白偏向性，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，鎮(zhèn)痛劑量下不引起煩躁、鎮(zhèn)靜等作用，臨床不產(chǎn)生致幻，因此，納呋拉啡被定位為低副作用的鎮(zhèn)痛劑和止癢劑[11]。然而，最近在大鼠顱內(nèi)自我刺激實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，高劑量納呋拉啡會(huì)誘導(dǎo)煩躁不安厭惡效應(yīng)，因此，納呋拉啡的G蛋白偏向特性可能不足以保證它的安全性[12]。此外，臨床試驗(yàn)顯示，納呋拉啡在鎮(zhèn)痛劑量下存在嚴(yán)重的鎮(zhèn)靜作用，但是這種副作用在低劑量(止癢劑量)下可避免[13]。2009年，納呋拉啡軟膠囊劑型在日本上市，用于治療尿毒癥患者血液透析相關(guān)瘙癢癥。2015年及2017年，納呋拉啡在日本獲批用于治療慢性肝病患者瘙癢癥及腹膜透析患者瘙癢癥。2018年，中國(guó)生物制藥公司三生制藥和日本東麗公司(Toray)簽訂獨(dú)家許可協(xié)議，在中國(guó)內(nèi)地開發(fā)及商業(yè)化該產(chǎn)品。納呋拉啡從小鼠模型成功轉(zhuǎn)向臨床市場(chǎng)，并轉(zhuǎn)向商業(yè)化發(fā)展，最終被血液透析病患與尿毒癥瘙癢患者接受，是目前κ阿片類選擇性藥物領(lǐng)域中唯一市售產(chǎn)品。

1.6 KORSUVA(CR845/difelikefalin)由Cara Therapeutics公司開發(fā)，是一種作用于外周的新型高選擇性κ受體激動(dòng)劑，CR845在人和動(dòng)物中均表現(xiàn)出強(qiáng)效的鎮(zhèn)痛、抗炎和止癢特性。由于CR845難以穿透血腦屏障，可以有效避免中樞副作用。該注射劑于2018年初啟動(dòng)針對(duì)術(shù)后痛和止癢的關(guān)鍵性臨床III期試驗(yàn)。

2 κ阿片受體激動(dòng)劑伴隨的副作用及評(píng)價(jià)方法

在臨床前研究階段，動(dòng)物模型和研究方法的恰當(dāng)選擇是發(fā)現(xiàn)和評(píng)估新型先導(dǎo)藥物的重中之重。κ受體激動(dòng)劑產(chǎn)生鎮(zhèn)痛的同時(shí)也會(huì)伴隨鎮(zhèn)靜、煩躁不安和致幻的發(fā)生。鎮(zhèn)靜的評(píng)價(jià)方法和手段較多，自發(fā)活動(dòng)和轉(zhuǎn)輪實(shí)驗(yàn)均能作為鎮(zhèn)靜評(píng)價(jià)指標(biāo)。目前，國(guó)內(nèi)外尚沒有針對(duì)致幻的動(dòng)物行為研究方法。煩躁不安作為一種負(fù)性情緒，評(píng)價(jià)有一定的難度，近年來對(duì)κ受體激動(dòng)劑，尤其是G蛋白偏向性配體的開發(fā)促進(jìn)了該評(píng)價(jià)方法的成熟。

2.1 條件位置厭惡(conditioned place aversion, CPA)激活κ阿片受體會(huì)引起人類的煩躁不安和嚙齒動(dòng)物的類似煩躁?duì)顟B(tài)[14]。在嚙齒動(dòng)物中，CPA行為是煩躁不安的客觀測(cè)量方法[15]。通過將特定的環(huán)境信號(hào)與藥物引起的情緒搭配，使動(dòng)物對(duì)二者形成聯(lián)系并建立條件反射，當(dāng)動(dòng)物再次處于相同環(huán)境時(shí)，會(huì)表現(xiàn)出厭惡和逃避。CPA模型建立分為3個(gè)時(shí)期：條件化前期(1 d)、條件化期(6 d)、測(cè)試期(1 d)。測(cè)試期動(dòng)物在伴藥箱一側(cè)的停留時(shí)間與條件化前期動(dòng)物在伴藥箱中的停留時(shí)間的差值，即為CPA值[16]。Anderson等[17]用CPA模型評(píng)價(jià)選擇性κ激動(dòng)劑U62066介導(dǎo)的煩躁情緒，發(fā)現(xiàn)成年大鼠給予0.1、0.2 mg·kg-1U62066均表現(xiàn)出明顯的CPA。Laman-Maharg等[18]觀察到κ受體激動(dòng)劑U50488介導(dǎo)明顯的煩躁不安，同時(shí)存在性別差異，在♂加利福尼亞小鼠中，10 mg·kg-1的U50488可以引起CPA，而對(duì)于♀加利福尼亞小鼠，2.5 mg·kg-1U50488即可引起明顯的CPA。值得注意的是，應(yīng)激也會(huì)促進(jìn)內(nèi)源性強(qiáng)啡肽原釋放，進(jìn)而激活κ受體產(chǎn)生CPA，但該作用依賴促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子(corticotropin-releasing factor，CRF)。由CRF引起的CPA可被強(qiáng)啡肽基因缺失、κ受體拮抗劑或CRF2受體拮抗劑antisauvigine-30阻斷。但是，外源性κ激動(dòng)劑U50488直接誘導(dǎo)的CPA不可被CRF2受體拮抗劑阻斷[14]。

2.2 顱內(nèi)自刺激(intracranial self-stimulation，ICSS)κ受體激活在動(dòng)物中引起的煩躁不安是難以直接測(cè)量的，CPA模型中體現(xiàn)出的厭惡指數(shù)可以作為一個(gè)指標(biāo)[19]，但是厭惡情緒本身是一個(gè)復(fù)雜的過程，涉及眾多腦內(nèi)信號(hào)分子。有研究將動(dòng)物對(duì)腹側(cè)被蓋區(qū)- ICSS低應(yīng)答頻率反映出的快感缺失，作為體現(xiàn)κ受體激動(dòng)引起的煩躁不安的另一個(gè)指標(biāo)。在該實(shí)驗(yàn)中，將電極埋于鼠腦，通過動(dòng)物自己按開關(guān)通電流，以進(jìn)行自刺激。這是Olds等[20]發(fā)現(xiàn)的現(xiàn)象，在獎(jiǎng)賞系統(tǒng)中，動(dòng)物按開關(guān)的頻率可高達(dá)每小時(shí)5 000次。ICSS的產(chǎn)生部位為以丘腦下部為中心，擴(kuò)展到大腦邊緣系統(tǒng)及中腦頂蓋，而大腦新皮質(zhì)、丘腦和小腦無此作用。通過按開關(guān)引起的對(duì)腦的獎(jiǎng)賞刺激，可使動(dòng)物學(xué)習(xí)。有效學(xué)習(xí)與自刺激有效部位得到獎(jiǎng)賞有一定聯(lián)系。將能產(chǎn)生自刺激的部位稱為獎(jiǎng)賞系統(tǒng)，與此相對(duì)，將動(dòng)物會(huì)躲避按開關(guān)的刺激部位稱懲罰系統(tǒng)。ICSS作為一種實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)方法，是對(duì)CPA實(shí)驗(yàn)的有力補(bǔ)充。κ受體激動(dòng)劑通過抑制腦中獎(jiǎng)賞效應(yīng)增加ICSS閾值。另外，系統(tǒng)操縱刺激頻率產(chǎn)生“頻率-反應(yīng)率”曲線(類似于藥理學(xué)劑量-效應(yīng)曲線)，實(shí)驗(yàn)通過頻率曲線的改變?cè)u(píng)價(jià)動(dòng)物情緒。ICSS中這種“曲線移位”方法的優(yōu)點(diǎn)是它可以將刺激敏感度與動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)應(yīng)答能力分開[21]。具體而言，頻率-速率曲線的橫向移動(dòng)通常代表刺激的敏感度變化，而垂直移位被解釋為運(yùn)動(dòng)效應(yīng)的改變。研究表明，κ受體激動(dòng)劑U50488、U69593介導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生煩躁不安，均會(huì)增加ICSS閾值。而κ受體拮抗劑norBNI、5′-acetamidinoethylnaltrindole(ANTI)預(yù)處理會(huì)阻斷U50488、U69593介導(dǎo)的ICSS閾值升高[19,22]。實(shí)驗(yàn)證明，具有G蛋白偏向特性的阿片受體激動(dòng)劑RB-64，triazole 1.1，不產(chǎn)生明顯的煩躁不安，不會(huì)增加ICSS閾值[22,23]。臨床止癢藥物κ受體激動(dòng)劑納呋拉啡在小鼠ICSS實(shí)驗(yàn)中也不會(huì)引起閾值的升高，提示該藥物在止癢劑量范圍內(nèi)不產(chǎn)生煩躁不安副作用[16]。

3 κ阿片受體介導(dǎo)煩躁不安的潛在分子機(jī)制

近年來，在利用CPA和ICSS評(píng)價(jià)κ受體激動(dòng)劑煩躁不安副作用的同時(shí)，介導(dǎo)該作用發(fā)生的分子機(jī)制也引起眾多關(guān)注。

3.1 β-arrestin信號(hào)通路“功能選擇性”也叫“激動(dòng)劑偏向性”，是用來描述G蛋白偶聯(lián)受體配體選擇性地激活G蛋白信號(hào)通路，而不是激活包括G蛋白、β-arrestins和(或)激酶在內(nèi)的所有信號(hào)。功能選擇性意味著，有不同偏向性的配體會(huì)產(chǎn)生不同的行為效應(yīng)。Bruchas等[15]發(fā)現(xiàn)，κ受體誘導(dǎo)的p38 MAPK磷酸化介導(dǎo)了動(dòng)物煩躁不安的發(fā)生，與鎮(zhèn)痛作用無關(guān)，并且p38 MAPK的激活是由β-arrestin2通路介導(dǎo)[24]，表明β-arresin2通路和煩躁不安副作用相關(guān)。Triazole 1.1是由Brust等[22]新發(fā)現(xiàn)的G蛋白偏向性κ受體激動(dòng)劑，他們發(fā)現(xiàn)Triazole 1.1和傳統(tǒng)κ受體激動(dòng)劑一樣具有鎮(zhèn)痛和止癢作用，但不會(huì)誘發(fā)鎮(zhèn)靜、煩躁不安和多巴胺釋放減少。但是，有研究利用β-arrestin2敲除鼠發(fā)現(xiàn)，敲除β-arrestin2損傷了動(dòng)物的行為協(xié)調(diào)性[23,25]，動(dòng)物仍然表現(xiàn)出煩躁不安，同時(shí)也不影響κ激動(dòng)劑的鎮(zhèn)痛和止癢作用，證明β-arrestin通路和動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)性相關(guān)，但和煩躁不安通路無直接相關(guān)性。他們進(jìn)一步對(duì)G蛋白偏向性配體RB-64進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)RB-64具有明顯的鎮(zhèn)痛作用和CPA副作用，但沒有鎮(zhèn)靜和快感缺失副作用[23,25]。因此，現(xiàn)有資料表明，β-arrestin偏向性信號(hào)傳導(dǎo)與煩躁不安、運(yùn)動(dòng)失調(diào)有一定的相關(guān)性。目前，主要利用偏向因子(G蛋白/β-arrestin2)來描述配體對(duì)G蛋白和β-arrestin2的偏向性，偏向因子計(jì)算：對(duì)G蛋白的激動(dòng)能力(35S GTPγS binding實(shí)驗(yàn))/對(duì)β-arrestin2的招募能力(DiscoveRx Path Hunter Enzyme Fragment Complementation，EFC技術(shù))[26]。

3.2 p38 MAPK研究表明，κ受體介導(dǎo)的煩躁不安依賴p38MAPK通路的激活[15,24]，而p38 MAPK的激活由于G蛋白偶聯(lián)受體激酶3引起受體磷酸化，進(jìn)而招募β-arrestin2所致[27]。本課題組前期也發(fā)現(xiàn)，κ阿片受體激動(dòng)劑U50488介導(dǎo)的CPA依賴杏仁核p38 MAPK磷酸化，選擇性p38抑制劑SB203580可以阻斷U50488介導(dǎo)的CPA行為[15,28]。Ehrich等[29]發(fā)現(xiàn)，多巴胺神經(jīng)元中的p38αMAPK在κ阿片受體介導(dǎo)的厭惡情緒中起關(guān)鍵作用，腹側(cè)背蓋區(qū)內(nèi)κ阿片受體活化引起p38αMAPK磷酸化是κ阿片受體介導(dǎo)條件性位置厭惡所必需的。恢復(fù)κ阿片受體敲除鼠腹側(cè)背蓋區(qū)多巴胺能神經(jīng)元中κ受體的表達(dá)，動(dòng)物重新產(chǎn)生κ阿片受體依賴的負(fù)性情緒。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，在多巴胺能神經(jīng)元中，κ阿片受體激活p38αMAPK引發(fā)煩躁不安負(fù)性情緒，而κ阿片受體激活p38αMAPK與κ阿片受體抑制多巴胺釋放過程無關(guān)。

3.3 哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信號(hào)通路2018年，Liu等[30]利用磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)方法，對(duì)κ受體信號(hào)介導(dǎo)的信號(hào)作了全面的評(píng)價(jià)，通過對(duì)近50 000個(gè)不同的磷酸化位點(diǎn)定量分析，發(fā)現(xiàn)mTOR信號(hào)通路與κ受體介導(dǎo)的煩躁不安副作用存在相關(guān)性。mTOR復(fù)合物能激活p70S6激酶，進(jìn)而增加核糖體蛋白S6的磷酸化,導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成增加。他們發(fā)現(xiàn)，抑制mTOR通路激活可以消除κ受體引起的CPA行為。Liu等[16]進(jìn)一步利用該方法結(jié)合行為學(xué)實(shí)驗(yàn)，比較了經(jīng)典κ受體激動(dòng)劑U50488和不會(huì)引起煩躁不安副作用的納呋拉啡的異同，證明mTOR信號(hào)通路介導(dǎo)κ阿片受體激活引起的煩躁不安厭惡情緒。在紋狀體和皮質(zhì)中，U50488激活mTOR通路程度明顯強(qiáng)于納呋拉啡，而且mTOR抑制劑可以阻斷U50488誘導(dǎo)的CPA。另外，可以引起CPA的U50488和不產(chǎn)生CPA的6′-GNTI在調(diào)控小鼠紋狀體和皮質(zhì)中mTOR通路方面也存在差異[30]。因此，κ阿片受體激動(dòng)劑激活mTOR通路的能力或許可以作為區(qū)分κ阿片受體激動(dòng)劑產(chǎn)生不同程度煩躁不安的方法。值得注意的是，p38MAPK通路的激活在該方法中未被發(fā)現(xiàn)。

阿片類藥物是最有效的止痛藥，但長(zhǎng)期使用的嚴(yán)重副作用限制疼痛治療的有效性、安全性，導(dǎo)致全世界范圍內(nèi)的阿片類藥物濫用。與κ阿片受體激動(dòng)劑不同，κ阿片受體激動(dòng)劑在鎮(zhèn)痛止癢同時(shí)不引起欣快感，有效避免了藥物濫用和成癮，而且κ激動(dòng)劑不會(huì)引起呼吸抑制，極大地增加了臨床用藥的安全性，相信κ阿片受體激動(dòng)劑研究將為設(shè)計(jì)開發(fā)新型阿片鎮(zhèn)痛藥開辟新的道路。