高桂青， 呂順華， 盧 龍， 李 威， 計 勇， 游濟康

(1.南昌大學資源環(huán)境與化工學院，江西南昌 330031； 2.南昌工程學院土木與建筑工程學院，江西南昌 330099)

重金屬作為不可降解的污染物，對生物的危害日益受到全社會的關(guān)注[1]。鎘(Cd)是植物非必需和毒性最強的重金屬元素之一，鎘脅迫可誘發(fā)PSⅡ捕光復合體改變，從而抑制PSⅡ的捕光色素吸收光能、能量傳遞和能態(tài)激發(fā)效率[2]；另外，Cd脅迫可通過降低植物葉片葉綠素含量[3]、降低PSⅡ的活性、抑制環(huán)式和非環(huán)式光合磷酸化[4]等途徑，抑制植物對光能的吸收與電子傳遞、CO2固定等光合作用各過程。鋅(Zn)參與植物體光合作用、蛋白質(zhì)與核酸代謝，過量的鋅又會對植物細胞結(jié)構(gòu)造成毒害[5]。由于重金屬元素之間的加和、協(xié)同、拮抗等作用使水體重金屬污染的評價和監(jiān)測更加復雜，如何正確評價重金屬元素之間的聯(lián)合作用對水環(huán)境治理具有重要的意義[6]。

黑藻是我國湖泊中廣泛存在的沉水植物，對重金屬具有較強的吸收積累能力[7]。目前，國內(nèi)外重金屬脅迫黑藻的研究主要集中在重金屬生理生化的傷害反應[8-9]、細胞內(nèi)部亞顯微結(jié)構(gòu)變化[10]等方面，而采用葉綠素熒光動力學技術(shù)研究鎘和鋅復合污染對黑藻脅迫機制的影響甚少。葉綠素熒光參數(shù)在探測逆境對光合作用的影響等方面具有快速、簡便、靈敏、可靠等特性，能夠反映光合系統(tǒng)“內(nèi)在性”特點[11]，被看作研究植物光合作用與環(huán)境脅迫程度關(guān)系的有效探針[12]。

本試驗以黑藻為研究對象，分析了Cd、Zn單一及復合脅迫下黑藻葉片PSⅡ的最小熒光(Fo)、最大熒光(Fm)、最大光化學效率(Fv/Fm)、潛在光化學效率(Fv/Fo)、有效量子產(chǎn)量(YⅡ)、調(diào)節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)量(YNPQ)、非調(diào)節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)量(YNO)、光化學熒光淬滅系數(shù)(qP)、非光化學淬滅系數(shù)(qN)等參數(shù)的變化，結(jié)合前人研究探討黑藻受脅迫后的光合生理狀態(tài)，旨在為闡明黑藻光合系統(tǒng)受Cd、Zn脅迫時光系統(tǒng)響應機制提供參考，為修復湖泊生態(tài)系統(tǒng)提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料培養(yǎng)與處理

黑藻取自贛撫平原灌區(qū)六干渠，于2017年6月初選取長勢一致(長度為18 cm左右)的植物作為試驗材料，將試驗植株先種在裝有10%Hoaglands營養(yǎng)的塑料箱中馴化7 d，再選取長勢一致的黑藻20株移栽到圓形白色塑料桶(高度 47.5 cm、直徑22.5 cm)中，桶中底泥厚5 cm，種植后注入自來水，水深40 cm。整個試驗在南昌工程學院生態(tài)園內(nèi)完成，塑料桶置于南昌工程學院生態(tài)園內(nèi)，環(huán)境溫度范圍為25～29 ℃。試驗分為13組，種植20 d后，除對照組外，其余12組均加入不同濃度的CdCl2溶液和ZnSO4溶液進行處理(濃度設(shè)計見表1)。重金屬的取值范圍結(jié)合了預試驗結(jié)果，以對植株有一定脅迫效應為宜。

1.2 測定方法

1.2.1 葉綠素熒光參數(shù)的測定 Cd、Zn單一及復合脅迫黑藻5 d后，采用德國WALZ公司的水下飽和脈沖調(diào)制葉綠素熒光儀(DIVING-PAM)測定葉綠素熒光參數(shù)，測定于太陽光尚未照射到水面之前進行。測量前，葉片經(jīng)暗適應20 min后將葉夾原位夾于黑藻體成熟葉片距離葉尖約2 cm處，開啟檢測光[0.15μmol/(m2·s)]，得到暗適應條件下的最小熒光Fo，再由飽和脈沖光[4 000 μmol/(m2·s)]測定最大熒光Fm。

表1 Cd、Zn單一及其復合脅迫的濃度設(shè)計

1.2.2 快速光響應曲線 測定于09：30—11：30進行，光合有效輻射(PAR)梯度分別為0、93、249、372、490、555、799、999、1 222 μmol/(m2·s)，每個強度的光化光照射10 s，測定最大光化學效率(Fv/Fm)、潛在光化學效率(Fv/Fo)、有效量子產(chǎn)量(YⅡ)、調(diào)節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)額(YNPQ)、非調(diào)節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)額(YNO)、光化學熒光淬滅系數(shù)(qP)、非光化學淬滅系數(shù)(qN)、相對電子傳遞速率(ETR)等參數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)結(jié)果為“平均值±標準差”，使用Excel 2016進行繪圖。用SPSS 19.0對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，并采用SNK進行多重比較分析，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cd、Zn單一及復合脅迫對黑藻Fo、Fm、Fv/Fm與Fv/Fo的影響

由圖1可以看出，充分暗適應下各處理的Fo、Fm、Fv/Fm均隨著各重金屬處理組濃度的增大而降低。這表明隨著Cd、Zn處理組濃度的增加，黑藻的PSⅡ反應中心受到的損害程度增大。

單一Zn脅迫下，F(xiàn)o和Fm下降幅度最小。而單一Cd脅迫，低濃度(≤2 mg/L)Fo和Fm降低幅度小于相同處理組復合脅迫(Cd+Zn)下的值；而在Cd2+較高濃度(>2 mg/L)脅迫下，單一Cd脅迫下，F(xiàn)o、Fm與Cd+Zn復合脅迫下的值較接近。這說明低濃度的Cd+Zn復合表現(xiàn)為協(xié)同作用。

與對照組相比，除單一Zn 3 mg/L脅迫下Fv/Fm略有上升外，其他處理均隨著處理組濃度的增大而降低。而低濃度(Cd2+≤2 mg/L、Zn2+≤5 mg/L)時，在相同處理組下，單一Zn脅迫影響最小，Cd次之，復合脅迫降低最大。而在較高濃度(Cd2+>2 mg/L、Zn2+>5 mg/L)下，單一Cd影響最大，單一Zn脅迫影響最小，復合脅迫次之。這表明重金屬對黑藻的損害程度表現(xiàn)為：Zn脅迫

Fv/Fo與Fv/Fm呈現(xiàn)相同的趨勢，F(xiàn)v/Fo反映了系統(tǒng) PSⅡ 潛在活性，除了3 mg/L Zn脅迫Fv/Fo略有升高，其余均隨著處理組濃度的增大，PSⅡ潛在光化學效率均呈現(xiàn)不同程度的降低。表明低濃度(3 mg/L)的Zn處理能提高黑藻PSⅡ潛在活性。

2.2 Cd、Zn單一及復合脅迫對黑藻YⅡ、YNPQ、YNO的光響應

由圖2可知，隨著處理組濃度的增大，無論何種脅迫光系統(tǒng)Ⅱ的有效量子產(chǎn)量YⅡ基本顯著減小，但低濃度(≤3 mg/L)Zn單一脅迫時YⅡ略有增加。相同處理組下，復合脅迫使得YⅡ降低幅度最大，達86.99%，單一Zn脅迫降幅最小，單一Cd脅迫降低幅度次之。這表明重金屬離子使PSⅡ反應中心受損，抑制光合作用的原初反應，阻礙光合電子的傳遞過程，金屬離子對有效量子產(chǎn)量YⅡ的損害程度表現(xiàn)為：Cd+Zn 復合脅迫>Cd脅迫>Zn脅迫。

圖2顯示，與CK相比，濃度小于 4 mg/L 的Cd單一脅迫下的YNPQ均顯著增加(P<0.05)，最高增加了27.94%，出現(xiàn)在Cd濃度為0.5 mg/L處；而當Cd濃度在7 mg/L時，YNPQ卻降低了83.82%，可能是較高濃度致死或破壞了植物調(diào)節(jié)性耗散機制。單一Zn脅迫中，低濃度(≤5 mg/L)降低了YNPQ，而高濃度增加了YNPQ；復合脅迫下，低濃度(Cd2+≤2mg/L、Zn2+≤5 mg/L)增加了YNPQ，而較高濃度(Cd2+>2 mg/L、Zn2+>5 mg/L)則降低了YNPQ。

由圖2可知，YNO均隨處理組濃度增加而增加。其中，Zn單一脅迫增幅最小，單一Cd脅迫增幅最大，而復合脅迫居中。說明Cd、Zn單一及復合脅迫均對PSⅡ造成一定程度的傷害，導致葉片吸收的部分光量子以非調(diào)節(jié)性能量耗散，其耗散程度表現(xiàn)為：Cd脅迫>Cd+Zn復合脅迫>Zn脅迫。

2.3 Cd、Zn單一及復合脅迫對黑藻qP、qN與電子傳遞速率(ETR)的光響應

qP是PSⅡ天線色素吸收的光能用于光化學電子傳遞的份額。由圖3可知，濃度小于 5 mg/L 的Zn脅迫下qP無明顯變化，較高濃度(Zn2+≥5 mg/L)明顯降低。隨著單一Cd和復合脅迫濃度升高，qP都一直降低，說明PSⅡ中開放的反應中心比例和參與CO2固定的電子減少。

qN反映PSⅡ反應中心對天然色素吸收光能后以熱能形式耗散掉的光能部分，其值表示光合機構(gòu)的損傷程度。由圖3可知，隨濃度增加，Cd單一脅迫的qN呈先增后降趨勢，Zn單一脅迫是先降后增趨勢，而復合脅迫則是一直處于降低趨勢，很有可能是復合脅迫造成某些機制不可逆轉(zhuǎn)的傷害。

由圖4可知，Cd、Zn單一及復合脅迫下，電子傳遞速率ETR隨著光合輻射強度PAR的增加均呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢，最大值基本出現(xiàn)在PAR為249 μmol/(m2·s)處。同種處理下，隨著處理組濃度的增加，ETR最大值明顯降低；且相同PAR下，隨著處理濃度的增加，ETR逐漸降低，表明隨著處理濃度的增加，黑藻的PSⅡ光化學反應受到了抑制。

3 結(jié)果與分析

無論單一脅迫還是復合脅迫，除濃度≤3 mg/L的ZnFo、Fm、Fv/Fm、Fv/Fo脅迫略有升高外(圖1)，其余總體趨勢都是降低的，黑藻葉片PSⅡ反應中心發(fā)生了光抑制。Fo降低可能是由Cd、Zn脅迫使得PSⅡ反應中心部分關(guān)閉或者失活，即原初電子受體QA全部氧化時的熒光水平降低引起的；也可能是PSⅡ天線色素的熱耗散導致Fo的降低。因沉水植物的生活特性，大量重金屬加入水體后，重金屬的毒性直接作用于植物葉片和莖，植物葉片葉綠體類囊體膜上的蛋白復合體部分失活造成了電子傳遞和光合磷酸化受阻致使Fm降低。重金屬處理后PSⅡ反應中心出現(xiàn)光抑制的現(xiàn)象，PSⅡ電子傳遞受阻，因此在受到脅迫后Fv/Fm和Fv/Fo明顯降低(圖1)。

單一Zn脅迫下，黑藻Fo、Fm、Fv/Fm、Fv/Fo的降幅均小于單一Cd及Cd+Zn復合脅迫。表明Zn對黑藻的毒害作用小于Cd+Zn復合，可能因為Zn是植物必需元素，低濃度的Zn能促進葉片光和色素的形成，高濃度則是抑制；Cd能導致氣孔關(guān)閉，擾亂植物水分狀況，降低葉綠素含量和葉綠體數(shù)量，減少營養(yǎng)元素吸收，削弱光合作用，并可誘導產(chǎn)生金屬螯合肽和結(jié)合蛋白等解毒物質(zhì)，所以才出現(xiàn)Zn毒性

低濃度的Cd、Zn復合對Fv/Fm、Fv/Fo和YNPQ表現(xiàn)為協(xié)同作用，原因可能是：(1)低濃度的Zn隔斷Cd對硫蛋白生物合成過程的誘導表達信息的傳導途徑[8]，增強了Cd的毒害作用；(2)Zn刺激根部產(chǎn)生更多的轉(zhuǎn)運載體[13]，促進了與Zn相似性質(zhì)Cd的吸收和轉(zhuǎn)運，降低了植物對Cd的控制力。較高濃度表現(xiàn)為拮抗作用，原因可能是：(1)Zn和Cd具有相同的價態(tài)(2+)，近似相同的離子半徑，相似的化學性質(zhì)，可以相互取代，發(fā)生競爭；(2)Cd進入細胞之后，競爭Zn酶中Zn的結(jié)合位點，進而取代鋅，使鋅酶活性降低，甚至完全喪失[8]。

PSⅡ反應中心吸收的光量子主要通過3個途徑進行轉(zhuǎn)化與耗散，即YⅡ、YNPQ和YNO，所有占量子產(chǎn)量比例總和始終接近于1，即YⅡ+YNPQ+YNO=1。已有研究表明，Cd、Zn使植物超微結(jié)構(gòu)葉綠體膨脹、葉綠體膜斷裂；線粒體脊突膨脹和部分溶解、部分類囊體溶解和散到細胞質(zhì)中，造成光能的吸收、能量的轉(zhuǎn)換及光合電子傳遞受阻，從而降低光化學能量途徑轉(zhuǎn)化能的比例[14]。在一定濃度范圍內(nèi)，黑藻有能力通過自身的調(diào)節(jié)機制耗散掉過剩的光能而使PSⅡ反應中心受傷害程度降低，實現(xiàn)自我保護，但超過一定濃度范圍后，黑藻的自我調(diào)節(jié)機制無法承受，致使PSⅡ反應中心受到不可逆轉(zhuǎn)的傷害。

qP反映了PSⅡ天線色素吸收的光能用于光化學電子傳遞的比例，由圖3可知，較高濃度(Zn2+>5 mg/L、Cd2+>2 mg/L)Cd、Zn單一及復合脅迫可以明顯抑制黑藻葉片PSⅡ反應中心的開放比例和參與光化學反應電子傳遞的能量，致使植物光合活性降低。

qN對葉綠體能量狀態(tài)的改變是非常敏感的，本研究中Zn單一脅迫下qN先降低后升高，說明一定濃度范圍(5～10 mg/L)的Zn會刺激黑藻使其光保護能力增強；Cd單一脅迫下qN先升高而降低，說明低濃度(≤2 mg/L)Cd會刺激黑藻的光保護能力增強，但超過一定范圍(≥7 mg/L)，它的光保護機制會受到不可逆轉(zhuǎn)的損害；Cd+Zn復合脅迫下，qN均是一直降低，說明復合脅迫對黑藻光系統(tǒng)保護機損害強于Cd、Zn單一脅迫(圖3)。

本研究中3種脅迫下，在PAR為249 μmol/(m2·s)時，黑藻葉片ETR達到最大飽和，同時隨PAR增強呈現(xiàn)平緩下降的趨勢，黑藻對光的響應能力隨光強增加而減弱(圖4)。這意味著PSⅡ反應中心部分關(guān)閉或失活，過剩的能量以非光化學淬滅的形式耗散掉，一種形式是用于自身光合作用，另一種是增加熱耗散來避免強光對光合系統(tǒng)的傷害[15]。

4 結(jié)論

Cd、Zn單一和復合脅迫均使黑藻受到不同程度的毒害，其中單一Cd及Cd+Zn復合毒害程度嚴重。Cd污染嚴重水域通過測定熒光參數(shù)來指示污染程度。

低濃度(≤3 mg/L)Zn2+下，黑藻葉片F(xiàn)m、Fv/Fm、YⅡ等略有增加，可以適當施加一定Zn促進植物光合。

受到不同濃度重金屬毒害時，黑藻通過調(diào)節(jié)PSⅡ反應中心開放程度與活性，實現(xiàn)光保護能力，對Zn脅迫表現(xiàn)出較強的耐性，Cd次之，Cd+Zn復合最小。高濃度重金屬脅迫導致PSⅡ反應中心關(guān)閉或不可逆失活，表現(xiàn)出光抑制。