喬大偉，李玉芳，張蕾，姜禮雙，孔桂美，卜平*

(1. 揚(yáng)州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院消化內(nèi)科，江蘇 揚(yáng)州 225001； 2. 江蘇省中西醫(yī)結(jié)合老年病重點(diǎn)防治實(shí)驗(yàn)室，江蘇 揚(yáng)州 225001)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是全球第三大癌癥和癌癥死亡的第四大原因[1]。近年來由于生活方式和飲食習(xí)慣的變化，我國(guó)結(jié)直腸癌發(fā)病率和死亡率呈逐步上升趨勢(shì), 結(jié)直腸惡性腫瘤在腫瘤發(fā)病率中占據(jù)第5位[2]。肝是CRC最常見的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移部位，CRC患者中約有一半會(huì)發(fā)生肝轉(zhuǎn)移。結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移(colorectal cancer liver metastases，CRLM)也是CRC患者死亡的主要原因。盡管經(jīng)過化療后，患者存活率有所提高，但手術(shù)切除仍被認(rèn)為是肝轉(zhuǎn)移患者的唯一治療選擇。雖然根治性手術(shù)是標(biāo)準(zhǔn)治療方式，但只有10%～20%的患者被認(rèn)為有資格進(jìn)行切除。即使在成功切除后，大多數(shù)患者仍然會(huì)復(fù)發(fā)[3]。近年來，由于免疫缺陷小鼠的廣泛應(yīng)用，以及患者的個(gè)性化治療越來越受到關(guān)注，源于患者原代腫瘤組織的異種移植(patient-derived tumor xenograft，PDTX)的臨床前模型研究火熱。PDTX模型是指將手術(shù)期間獲得患者腫瘤部分組織或者人源腫瘤細(xì)胞植入免疫缺陷小鼠。用于PDTX模型的小鼠類型包括裸鼠，SCID小鼠，NOD/SCID小鼠和NSG小鼠[4]。本文就目前常用的CRLM-PDTX動(dòng)物模型進(jìn)行綜述。

1 異種原位種植模型

異種原位植入，即在小鼠中與人類患者原始腫瘤部位相對(duì)應(yīng)的部位植入人源腫瘤細(xì)胞，使小鼠腫瘤發(fā)生與發(fā)展的行為與臨床患者相似。1984年，Wang等首次采用異種原位種植建模[5]，他們將人CRC細(xì)胞Co115注入裸鼠的降結(jié)腸，腫瘤在注射部位生長(zhǎng)繁殖并發(fā)生轉(zhuǎn)移。隨后有學(xué)者[6]利用裸鼠建立了首例人體腫瘤組織異種原位種植的模型(patient-derived orthotopic xenograft，PDOX)。從那時(shí)起，PDOX模型被用于腫瘤微環(huán)境研究，探索腫瘤發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，包括自發(fā)轉(zhuǎn)移形成[7]。這些模型使研究人員能夠研究藥物療效，如用各種化療方案以預(yù)測(cè)患者的臨床反應(yīng)[8]，還用于研究新的腫瘤標(biāo)志物抗性和易感性，并檢測(cè)新的藥物方案以克服抗性。Wang等[9]采用自制接種器將0.1 mL細(xì)胞濃度為2×107/mL的人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116接種于BALB/c裸鼠直腸，成功建立異種原位種植模型，直腸原位接種組18只成瘤率為100%，未發(fā)現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移。此法轉(zhuǎn)移發(fā)生時(shí)間較長(zhǎng)。Hite等[10]模擬了結(jié)直腸癌患者中原發(fā)腫瘤生長(zhǎng)和自發(fā)性肝轉(zhuǎn)移的模式，使用熒光素酶標(biāo)記的HT-29細(xì)胞建立了異種原位小鼠直腸種植模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)直腸內(nèi)注射的死亡率為4.0%(1/25)，60%的小鼠有肝轉(zhuǎn)移，56%發(fā)生肺轉(zhuǎn)移，證實(shí)直腸內(nèi)注射建立異種原位種植模型能準(zhǔn)確地模擬腸癌原發(fā)性腫瘤生長(zhǎng)和自發(fā)轉(zhuǎn)移的過程，具有安全性，可重復(fù)性及高模擬性。原位種植方法操作簡(jiǎn)單，能更好地模擬結(jié)直腸癌的臨床生物學(xué)行為，比如腫瘤的局部生長(zhǎng)、腫瘤的浸潤(rùn)、癌細(xì)胞原位脫落穿過血管壁進(jìn)入門靜脈循環(huán)血運(yùn)轉(zhuǎn)移等過程。但是因直腸壁較薄故種植成功率較低，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移時(shí)間較長(zhǎng)，因此，為了能夠監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)移的發(fā)生，該模型成像技術(shù)是必不可少的。

2 異種異位種植模型

異種異位種植模型按植入位置不同可以分為皮下種植、脾種植、門靜脈/腸系膜種植、肝種植、腹腔擴(kuò)散種植及尾靜脈種植。

2.1 皮下種植模型

皮下植入模型可以直接測(cè)量腫瘤大小，發(fā)展成類似于人類腫瘤的結(jié)直腸癌，但幾乎不會(huì)產(chǎn)生轉(zhuǎn)移。Blomme等[11]收集患者手術(shù)時(shí)新鮮腫瘤樣品，切成60 mm3的細(xì)小片段并皮下移植到NOD-SCID小鼠的皮膚中。利用MALDI成像技術(shù)，對(duì)6名患者腫瘤組織與PDX第4代的腫瘤組織進(jìn)行了代謝比較分析。首次研究發(fā)現(xiàn)CRC/CRC-LM PDX模型在代謝水平能夠維持功能穩(wěn)定性。證明人類癌細(xì)胞在PDX模型上，不僅能產(chǎn)生類似人類的腫瘤組織，且能對(duì)患者腫瘤組織保持高度的遺傳性和轉(zhuǎn)錄的保真度。這將為新藥物應(yīng)用于臨床前進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究提供一個(gè)非常好的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。Brown等[12]收集16名腸癌肝轉(zhuǎn)移患者肝轉(zhuǎn)移灶組織，并將腫瘤移植到NOD.CB17-Prkdcscid/Arc小鼠皮下。結(jié)果植入率達(dá)81%，患者與PDX化療敏感性概況之間的陽性匹配率為67%。該試驗(yàn)研究證明了使用CRLM的PDX模型作為評(píng)估PDX化療敏感性的平臺(tái)的可行性。Lu等[13]將患者腫瘤組織約2 mm大小的碎片并植入8～10周齡JAX.NOD.CB17-PrkdcSCID-J小鼠的側(cè)腹。使用基于基因的方法與結(jié)直腸癌的臨床前模型的結(jié)合來鑒定可用于治療結(jié)腸直腸肝轉(zhuǎn)移的協(xié)同藥物，即奧沙利鉑和mTOR抑制劑聯(lián)合應(yīng)用可有效治療結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者。此法操作簡(jiǎn)單，植入成功率高，便于觀察，重復(fù)性好。但是因皮下生長(zhǎng)的腫瘤常易被纖維膜所包繞，不易表現(xiàn)惡性腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的特性，故常常用于評(píng)價(jià)單純針對(duì)原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶組織的保真性，化療敏感性及治療的有效性。

2.2 脾種植模型

脾種植法是目前大腸癌肝轉(zhuǎn)移模型公認(rèn)的最佳模式之一。由于腫瘤細(xì)胞從脾內(nèi)種植細(xì)胞，植入的細(xì)胞逃逸大量免疫細(xì)胞的攻擊，主要通過血管浸潤(rùn)發(fā)生肝轉(zhuǎn)移。因此，能夠更好模擬人體內(nèi)CRC切除后的肝轉(zhuǎn)移。根據(jù)是否切除脾分為脾保留法和脾切除法。

2.2.1 脾保留法

脾保留是指將人CRC細(xì)胞從脾上極或下極注入動(dòng)物脾內(nèi)，脾送回體內(nèi)，瘤細(xì)胞經(jīng)脾靜脈進(jìn)入肝。Fleten等[14]通過脾注射HT細(xì)胞株HT29和HCT116，在裸鼠中建立腸癌肝轉(zhuǎn)移模型。注射后，HCT116和HT29細(xì)胞在所有動(dòng)物中產(chǎn)生肝腫瘤。Kawaguchi等[15]將人HT29-RFP細(xì)胞(5 × 105)注射到裸鼠的脾上極和下極。注射后3周，成功建立腸癌肝轉(zhuǎn)移模型。此法成功率高，應(yīng)用最為廣泛。最近，Kim等[16]在使用CRC-PDTX以及CRLM-PDTX模型基礎(chǔ)上，證明了CCSP-2靶向探針可以鑒定結(jié)腸外CCSP-2陽性結(jié)腸腫瘤。這表明CCSP-2靶向分子成像能夠檢測(cè)轉(zhuǎn)移性疾病。對(duì)于結(jié)腸癌的治療，早期轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)檢測(cè)，有望通過在疾病早期檢測(cè)病變來挽救更多患者，延長(zhǎng)生存期。此法保留了脾的部分免疫功能，保存宿主固有的抗腫瘤免疫力，且操作簡(jiǎn)單，易于實(shí)施。但是肝轉(zhuǎn)移瘤形成的同時(shí)發(fā)生脾腫瘤，轉(zhuǎn)移灶常為巨大癌結(jié)節(jié)，影響小鼠的存活時(shí)間，并且脾腫瘤通常在肝轉(zhuǎn)移瘤前發(fā)生，會(huì)影響實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，不適于驗(yàn)證周期較長(zhǎng)的藥物實(shí)驗(yàn)。

2.2.2 脾切除法

脾切除是指將人CRC細(xì)胞從脾上極或下極注入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物脾內(nèi)，待瘤細(xì)胞經(jīng)脾靜脈進(jìn)入肝，切除脾。Oshima等[17]制作了用熒光素酶和tdTomato穩(wěn)定標(biāo)記的具有不同的生長(zhǎng)特性的人結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞的單克隆衍生物，經(jīng)脾注射入6～8周齡無胸腺裸鼠后，將脾切除，使用體內(nèi)成像系統(tǒng)(IVIS)，可以通過體內(nèi)發(fā)光和離體熒光成像，監(jiān)視轉(zhuǎn)移的發(fā)生發(fā)展，結(jié)果大部分能夠產(chǎn)生肝轉(zhuǎn)移。由于該模型與臨床觀察到的肝轉(zhuǎn)移灶相似，因此它可作檢測(cè)與肝轉(zhuǎn)移相關(guān)基因，并用于肝轉(zhuǎn)移灶局部消融或輔助治療研究。此法雖然不能模擬腫瘤分泌降解酶降解細(xì)胞外基質(zhì)，偽足形成，侵及血管，進(jìn)入血液等關(guān)鍵步驟，而且在一定程度上令免疫系統(tǒng)受損，術(shù)后動(dòng)物病死率高，操作較復(fù)雜，對(duì)試驗(yàn)者技術(shù)要求較高。但是很好地模擬了大腸癌根治術(shù)后因血行轉(zhuǎn)移而發(fā)生肝轉(zhuǎn)移的過程，肝轉(zhuǎn)移率高，模型穩(wěn)定，轉(zhuǎn)移癌向各個(gè)肝葉呈彌漫性轉(zhuǎn)移?？梢詽M足各種檢測(cè)方法的取材需要。是研究腫瘤形成和分析新的治療效果的理想模型。

2.2.3 半脾模型

半脾模型為脾保留和脾全切的改良造模方法，利用脾的解剖特點(diǎn)，將人CRC細(xì)胞注入脾下極，待瘤細(xì)胞經(jīng)脾靜脈進(jìn)入肝，切除脾下極，保留脾上極，具有一定的創(chuàng)新性。Bai等[18]利用裸鼠脾的特殊解剖，建成半脾模型。脾中央利用一次性鈦夾夾閉并切斷，分成兩個(gè)帶血管蒂的半脾。將人HT29結(jié)直腸癌細(xì)胞接種于近端半脾被膜下，遠(yuǎn)端半脾埋入皮下備治療所需，共分6組觀察制模30 d后的肝轉(zhuǎn)移評(píng)分、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及血性腹水情況。結(jié)果人HT29結(jié)直腸癌細(xì)胞建立的肝轉(zhuǎn)移半脾模型成瘤率為100%。此法既保留了脾的部分免疫功能，又大大降低模型建立時(shí)脾腫瘤的干擾率。且此模型可以經(jīng)靜脈給藥，更加貼近于臨床，可應(yīng)用于預(yù)防性肝轉(zhuǎn)移治療的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。但是相比脾保留與脾全切，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)手術(shù)操作復(fù)雜，對(duì)試驗(yàn)者技術(shù)要求極高。該模型為研究結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的生物學(xué)機(jī)制和抗轉(zhuǎn)移治療提供了較為理想的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停以撃Ｐ湍軕?yīng)用于抗腫瘤藥物的篩選，因此是目前造模的最有效方法之一。

2.3 門靜脈/腸系膜種植模型

此法是將人CRC細(xì)胞注入門靜脈/腸系膜靜脈，經(jīng)血流入肝。Thalheimer等[19]使用熒光素酶標(biāo)記的人結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT-116Luc(pos)的細(xì)胞(2.5 × 106)，通過門靜脈注射到免疫功能不全的裸鼠中。使用生物發(fā)光體內(nèi)成像(BLI)技術(shù)，分析動(dòng)物的腫瘤生長(zhǎng)。注射后4 d，即產(chǎn)生肝轉(zhuǎn)移。該模型利用熒光素酶活性，通過非侵入性地成像技術(shù)，提供了關(guān)于腫瘤負(fù)荷和治療有效性的有價(jià)值的信息。因此，所呈現(xiàn)的基于HCT-116Luc(pos)細(xì)胞生長(zhǎng)的肝內(nèi)轉(zhuǎn)移模型適用于不同癌癥治療策略的體內(nèi)測(cè)試。此法相比脾種植，腫瘤轉(zhuǎn)移速度更快，肝轉(zhuǎn)移率更高，適用于腫瘤藥物的篩選。但是手術(shù)難度更大，存在一定風(fēng)險(xiǎn)，死亡率更高，而且不能模擬腫瘤轉(zhuǎn)移的全過程，減少了原發(fā)瘤最初侵襲周圍組織和穿入血管等步驟。

2.4 肝種植模型

肝種植是將人CRC細(xì)胞注射到肝中或者將臨床上腫瘤組織直接植入肝發(fā)展轉(zhuǎn)移性腫瘤。Roque-Lima等[20]將新鮮腫瘤組織磨成碎片，直接植入裸小鼠肝上，成功建立PDTX臨床前模型，該模型準(zhǔn)確地復(fù)制腫瘤內(nèi)異質(zhì)性，有望為CRLM患者測(cè)試各種治療方案，包括疾病進(jìn)展生物標(biāo)志物和治療反應(yīng)性研究。此法腫瘤生長(zhǎng)速度快，轉(zhuǎn)移率較高。操作簡(jiǎn)單，易于實(shí)施，且相對(duì)廉價(jià)，重復(fù)性好。但是僅僅涉及轉(zhuǎn)移的晚期過程，沒有涉及結(jié)腸癌原位生長(zhǎng)的演進(jìn)過程，故與人體內(nèi)結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移觀察模擬度較差，不適合結(jié)腸癌這種通過血道及淋巴道為主要轉(zhuǎn)移途徑的腫瘤模型制作。而且大部分僅在實(shí)驗(yàn)部位成瘤，周圍很少有轉(zhuǎn)移的衛(wèi)星結(jié)節(jié)，不符合臨床上結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移常為多發(fā)轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)。此模型適用在個(gè)體腫瘤基礎(chǔ)上測(cè)試各種化療劑以幫助臨床。

2.5 腹腔擴(kuò)散種植模型

腹腔擴(kuò)散種植是將人CRC細(xì)胞通過微型注射器直接注射入動(dòng)物腹腔內(nèi)，使其播散性生長(zhǎng)，引起腹水(含有大量瘤細(xì)胞)。解剖小鼠后觀察肝轉(zhuǎn)移或其他臟器轉(zhuǎn)移。如果再將這種帶瘤腹水移植至下一代動(dòng)物，便建立腹水瘤模型。Miyoshi等[21]用miR-139-5p轉(zhuǎn)染的3×106個(gè)人Caco-2細(xì)胞腹膜內(nèi)注射到裸小鼠中，建立CRC腹膜轉(zhuǎn)移的小鼠模型，具有較高的肝及腹膜轉(zhuǎn)移率。此法操作簡(jiǎn)單，肝轉(zhuǎn)移率高。轉(zhuǎn)移周期短，短期內(nèi)可復(fù)制大量模型。但是沒有專一性器官轉(zhuǎn)移，僅僅模擬晚期腫瘤患者轉(zhuǎn)移途徑，對(duì)于淋巴轉(zhuǎn)移及血行轉(zhuǎn)移意義不大。該模型常用于CRC術(shù)后腹腔種植播散和癌癥晚期腹腔廣泛轉(zhuǎn)移的病理生理研究。

3 展望

隨著模擬癌癥發(fā)生的免疫缺陷的動(dòng)物模型不斷升級(jí)，最近開發(fā)的CRLM-PDTX模型，為CRC及CRLM的研究增添了新的內(nèi)容。研究人員已經(jīng)開發(fā)出非常準(zhǔn)確的臨床前模型。在更好地了解疾病過程以及未來研究人員可用的改進(jìn)技術(shù)的同時(shí)，我們可以預(yù)期這些CRLM-PDTX模型會(huì)有更多進(jìn)展。這將有助于確保臨床前動(dòng)物研究結(jié)果與其臨床對(duì)人結(jié)果保持一致。CRLM-PDTX模型主要用于生物標(biāo)志物，藥物，腫瘤生物學(xué)等研究。盡管存在可變的基質(zhì)和缺乏合適的免疫系統(tǒng)的缺點(diǎn)，但該模型已經(jīng)證明具有優(yōu)異的預(yù)測(cè)能力，可以被認(rèn)為是外部有效性的量度。這為CRC及CRLM患者帶來了福音。