禹海鑫， 蔡 波， 孫民琴， 郭驍駒， 楊曉軍， 安榆林

(1.南通出入境檢驗檢疫局，江蘇南通 226004； 2.海南出入境檢驗檢疫局熱帶植物隔離檢疫中心，海南?？?570311；3.江蘇出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心，江蘇南京 210009)

溝脛天牛亞科(Laniinae)隸屬于鞘翅目(Cleoptera)葉甲總科(Chrysomiloidea)天?？?Cerambycidae)，是天?？浦蟹N類最多的一個亞科。其中，長角天牛屬(Acanthocinus)天牛是該亞科內極為重要的一類林木蛀干害蟲，可危害魚鱗松、油松、馬尾松、紅松、山楊、核桃、櫟屬等多種針、闊葉樹種。該屬天牛主要以幼蟲鉆蛀樹木的木質部、韌皮部和邊材組織為害，常使樹勢衰弱，危害嚴重時還會導致樹木整株死亡，給農林業(yè)生產造成極大的經(jīng)濟損失[1]。截至目前，該屬昆蟲在全世界范圍內已被描述的種類約有14種，廣泛分布于歐洲、非洲北部、俄羅斯、日本、朝鮮、中國臺灣等國家和地區(qū)。我國已報道的長角天牛屬昆蟲種類約有5種，包括白帶長角天牛(A.carinulatus)、大灰長角天牛(A.aedilis)、小灰長角天牛(A.griseus)、黑帶長角天牛(A.stillatus)和臺灣長角天牛(A.gundaiensis)[2-3]。其中，白帶長角天牛被2007年公布的《進境植物檢疫性有害生物名錄》列為我國進境植物檢疫性有害生物。

近年來，隨著我國進出口貿易的迅猛發(fā)展，原木、板材及木質包裝的進出口總量也與日俱增，這些貨物中極易攜帶大量天牛、小蠹等有害生物，對我國口岸生物安全造成極大威脅。我國口岸曾多次在進境原木及木質包裝中截獲到長角天牛屬昆蟲。例如，2013年深圳口岸檢疫人員從進境羅馬尼亞云杉原木中截獲了檢疫性害蟲——白帶長角天牛[4]；2016年，深圳蛇口口岸檢疫人員在進境美國長葉松中首次截獲到了結節(jié)長角天牛(A.nodosus)[5]；2016年，江蘇常州口岸檢疫人員在進境美國白松原木中首次截獲到了斜帶長角天牛(A.oblisquus)[6]。

面對如此嚴峻的生物入侵形勢，只有對有害生物進行快速、精確的鑒定才可以采取針對性的措施有效阻止其入侵我國。目前，各口岸主要采用傳統(tǒng)的昆蟲種類鑒定方法，即依據(jù)形態(tài)特征，同時參照昆蟲分類檢索表的方法對長角天牛屬天牛進行分類鑒定。但在口岸檢疫過程中，由于截獲的天牛多以卵、幼蟲、蛹或肢體殘缺成蟲的蟲態(tài)出現(xiàn)，利用形態(tài)學特征進行鑒定相當困難，很多天牛標本就無法鑒定到種[7]。因此，迫切須要探索新的鑒定技術來彌補傳統(tǒng)鑒定方法的不足。截至目前，利用分子生物學手段研究物種鑒定、系統(tǒng)發(fā)育已經(jīng)成為昆蟲學科的研究熱點。其中，由于線粒體細胞色素C氧化酶亞基Ⅰ基因(mtDNACOⅠ)結構相對保守，且種間差異比較大，因此，利用基于COⅠ基因序列片段的DNA條形碼技術進行近緣種間鑒定及系統(tǒng)發(fā)育的研究已經(jīng)得到了更為成熟的應用[8]。Stauffer利用該DNA條形碼技術對歐洲7種齒小蠹進行了快速準確的鑒定[9]。禹海鑫等應用該技術實現(xiàn)了白條天牛屬下13個種類準確高效的鑒定[10]。鄔穎等也通過該技術實現(xiàn)了光肩星天牛幼蟲種類的快速鑒定[11]。鄭絲竹深入研究了天?？苹驐l形碼的構建方法及分子快速鑒定技術，為探索天牛種類的分子鑒定方法提供了極有價值的參考[12]。

白帶長角天牛作為重要的檢疫性有害生物，對其及所在屬內多個種類天牛進行快速鑒定具有重要意義。本研究收集了5種口岸截獲的長角天牛樣本，對其COⅠ片段進行擴增和測序，并與GenBank中下載的9條COⅠ序列進行比對，分析這些序列的堿基多樣性、遺傳距離和系統(tǒng)進化關系，以期獲得1種快速鑒定長角天牛種類的分子方法，為今后農林部門及進出境植物檢疫部門對長角天牛屬昆蟲的快速準確鑒定提供依據(jù)[13]。

1 材料與方法

1.1 試驗樣本

本試驗所用標本由南通出入境檢驗檢疫局有害生物檢疫實驗室提供，包括小灰長角天牛(A.griseus)、大灰長角天牛(A.aedilis)、斜帶長角天牛、A.princeps、白帶長角天牛5種長角天牛，所有天牛標本均由國內天牛專家安榆林研究員鑒定復核。標本來源與采集時間見表1。另外，從GenBank網(wǎng)站獲得小灰長角天牛、大灰長角天牛、A.reticulatus、Acanthocinussp. CA14_3.01 4種長角天牛，及作為外群的棕櫚象甲(Rhynchophoruspalmarum)的共9條COⅠ序列(表2)，用于比對分析。其中，白帶長角天牛是我國進境植物檢疫性昆蟲，其他長角天牛均是其同屬近似種。

表1 供試標本的來源及采集時間

表2 本研究使用的GenBank下載的COⅠ基因序列信息

1.2 樣品組織基因組DNA提取

用GenMagBio動物細胞組織/細胞基因組DNA磁珠提取試劑盒(北京金麥格生物技術有限公司)提取上述各個樣品組織的基因組DNA。提取步驟如下：剪取適當大小的經(jīng)乙醇浸泡的各天牛樣品肌肉組織(應少于30 mg)，用雙蒸水沖洗干凈后，裝入 1.5 mL 離心管中并置于MM400球磨儀(德國retsch公司提供)中振蕩研磨60 s(30次/s)，再將磨碎的組織離心10 min(轉速為12 000 r/min)。離心后加入180 μL裂解緩沖液及20 μL蛋白酶K，漩渦振蕩，重懸已經(jīng)預處理的組織樣品，然后放入55 ℃水浴鍋中溫浴1～3 h，直至組織樣品完全裂解消失。加200 μL無水乙醇、200 μL Binding Buffer、20 μL磁珠，磁珠用于吸附組織中的基因組DNA。加入 500 μL Wash Buffer去除雜質后，再加入20 μL Elution Buffer，靜置10 min后洗脫磁珠，便可獲得樣品組織的基因組DNA溶液[14-15]。

1.3 COⅠ片段擴增與測序

本試驗PCR擴增反應采用巢氏PCR，在ProFlexTMPCR儀(美國ABI公司提供)上進行。反應采用25 μL體系，包括1.0 μL基因組DNA模板、2.0 μL MgCl2(25.0 mmol/L)、2.5 μL 10×buffer(不含Mg2+)、1.0 μL dNTPs(2.5 mmol/L)、0.4 μL rTaqDNA聚合酶(5.0 U/μL，購自TaKaRa公司)，各0.5 μL上、下游引物(10.0 μmol/L，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成)，再加滅菌水補至總體積為25 μL。PCR擴增反應條件如下：94 ℃ 5 min；94 ℃ 40 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，36個循環(huán)；72 ℃ 10 min。反應完畢后將產物送至南京金斯瑞生物科技有限公司進行測序分析[10，12]。巢式PCR第1輪反應引物為F-1、R-1，第2輪PCR引物為F-2、R-2[12]，各引物序列信息如表3所示。本研究采用巢式PCR，既降低了擴增出非目的基因條帶的概率，又增強了該PCR檢測的可信度和靈敏度[12]。

表3 巢式PCR所用引物序列

1.4 序列處理及分析

將各樣品COⅠ序列測序結果導入DNAStar中的SeqMan分析軟件中進行拼接與手工校正[16]。利用美國國立生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information，簡稱NCBI)的Blast工具進行序列相似性搜索，以確定序列的方向和可信度。再將所測序列以及從GenBank下載的8條長角天牛序列一同載入Clustal X 1.83軟件進行比對，輸出格式為FASTA[17]。最后將所有比對結果導入MEGA 5.20軟件中[18]計算各種類間的遺傳距離、轉換和顛換值及其比值(R)、變異位點(variable sites，簡稱V)及保守位點(conserved sites，簡稱C)等數(shù)值[13]，同時，利用鄰接法(neighbor-joining，簡稱NJ)，選取Kimura 2-parameter遺傳距離模型，建立系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結果與分析

2.1 DNA凝膠電泳結果

本試驗對5種長角天牛共7個樣本的基因組DNA進行COⅠ基因片段巢式PCR擴增，由圖1的電泳結果可以看出，7個樣本在525 bp處均有清晰且特異性良好的目的條帶，可滿足后續(xù)基因測序的需要。

2.2 長角天牛COⅠ序列解析

2.2.1COⅠ基因序列組成和變異特征 將測序和下載的各條序列導入MEGA 5.20軟件中，剪切成同等長度片段(434 bp)[19]。結果發(fā)現(xiàn)，保守位點(C)、變異位點(V)、自裔位點(S)和簡約信息(Pi)位點分別有199、235、56、179個。另外，統(tǒng)計所有位點的堿基平均含量發(fā)現(xiàn)，A平均含量為 29.8%，T為34.1%，G為14.4%，C為21.7%[12]。其中，A、T的含量相近，且A+T含量高達63.9%，明顯高于G+C含量(36.1%)，表現(xiàn)出明顯的A+T堿基偏嗜，這也基本符合昆蟲線粒體基因堿基組成的基本規(guī)律[19-20]。

2.2.2 堿基替換規(guī)律分析 用MEGA 5. 20軟件分析序列各位點堿基替換規(guī)律[21]。由表4可以看出，整體位點的轉換主要出現(xiàn)在C與T之間，顛換則主要出現(xiàn)在T與A之間，轉換/顛換比值(R值)為0.83。對密碼子各位點分析發(fā)現(xiàn)，轉換和顛換主要在密碼子第2位點上發(fā)生，且轉換與顛換值相當(R=0.74)。此外，第1、3位點R值分別為0.59、1.29。無論整體或是密碼子各位點，R值均小于2，表明該序列轉換與顛換未達到飽和，在構建系統(tǒng)發(fā)育樹時要考慮轉換與顛換的發(fā)生概率。

表4 核甘酸堿基替換結果

注：Avg表示平均頻率，1st表示第1位點，2nd表示第2位點，3rd表示第3位點，ii表示相同堿基對，si表示轉換堿基對，sv表示顛換堿基對，R表示轉換堿基對/顛換基對。

2.2.3 遺傳距離分析 根據(jù)Kimure 2-parameter模型分析7種15頭長角天牛和1個外種群之間的遺傳距離，將轉換和顛換考慮在內，利用Bootstrap值(1 000次)進行檢驗[21]。由表5可以看出，長角天牛屬內相同物種內的遺傳距離數(shù)值介于0.000～0.016內，平均遺傳距離為0.01，其中小灰長角天牛種內距離最小，為0～0.014；斜帶長角天牛種內距離最大，為0.016；長角天牛屬不同種間的遺傳距離介于0.055～0.629之間，平均遺傳距離為0.350，其中相似種A.princeps與白帶長角天牛之間的遺傳距離最小，為0.055；斜帶長角天牛1與A.reticulatus之間的遺傳距離最大，為0.629?？梢?，同一物種內的遺傳距離較近，基本不受其地理分布的影響；同屬不同種類間的遺傳距離較遠，呈現(xiàn)出較為明顯的遺傳差異性，可考慮將此段序列作為鑒別不同物種的依據(jù)。

表5 基于Kimure 2-parameter模型長角天牛屬的種內、種間遺傳距離

注：1表示小灰長角天牛1；2表示小灰長角天牛2；3表示大灰長角天牛1；4表示斜帶長角天牛1；5表示斜帶長角天牛2；6表示A.princeps；7表示白帶長角天牛；8表示小灰長角天牛5；9表示小灰長角天牛3；10表示小灰長角天牛4；11表示大灰長角天牛2；12表示大灰長角天牛3；13表示大灰長角天牛4；14表示A.reticulatus；15表示Acanthocinussp. CA14_3.01；16表示棕櫚象甲。

2.2.4 系統(tǒng)發(fā)育樹的建立 采用MEGA 5.20分析軟件，選擇棕櫚象甲為外群，以長角天牛屬7種昆蟲共15條COⅠ序列為靶標，使用鄰接法建立系統(tǒng)發(fā)育樹。從圖2可以看出，從整體上看，長角天牛屬各近似種聚為一大支，而外群棕櫚象甲單獨成1支，此聚類結果與形態(tài)學鑒定結果一致。在長角天牛屬所聚的一大支中，7種長角天牛又分聚為2支，其中小灰長角天牛、大灰長角天牛、A.reticulatus和Acanthocinussp. CA14_3.01聚為1支，說明這4種長角天牛的遺傳進化關系較為接近，互為近緣種；同時，又與聚為另1支的斜帶長角天牛、A.princeps及白帶長角天牛遺傳進化關系較遠，也說明彼此之間的親緣關系較遠，2支互為姊妹群。從局部來看，同一種類不同個體之間各聚為一小支，且置信度很高，這樣就很容易和其他種類的長角天牛區(qū)分開來。上述結果表明，長角天牛屬不同種類之間的系統(tǒng)進化差異明顯，因此可將此DNA條形碼用作長角天牛屬不同種類分子鑒定的依據(jù)。

3 結論與討論

一般而言，使用DNA條形碼對物種進行快速準確的鑒定須要滿足2個必要條件：首先每個物種都要具有獨特且又相對保守的DNA條形碼序列；其次是該條形碼序列種間差異必須遠大于其種內的差異[8]。本研究所采用的線粒體COⅠ基因序列就滿足上述條件。首先，地球上幾乎所有真核生物都含有線粒體COⅠ基因，且該基因含有很多相對保守的遺傳信息位點。其次，對7種15頭長角天牛基于線粒體COⅠ基因的種內及種間遺傳距離進行計算，發(fā)現(xiàn)種內遺傳距離為0.000～0.016，平均為0.01；種間遺傳距離介于0.055～0.629之間，平均為0.35；種間遺傳距離是種內遺傳距離的35倍，完全符合種間差異應大于種內差異10倍以上的物種鑒定原則。事實上，線粒體COⅠ基因常被作為DNA條形碼，用于昆蟲種類鑒定及系統(tǒng)發(fā)育學的研究，類似的基因還有Cytb、18S、28S、5.8S、ITS、rbcL、matK等[22]。王穎等利用COⅠ基因作為DNA條形碼，實現(xiàn)了對山東口岸進境原木截獲蚊蟲種類的快速鑒定[23]。董昆應用COⅠ基因分析了蘋果蠹蛾不同地理種群間的遺傳差異，并實現(xiàn)了對其幼蟲的快速鑒定[24]。趙文靜等利用COⅠ及ITS序列作DNA條形碼深入研究了環(huán)帶庫蚊的分類地位和雜鱗庫蚊復組內各親緣種的系統(tǒng)發(fā)育關系[25]。

目前我國口岸昆蟲種類鑒定主要依賴于完整成蟲的形態(tài)特征，而實際上口岸截獲到的多是昆蟲的卵、幼蟲、蛹及肢體殘破的成蟲。卵、幼蟲和蛹須要花費較長時間培養(yǎng)至成蟲階段才能進行種類鑒定，而肢體殘破的成蟲則失去了形態(tài)學鑒定的價值。用DNA條形碼技術就能很容易突破上述形態(tài)學鑒定方法遇到的瓶頸[26]。但是目前該技術[27]在長角天牛屬種類鑒定中的應用還鮮有報道。本研究通過對5種長角天牛COⅠ基因所測序列與GenBank部分長角天牛COⅠ序列進行比對分析，發(fā)現(xiàn)該段序列既能高效區(qū)分部分長角天牛種類，又能提供豐富的物種親緣關系信息。此外，本研究還首次對斜帶長角天牛、白帶長角天牛和A.princeps的COⅠ基因序列進行測序，不僅補充了長角天牛屬COⅠ基因數(shù)據(jù)庫，還將為基于COⅠ基因快速鑒定其他種類天牛的研究提供有益參考。值得注意的是，由于本研究未收集到全部的長角天牛屬種類，僅能針對部分種類進行分析，因此本研究采用的DNA條形碼尚不能確定可以完全鑒別所有的長角天牛種類，只能說明DNA條形碼技術[27]在長角天牛屬昆蟲分子鑒定上具有可行性。后續(xù)研究應圍繞收集長角天牛屬其他種類，完善COⅠ基因數(shù)據(jù)庫，結合多個基因共同分析等方向努力，以期獲得更高效的DNA條形碼，進而得到更精確的系統(tǒng)發(fā)育進化樹。